培养基的灵敏度检查操作规程

培养基的灵敏度测试培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。

方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。

取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。

样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。

否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。

2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。

每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。

应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。

原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。

按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。

如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。

建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。

微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。

用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。

1. 目的建立支原体灵敏度检测操作规程，保证检测结果的真实可靠。

2. 范围用于自制支原体培养基和外购支原体培养基灵敏度的检测。

3. 职责3.1.质量管理部：负责本规程的起草。

3.2. 质量管理部检验人员：负责本规程的操作。

3.3. 总经理：负责本规程的审批。

4. 定义5. 引用标准无。

6. 材料6.1. 所需材料6.1.1. 菌种：肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714）购自北京中原公司。

6.1.2. 培养基:6.1.2.1 支原肉汤培养基猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g牛肉浸出液（1：2） 500ml 葡萄糖 5.0g酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g6.1.2.2 支原体半流体培养基按6.1.2.1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。

6.1.2.3 支原体琼脂培养基按6.1.2.1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。

6.2. 仪器设备无6.3. 器械、用具6.3.1 灭菌玻璃移液管7. 流程图无8. 内容8.1.变色单位试验法：将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后。

将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种到支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内，每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。

8.2. 结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。

8.3. 液体培养基的灵敏度肺炎支原体（ATCC 15531）应达到10-3，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。

9. 注意事项无10. 附录及派生记录无11. 相关文件无12. 修订记录。

SOP-QC-03000培养基灵敏度检查标准操作规程471 GMP标准文件分发号: 流水号:471 编码: SOP-QC-03000 共2页第1页题目: 培养基灵敏度检查标准操作规程制定人 QA审核批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量技术部颁发日期生效日期质量技术部分发部门目的:建立培养基灵敏度检查标准操作规程，保证无菌检查结果的准确性、可靠性。

范围:适用于培养基灵敏度检查。

职责:QC无菌检验员。

规程:1 实验设备及用具:高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、注射器、针头、注射器盒、试管、试管架、搪瓷托盘、时钟、75,酒精棉球、无菌服。

2 培养基:需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)、真菌培养基，培养基的配制详见《培养基配制标准操作规程》。

3 测试用菌种3.1 藤黄微球菌[CMCC (B) 28 001]3.2 生孢梭菌[CMCC (B) 64 941]3.3 白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]4 操作4.1 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌不含琼脂的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸至无菌离心管，离心，弃去上清液,菌体用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。

分别取上述菌悬液,用0.9,无菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。

4.2 取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10—100个菌并计数。

4.3 将藤黄微球菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别GMP标准文件接种至每管装量为12ml需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。

起草人Prepared by:起草日期Date: _____________________ QC审核人Reviewed by:审核日期Date: _____________________ QC审核人Reviewed by:审核日期Date: QA批准人Approved by:批准日期Date:质量部QD目的Purpose为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。

范围Scope本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。

职责Responsibility分析员：严格按照本操作规程执行。

及时完成各类相关记录。

在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。

主管：监督本操作规程的执行。

对检验员进行必要的培训。

指导任何可能的OOS和偏差调查。

内容procedure1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。

2试验用菌种及培养基2.1菌种:2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。

2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633]2.1.3大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739]2.1.4金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538]2.1.5白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231]2.1.6黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404]2.1.7伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028]2.1.8铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027]2.2培养基2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。

2.2.2大豆酪蛋白消化肉汤Soybean-Casein Digest Broth2.2.3大豆酪蛋白消化琼脂Soybean-Casein Digest Agar2.2.4沙氏葡萄糖琼脂Sabouraud Dextrose Agar2.2.5肠道菌增菌肉汤Enterobacteria Enrichment Broth Mossel2.2.6紫红色胆汁葡萄糖琼脂Violet Red Bile Glucose Agar2.2.7麦康凯肉汤MacConkey Broth2.2.8麦康凯琼脂MacConkey Agar2.2.9RV沙门氏菌富集肉汤Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth2.2.10木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂Xylose Lysine Deoxycholate Agar2.2.11甘露醇氯化钠琼脂培养基Mannitol Salt Agar2.3微生物计数培养基的适用性检查2.3.1微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

培养基灵敏度检查规程编号：版本：编制：日期：审定：日期：批准：日期：生效日期：管理部门：发放部门：生产部 质管部 工程部 研发部 PMC 采购部 仓库 营销中心 人事行政中心 财务部一、目的：确证使用所用的培养基是否符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。

二、检查时间：供试品的无菌检查前或者无菌检查同时进行。

三、范围：适应于培养基灵敏度检查四、依据：《中国药典》2020版第四部五、职责：质管部1.实验设备及用具：2.高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、注射器、针头、注射器盒、试管、试管架、搪瓷托盘、时钟、75%酒精棉球、无菌服。

2.培养基：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基3. 测试用菌种3.1金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]3.2 铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10104]3.3枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]3.4 生孢梭菌[CMCC（B）64941]3.5白色念珠菌[CMCC (F) 98001]3.6黑曲霉[CMCC(F)98 003]4. 菌液制备：4.1 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24 小时。

4.2 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时4.3 接种白色念珠菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂或液体培养基20～25℃培养24～48 小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液逐管稀释成每1ml 含菌量小于100cfu菌悬液4.4 接种黑曲霉的新鲜培养物至至胰酪大豆胨琼脂斜面上20～25℃培养5～7天用适量0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液逐管稀释成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

5. 无菌性检查在进行灵敏度检查前应先进行培养基的无菌性检查5.1 方法：每批培养基随机抽取不少于5支，至相应温度下培养14天，应无菌生长。

培育基的灵敏度测试培育基的灵敏度测试是其质量掌握的一个重要检测部分。

方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培育基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培育基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。

取预先制备好的琼脂培育基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培育基平皿3~5个（如较闻名的如MERCK,DIFICoL产品）做对比试验，待培育基表面的菌液被琼脂培育基吸干或风干后，将培育皿倒置于培育箱的使用温度下培育48~72小时，（也可采纳浇碟法进行）取出培育后的平皿点计菌落数。

样品培育基上的微生物数量应不得低于对比培育基上微生物生长数量的70%。

否则，需重新检查，或该培育基被视为不符合促生长要求。

2.用于掌握菌检查的富集培育基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培育基均应进行灵敏度检查。

每100ml培育基内分别接入试验菌小于100cfu,每个菌种接种两瓶培育基，将接过种的培育基置于指定条件下培育。

应在16~18小时后可明显观看到培育基内有微生物生长，则证明此培育基合格。

原则上无论是采纳脱水培育基还是按相关处方配制的培育基，一旦制成成品培育基，则应对每个配制批号培育基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培育基的质量。

按脱水培育基的生产批号做灵敏度检查是基于培育基的灭菌程序已经经过验证。

假如试验室使用的是商购的成品培育基,供应商应随培育基供应相应批次的培育基质量检测报告，报告包括培育基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。

建议在使用某一新的成品培育基（新供应商或新培育基品种）时，应至少考察三个不同批次的培育基质量，只有三批质量均合格方可使用该培育基。

微生物限度检查用成品培育基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以亚核其质量。

用于无菌检查试验的每批培育基，均必需按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于试验室自行配制的培育基。

方案名称:胰酪胨大豆肉汤培养基适用性检查验证方案目录1. 验证目的2. 参照标准3. 验证项目4. 验证职责5. 合格标准6. 试验材料7. 菌液制备8. 菌液计数9. 验证方法10. 结论1. 验证目的：为证明胰酪胨大豆肉汤培养基适合于真菌、需氧菌的无菌检查及无菌灌装模拟试验，特制定本验证方案。

2. 参照标准：2005版中国药典二部附录XI H无菌检查法。

3. 验证项目：3.1. 胰酪胨大豆肉汤培养基灵敏度检查。

3.2. 胰酪胨大豆肉汤培养基无菌性检查。

4.职责：4.1验证委员会：负责验证方案及报告的批准并组织协调验证工作并签发验证证书。

4.2.验证组长4.2.1.负责验证方案的起草4.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案的顺利实施。

4.2.3.负责验证报告的审批。

4.2.4.负责发放验证证书。

4.2.5.负责再验证周期的确认。

4．3. 质保部4．3.1.负责验证方案审核4．3.2.负责取样及对样品的检验4．3.3.负责收集验证记录，并加以分析后，起草验证报告。

4．3.4.负责验证数据及结果的审核5. 合格标准：5.1.接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌（接种量<100CFU）的培养基管各两支和1支空白对照管在30℃～35℃培养3天；接种白色念珠菌、黑曲霉（接种量<100CFU）和1支空白对照管在23℃～28℃培养5天；逐日观察结果，加菌的培养基管均生长良好，空白对照管应无菌生长。

判该批的培养基灵敏度检查符合规定。

5.2.胰酪胨大豆肉汤培养基经121℃，15分钟高压蒸汽灭菌后培养应无菌生长。

6. 试验材料：6.1. 被验证物品：品名规格批号生产厂家6.2. 仪器设备：6.2.1. LMQ、R立式压力蒸汽灭菌器6.2.2. Y OKO-ZX紫外分析暗箱6.2.3. SW-EJ-2FB双人净化工作台6.2.4. 101-2A电热鼓风干燥箱6.2.5.SPX-250B型生化培养箱(23～28℃)6.2.6.PHW-200S恒温培养箱(35～37℃)6.3. 稀释剂灭菌注射用水、0.9%无菌氯化钠溶液6.4. 培养基备注：培养基按培养基管理制度SMP QC 0009.01配制6.5 验证用菌株：7. 菌液制备7.1.取经培养18~24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。

支原体培养基灵敏度检査（变色单位试验法）及供试品检查方案目的：建立支原体培养基灵敏度检査（变色单位试验法）及供试品检查方案。

范围：适用于支原体培养基灵敏度检査及供试品检查。

依据：《中国药典》2015年版内容:1、概要：除药典推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。

2、设备生化培养箱、生物安全柜。

3、培养基灵敏度检査（变色单位试验法）3.1干粉培养基及对应菌种产品号产品名称菌种名称菌种编号11109 支原体肉汤培养基肺炎支原体ATCC 15531株11C21 精氨酸支原体肉汤培养基口腔支原体ATCC 23714株11A09 支原体半流体培养基肺炎支原体ATCC 15531株11321 精氨酸支原体半流体培养基口腔支原体ATCC 23714株3.2 培养基配制按照标签处方量配制成液体培养基，并按标签规定的温度和时间进行湿热灭菌，待用。

3.3灵敏度检查3.3.1菌液制备将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代。

3.3.2培养基接种及培养将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7〜10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3〜10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。

每个稀释度接种 3 支试管，置36℃±1℃培养7〜14天，观察培养基变色结果。

3.3.3结果判定：以接种后培养基管数的2 / 3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。

灵敏度应达到：支原体肉汤培养基：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8；精氨酸支原体肉汤培养基：口腔支原体( ATCC 23714株)应达到10- 4。

3.3供试品检查法3.1干粉培养基及对应菌种产品类型产品名称产品号液体培养基支原体肉汤培养基11109精氨酸支原体肉汤培养基11C21 半流体培养基支原体半流体培养基11A09精氨酸支原体半流体培养基11321 或：琼脂培养基支原体琼脂培养基11C233.2配制半流体培养基（或琼脂培养基) 按照标签处方量配制，并按标签规定的温度和时间进行湿热灭菌；在使用前应煮沸10〜15分钟，冷却至56°C左右，然后加人灭能小牛血清（培养基: 血清为8 ：2) ，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。

培养基灵敏度及适⽤性检查操作规程1. ⽬的：通过培养基适⽤性检查，确保购买的培养基符合实验要求。

2. 范围：本规程适⽤于技术质量部实验员对培养基适⽤性的检查。

3. 职责：质量部实验员负责执⾏此规程。

4. 内容：4.1 检验依据：《中华⼈民共和国药典》2015版4.2 试验⽤具：烧杯、三⾓瓶、酒精灯、接种环、平⽫、试管、吸管、移液枪、滴管、电⼦天平、电热恒温培养箱、⽣化培养箱或恒温恒湿培养箱、单⼈净化⼯作台、⾼压蒸汽灭菌器、微⽣物限度仪、漩涡混合器、试验菌种、检查⽤培养基等。

4.3 ⽆菌培养基适⽤性检查：本检查可在供试品的⽆菌检查前或与供试品的⽆菌检查同时进⾏。

4.3.1 培养基：硫⼄醇酸盐流体培养基、胰酪⼤⾖胨液体培养基或胰酪⼤⾖胨琼脂培养基（培养基的配制按《培养基配制操作规程》配制）。

4.3.2 稀释液、冲洗液及其制备⽅法稀释液、冲洗液配制后应采⽤验证合格的灭菌程序灭菌。

a) 0.1%⽆菌蛋⽩胨⽔溶液取蛋⽩胨1.0g，加⽔1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值⾄7.1±0.2，分装，灭菌。

b) pH7.0⽆菌氯化钠-蛋⽩胨缓冲液取磷酸⼆氢钾3.56g，⽆⽔磷酸氢⼆钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋⽩胨1.00g，加⽔1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

c) 根据供试品的特性，可选⽤其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%⽆菌氯化钠溶液）。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加⼊表⾯活性剂或中和剂等。

4.3.3 ⽆菌性检查：每批培养基随机取不少于5⽀（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应⽆菌⽣长。

4.3.4 灵敏度检查4.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所⽤的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中⼼获得的⼲燥菌种为第0 代），并采⽤适宜的菌种保藏技术进⾏保存，以保证试验菌株的⽣物学特性。

⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔CMCC（B）10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕⽣孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕⽩⾊念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98 001〕⿊曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕4.3.4.2 菌液制备a) 接种⾦黄⾊葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中或胰酪⼤⾖胨琼脂培养基上，接种⽣孢梭菌的新鲜培养物⾄硫⼄醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24⼩时；b) 接种⽩⾊念珠菌的新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基中或沙⽒葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48⼩时，上述培养物⽤pH7.0⽆菌氯化钠-蛋⽩胨缓冲液或0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。