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培养基的灵敏度测试培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。
方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。
取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。
样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。
否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。
2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。
每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。
应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。
原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。
按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。
如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。
建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。
微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。
用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。
培养基灵敏度验证方案1．验证目的：通过对培养基的灵敏度验证来增加无菌检查的可信度。
2．原理：不同种培养基内加入符合其生长条件的已知菌株做生长实验，根据加入定量细菌的生长情况来评价该培养基灵敏度。
菌量越少说明培养基灵敏度越高。
3．仪器设备：无菌室(操作间净化级别小于10000级，局部净化小于100级，室温18-26︒C，相对湿度40-60%)、恒温培养箱（30-35︒C）、恒温培养箱（20-25︒C）、高压灭菌器、干烤箱（250︒C）、相差显微镜等。
培养基：需气菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐培养基，中国药品检定所购买，生产批号：980115）；真菌培养基（改良马丁培养基，中国药品检定所购买，生产批号：980115）。
测试菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌。
4．验证实施4．1培养基配制：分别称取硫乙醇酸盐培养基7.5克，改良马丁培养基7.0克，分别加250ml蒸馏水,热溶解，分装10ml/管，高压灭菌116︒C 20 分钟。
4．2测试菌的培养：在无菌操净台内，分别取金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、生孢梭菌菌液少量，接种在硫乙醇酸盐流体培养基（10ml/管）中，在30-35︒C培养24小时；取白色念珠菌菌液少量，接种在改良马丁培养基中在20-25︒C培养24小时。
此时的培养液称为原菌液。
4．3测试菌计数：采用原菌培养液直接稀释、计数板计数法：1．分别取已经培养好的原菌液1 ml，用生理盐水稀释10倍。
2．用一片干净的盖玻片盖在一干净计数玻片上。
3．吸少量含菌培养液接触盖玻片的边缘。
4．在相差显微镜400倍下观察，并且按一小方块所见的每一个细菌大约相当2 107细菌/ml 计算细菌浓度。
4．4原菌液稀释：将上述原菌液根据细菌计数结果，分别用生理盐水稀释至 10~100个菌/ml。
4．5灵敏度实验：分别将（4）稀释菌液1ml接种到（1）配制的10 ml/管培养基中，每种菌液接种3管培养基，以未接种的培养基为阴性对照，按规定的条件培养5天并逐日记录。
SOP-QC-03000培养基灵敏度检查标准操作规程471 GMP标准文件分发号: 流水号:471 编码: SOP-QC-03000 共2页第1页题目: 培养基灵敏度检查标准操作规程制定人 QA审核批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量技术部颁发日期生效日期质量技术部分发部门目的:建立培养基灵敏度检查标准操作规程，保证无菌检查结果的准确性、可靠性。
范围:适用于培养基灵敏度检查。
职责:QC无菌检验员。
规程:1 实验设备及用具:高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、注射器、针头、注射器盒、试管、试管架、搪瓷托盘、时钟、75,酒精棉球、无菌服。
2 培养基:需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)、真菌培养基，培养基的配制详见《培养基配制标准操作规程》。
3 测试用菌种3.1 藤黄微球菌[CMCC (B) 28 001]3.2 生孢梭菌[CMCC (B) 64 941]3.3 白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]4 操作4.1 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌不含琼脂的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸至无菌离心管，离心，弃去上清液,菌体用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。
分别取上述菌悬液,用0.9,无菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。
4.2 取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10—100个菌并计数。
4.3 将藤黄微球菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别GMP标准文件接种至每管装量为12ml需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。
培养基的灵敏度检查操作SOP1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。
2 适用范围本标准适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。
3 责任者 QC检验人员。
4 内容试验设备及用具：无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。
使用的菌株：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003,铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，·生孢梭菌CMCC(B)64941，白色念珠菌CMCC(F)98001，黑曲霉CMCC(F)98003，培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。
检测频率每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。
操作方法对照标准培养基用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。
试验培养基将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。
液体类的培养基直接使用。
'菌悬液的制备购买对应的商业化定量菌株。
使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。
目前有进口的bioball和国产的microball等。
使用方便，定量精确。
培养基的生长促进实验琼脂类培养基的生长促进试验每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。
试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。
（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1）液体类培养基的生长促进实验每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。
目的：建立培养基灵敏度检验标准操作规程，保证检查结果的准确性和可靠性。
应用范围：适用于培养基灵敏度的检查。
责任人：QC无菌检验员。
编订依据：《中国药典》2010年版二部、《中国药品检验标准操作规范》2010年版。
内容：
1 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的灵敏度检查及适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
2 菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44 102]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001]。
培养基适用性检查规程目的：建立一个培养基的灵敏度检查，确保培养基性能可靠。
范围：适用于微生物检验。
责任：微生物检验员。
依据：《中国药典》2010年版一部附录、2010版GMP实施指南规程：1.不应在同一无菌室内同时操作2个或2个以上菌株。
2.菌株传代次数不得超过5代（以菌种保存中心获及的冷冻干燥菌种为第0代）。
一、计数培养基的适用性检查1、菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在两小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
2、适用性检查取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml（50-100cfu）,分别注入无菌平皿中，立刻注入待检查营养琼脂培养基和对照营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（其中2个注入待检查营养琼脂培养基，另两个注入对照营养琼脂培养基）。
30-35℃培养48h，计数。
取白色念珠菌1ml（50-100cfu）,注入无菌平皿中，立刻注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基和对照玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备4个平皿（其中2个注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基，另两个注入对照玫瑰红钠琼脂培养基）。
23-28℃培养72h，计数。
3、结果判断若被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落数的70%，且菌落大小、形态两者一致，判断该培养基的适用性检查符合规定。
二、控制菌检查用培养基的适用性检查1.菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu、每1ml50-100cfu和每1ml大于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
培养基灵敏度检查SOP1．目的规范无菌检查用培养基灵敏度检查，确保无菌试验用培养基的灵敏度，防止无菌试验结果出现假阳性现象。
2．范围本标准规程适用于本公司无菌检查用培养基的灵敏度检查，每批无菌试验用干粉培养基均做灵敏度检查。
3．定义3.1.菌种：检查所用菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物学特性。
3.2.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26003〕：用于无菌检查培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；3.3.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10104〕：用于无菌检查培养基灵敏度检查；3.4.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕：用于无菌检查培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；3.5.白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98001〕：用于无菌检查培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；3.6.生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64941：用于无菌检查培养基灵敏度检查；3.7.黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98003〕：用于无菌实验培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；4．职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。
5．引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6．材料6.1.房屋、设备、试验用具6.1.1.房屋：阳性实验室。
6.1.2.设备：100级洁净工作台，30～35℃培养箱，20～25℃培养箱，灭菌器。
6.1.3.试验用具：隔离服、洁净工作服、工作鞋、口罩、帽子、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管、毛巾、吸耳球、记号笔、中试管架、酒精灯、镊子、酒精棉、托盘、电子天平、药勺、量筒、6.2.培养基：营养琼脂斜面培养基（中管）、硫乙醇酸盐流体培养基（中管）、改良马丁琼脂斜面培养基（中管）。
1. 目的：通过培养基适用性检查，确保购买的培养基符合实验要求。
2. 范围：本规程适用于技术质量部实验员对培养基适用性的检查。
3. 职责：质量部实验员负责执行此规程。
4. 内容：4.1 检验依据：《中华人民共和国药典》2015版4.2 试验用具：烧杯、三角瓶、酒精灯、接种环、平皿、试管、吸管、移液枪、滴管、电子天平、电热恒温培养箱、生化培养箱或恒温恒湿培养箱、单人净化工作台、高压蒸汽灭菌器、微生物限度仪、漩涡混合器、试验菌种、检查用培养基等。
4.3 无菌培养基适用性检查：本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
4.3.1 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基（培养基的配制按《培养基配制操作规程》配制）。
4.3.2 稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
a) 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
b) pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
c) 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
4.3.3 无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。
4.3.4 灵敏度检查4.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔CMCC（B）10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕4.3.4.2 菌液制备a) 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；b) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48小时，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
目的：建立一个无菌检查用培养基适用性检查的标准操作规程。
范围：化验室菌检岗位操作者。
责任：化验室检验员。
程序：1. 概述：培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节，无菌检查用培养基的无菌性检查和灵敏度检查无菌检查结果判断的重要影响因素。
2. 培养基适用性检查的范围：2010年版《中国药典》规定微生物检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
3. 试验用菌株金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］生孢梭菌［CMCC（B）64941］白色念珠菌［CMCC(F)98001］黑曲霉［CMCC(F)98003］4. 试验用培养基4.1 菌液制备用培养基营养肉汤培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂培养基4.2 适用性检查培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB）5. 试验用稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液含0.05%（ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液6. 试验用仪器设备6.1 恒温培养箱（30～35℃）、霉菌培养箱（23～28℃）、脉动真空蒸汽灭菌器、生物安全柜、电热恒温鼓风干燥箱、微型智能集菌仪。
6.2 锥形瓶、培养皿（90mm）、量筒、试管及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）6.3 接种环、酒精灯、酒精棉球、打火机、记号笔。
7 操作步骤：7.1培养基无菌性检查：每批培养基随机取不小于5瓶(支)，培养14天。
7.2培养基灵敏度检查：7.2.1菌液的制备7.2.1.1 接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24h，取上述培养物1ml，用 0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液，备用。
7.2.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，于23～28℃培养24～48h，取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液备用。
医疗器械无菌检查SOP1、目的：制定本司所有产品无菌检查操作规程。
2、范围：适用于本公司产品无菌检查。
3、职责：检验员负责实施，质量部经理监督实施。
4、内容4.1 操作要求4.1.1 与供试液接触的所有器具应采用可靠地灭菌方法，置压力蒸汽锅内121℃， 30min 。
或置电热干燥箱内160℃，2h。
4.1.2 超净工作台应符合局部洁净度100单向流空气区域要求。
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取培养皿，无菌操作注入融化的培养基约20ml，在35℃培养48h证明无菌后取3支培养皿在超净工作台平均位置上打开上盖，暴漏30min后置35℃培养48h后取出检查，3支培养皿上生长的菌落数平均不应超过一个。
4.1.3 无菌检查过程中应检查空气中的菌落数，方法同 4.1.2.在试验开时打开培养皿盖，至试验结束后盖好置35℃，培养培养48h，结果应符合4.1.2要求。
4.2 培养基配制4.2.1 硫乙醇酸盐流体培养基：称取硫乙醇酸盐流体培养基29.3g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热至沸腾完全溶解，分装试管.121℃高压蒸汽灭菌15min。
4.2.2 改良马丁培养基:称取改良马丁培养基28.5g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，115℃，蒸汽灭菌30min。
4.2.3 营养琼脂培养基：称取营养琼脂培养基32.0g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角锥形瓶，121℃，高压灭菌15min。
4.2.4 营养肉汤培养基：称取营养肉汤培养基18.0g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热至蒸汽灭菌15min，冷却至常温，备用。
4.3 培养基适用性检查4.3.1 无菌性检查：每批培养基随即抽取不少于10支。
5支置35℃，另5支置25℃培养14天，均应无菌生长。
4.3.2 灵敏度检查：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5 代，（从菌种冷冻中心获取得的冷冻干燥菌种为第0代），试验菌应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证菌株的生物学特性。
培养基适用性检查标准操作规程1. 目的1.目的建立培养基配制适用性检查的标准操作规程，规范实验人员的操作。
2. 范围适用于微生物检验人员对培养基的规范管理。
3. 依据药品生产质量管理规范（2010年版修订）、《中华人民共和国药典》第四部4. 职责4.1 微生物检验员：负责实验室所需求的培养基管理工作，使日常检验正常进行。
4.2 微生物检验主管：负责对日常配制培养基的规范操作进行监督。
5. 程序5.1 培养基的贮藏5.1.1 未开封的胶水培养基贮存于阴谅室，使用培养基处于低温、干燥、和避光条件下。
开封的胶水培养基应盖紧，贮存于阴谅库。
5.1.2 灭菌好的培养基应进行预培养72h检查无菌后，置4～8℃冷藏保存，培养基储存期为7天。
5.2 培养基的配制应填写培养基配制及使用记录。
供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
5.3 培养基的质量控制5.3.1 计数培养基适用性检查菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代( 从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
菌液制备按表 1规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液;取黑曲霉的新鲜培养物加入适量含0.05% ( ml/mI)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05% ( mI/mI )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%( mI/ml )聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05% ( mI/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用;若保存在2～ 8C,可在24小时内使用。
目的：建立培养基灵敏度检验标准操作规程，保证检查结果的准确性和可靠性。
应用范围：适用于培养基灵敏度的检查。
责任人：QC无菌检验员。
编订依据：《中国药典》2010年版二部、《中国药品检验标准操作规范》2010年版。
内容：1 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的灵敏度检查及适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
2 菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44 102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98 003]3 菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物到硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养24～48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml含孢子数100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在 2小时内使用；若保存在2～8℃，可在 24小时内使用。
起草人Prepared by:起草日期Date: _____________________ QC审核人Reviewed by:审核日期Date: _____________________ QC审核人Reviewed by:审核日期Date: QA批准人Approved by:批准日期Date:质量部QD目的Purpose为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。
范围Scope本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。
职责Responsibility分析员：严格按照本操作规程执行。
及时完成各类相关记录。
在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。
主管：监督本操作规程的执行。
对检验员进行必要的培训。
指导任何可能的OOS和偏差调查。
内容procedure1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。
2试验用菌种及培养基2.1菌种:2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。
2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633]2.1.3大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739]2.1.4金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538]2.1.5白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231]2.1.6黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404]2.1.7伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028]2.1.8铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027]2.2培养基2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。
2.2.2大豆酪蛋白消化肉汤Soybean-Casein Digest Broth2.2.3大豆酪蛋白消化琼脂Soybean-Casein Digest Agar2.2.4沙氏葡萄糖琼脂Sabouraud Dextrose Agar2.2.5肠道菌增菌肉汤Enterobacteria Enrichment Broth Mossel2.2.6紫红色胆汁葡萄糖琼脂Violet Red Bile Glucose Agar2.2.7麦康凯肉汤MacConkey Broth2.2.8麦康凯琼脂MacConkey Agar2.2.9RV沙门氏菌富集肉汤Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth2.2.10木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂Xylose Lysine Deoxycholate Agar2.2.11甘露醇氯化钠琼脂培养基Mannitol Salt Agar2.3微生物计数培养基的适用性检查2.3.1微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
1. 目的为保证无菌试验更加准确可靠。
2. 范围车间环境检测和血清原料、成品无菌检测用培养基的灵敏度测定。
3.职责3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。
3.2. 质量管理部检验人员：负责本规程的操作。
3.3. 总经理：负责本规程的审批。
4. 定义无5. 引用标准《中华人民共和国药典》四部 2015版。
6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1. 标准阳性菌种：购置药品检定所菌种保藏中心冷冻干燥菌株，传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为0代）包括：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]、枯草芽胞杆菌[CMCC（B）63 501]、生胞梭菌[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98 003]。
6.1.2 硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基。
6.1.3 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9﹪氯化钠溶液6.2 仪器设备20～25℃培养箱，30～35℃培养箱6.3. 器械、用具6.3.1. 灭菌2ml移液管6.3.2 灭菌中试管7. 流程图无8. 内容8.1. 菌液制备：8.1.1 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中。
8.1.2 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；8.1.3 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48小时8.1.4 上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9﹪氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。
8.1.5 接种黑曲霉菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上20～25℃培养5～7天。
加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
培养基的灵敏度检查操作SOP
1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。
2 适用范围本标准适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。
3 责任者QC检验人员。
4 内容
4.1 试验设备及用具：
无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。
4.2 使用的菌株：
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003,
铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，
生孢梭菌CMCC(B)64941，
白色念珠菌CMCC(F)98001，
黑曲霉CMCC(F)98003，
培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。
4.3 检测频率
每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。
4.4 操作方法
4.4.1 对照标准培养基
用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。
4.4.2 试验培养基
将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。
液体类的培养基直接使用。
4.4.3 菌悬液的制备
购买对应的商业化定量菌株。
使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。
目前有进口的bioball和国产的microball等。
使用方便，定量精确。
4.4.4 培养基的生长促进实验
4.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进试验
每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。
试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。
（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1）
4.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验
每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。
4.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验
4.4.
5.1 液体培养基的生长促进特性试验
接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。
在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的最短期限。
与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。
4.4.
5.2 固体培养基的生长促进特性试验
采用表面涂布法，在每一块平皿上接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）适宜微生物。
在特定温度下培养，培养时间不长于试验中规定的最短期限。
接种微生物的生长与对照标准的培养基获得的微生物生长相当。
4.4.
5.3 液体或固体培养基的抑制特性试验
用适当培养基接种至少100 CFU适宜微生物。
在特定温度下培养，培养时间至少为试验中规定的最长期限。
无受试微生物生长。
