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人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。
说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。
这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。
毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。
乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。
血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。
简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。
你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。
先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。
想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。
咱们要讲到“染色体标本制备”了。
这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。
你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。
所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。
为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。
你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。
在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。
1. 掌握人外周血淋巴细胞体外培养技术。
2. 学习制备染色体标本并进行核型分析。
3. 了解淋巴细胞有丝分裂过程及其影响因素。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，在免疫应答和维持内环境稳定中起关键作用。
在体外培养条件下，淋巴细胞受到植物血球凝集素（PHA）的刺激，可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂周期。
通过秋水仙素处理，使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：PHA、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、肝素、双抗等3. 仪器：显微镜、培养箱、吸管、培养瓶、载玻片、酒精灯、碘酒、无菌棉签等四、实验方法1. 采样：无菌条件下，取小鼠外周血0.5-1ml。
2. 培养液配制：无菌条件下，按照比例配制PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、PHA、肝素、双抗等。
3. 细胞培养：将外周血加入培养瓶中，每瓶加20滴左右，轻摇均匀。
将培养瓶置于36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时轻摇1次。
4. 秋水仙素处理：在培养72小时后，加入适量秋水仙素，使细胞分裂停滞在中期。
5. 细胞收获：收获细胞，进行低渗处理，使细胞膜破裂，染色体释放。
6. 固定：将低渗处理后的细胞加入甲醇和冰醋酸的混合液中固定。
7. 染色：将固定后的细胞涂片，进行染色。
8. 显微镜观察：在显微镜下观察染色体形态，进行核型分析。
1. 细胞培养：在培养过程中，细胞逐渐增多，形成细胞群体。
2. 秋水仙素处理：细胞分裂停滞在中期，染色体形态清晰。
3. 显微镜观察：观察到人类染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。
六、实验讨论1. 外周血淋巴细胞培养的成功与否，取决于培养液的成分和培养条件。
本实验采用PRMI 1640或M199培养基，并加入适量小牛血清、PHA、肝素、双抗等，保证了细胞的正常生长。
2. 秋水仙素处理是本实验的关键步骤。
适量的秋水仙素可以使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
hpbmc淋巴细胞的培养方法HPBMC（Human Peripheral Blood Mononuclear Cells）是指人外周血单个核细胞，其中包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞。
淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，对于免疫系统的功能发挥起着至关重要的作用。
因此，淋巴细胞的培养方法对于研究免疫系统的功能和机制至关重要。
本文将介绍HPBMC淋巴细胞的培养方法。
为了获得HPBMC，我们需要采集新鲜的外周血样本。
在采集外周血样本时，需要使用消毒的器具，避免污染。
一般来说，我们可以选择采用静脉采血的方式，将外周血收集到抗凝剂处理的试管中。
接下来，我们需要将外周血样本进行分离，获取到其中的HPBMC。
常用的分离方法有密度梯度离心法和负选择法。
密度梯度离心法是将外周血样本加入到含有密度梯度溶液的离心管中，经过离心后，不同细胞类型会分布在不同的密度层中，从而实现淋巴细胞的分离。
负选择法是使用磁珠或抗体等对非淋巴细胞进行标记，通过磁力或柱子的作用，将非淋巴细胞分离出去，从而获得HPBMC。
获得HPBMC后，我们需要对其进行培养。
首先，我们需要选择合适的培养基。
常用的培养基包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基等。
在培养基中，我们需要添加适当浓度的血清、抗生素和其他生长因子等，以提供细胞所需的营养物质和环境。
接下来，我们将HPBMC加入到培养基中，并将其转移到培养皿中。
在培养过程中，我们需要控制培养皿中的温度、湿度和CO2浓度等环境因素。
一般来说，培养温度为37摄氏度，湿度为95%，CO2浓度为5%。
在培养过程中，我们需要定期更换培养基，以保证细胞的生长和增殖。
通常情况下，每隔2-3天更换一次培养基。
此外，我们还可以根据实验需要添加不同的刺激物，如抗原、细胞因子等，以模拟特定的免疫反应。
在培养的过程中，我们可以通过显微镜观察细胞的形态和增殖情况。
如果需要进一步分析细胞的免疫功能，我们可以使用流式细胞术、ELISA等技术进行检测。
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
人外周血淋巴细胞的分离培养及核型分析一、实验目的1．学习人体微量外周血分离培养的方法2．学习应用培养淋巴细胞进行染色体制片的方法3．了解人类染色体核型的基本特征4．通过对人类染色体组型进行分析，初步学会对染色体进行分析的方法。
二、实验原理人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。
外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一。
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现，其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。
外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。
在人工离体培养时，在培养基中加入一定剂量的植物血凝素（PHA）后，小淋巴细胞受刺激可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。
用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）处理，积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期，从而获得足够的可供分析的中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
核型分析是指在有丝分裂中期，对染色体大小形态、数目测量，进行排队分组分析。
不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。
在显微镜下观察染色体的结构和数量。
正常男性的染色体核型为44条常染色体加2条性染色体X和Y。
正常女性的常染色体与男性相同，性染色体为2条XX。
三、实验仪器与试剂1. 实验材料：人外周血淋巴细胞2.实验试剂RPMI“1640”培养基、小牛血清（冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭活）、、秋水仙素、植物血球凝集素（PHA）、肝素、生理盐水溶液（500U/ml）、5%NaHCO3双抗（青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml）、2%碘酒、pH6.8的磷酸缓冲液、75%酒精、0.075mol/L KCl、固定液（甲醇：冰醋=3：1）、Giemsa原液。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
人的外周血淋巴细胞培养摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。
但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。
[1]关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。
此方法取材方便，用血量少，操作简便。
1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。
在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。
所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。
有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。
“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。
[3]淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。
因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。
各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。
本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。
同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。
(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。
染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。
冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。
1.材料方法1.1 材料人的外周血淋巴细胞。
1.2 器具采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪1.3 药品1.3.1 RPMI“1640”培养基称取“1640”粉末1.05 g，用100 mL的双蒸水溶解，溶解后pH 值调至6.0。
每1000 毫升溶液加NaHCO31.0克，校正PH到7.1。
1.3. 2 肝素作为抗凝剂使用。
称取该粉末8 mg（每mg含126 单位），用 2 mL的生理盐水溶解，此溶液的浓度为504 单位/mL。
1.3.3 生理盐水用0.9克NaCL加入100mL蒸馏水中，配制溶液。
1.3.4 秋水仙素作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。
称取秋水仙素1mg，用25mL生理盐水溶解，然后放入冰箱4℃保存。
使用时用1mL注射器吸取该溶液0.1mL加入5mL的培养物中，其最终浓度为0.8微克/毫升。
1.3.5 植物凝血素（PHA）是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的PHA粉末，一个针剂为0.2mL。
将1瓶粉末溶在2mL的蒸馏水中。
1.3.6 抗菌素青霉素（以每瓶80 万单位为例）：将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中，则每毫升含10万单位。
取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为1000单位/mL。
链霉素（以每瓶100 万单位为例）：以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含100万单位，取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为100单位/mL。
1.3.7 吉姆萨染液实验室中有现成染液1.3.8 3.5%NaHCO3溶液实验室有已配好的试剂。
1.3.9 0.1mol/L磷酸缓冲液实验室有已配好的试剂。
2 方法步骤2.1 分装培养液用移液管将培养液和其他各试剂分装入培养瓶中，每瓶量为：RPMI“1640”培养基4mL小牛血清1mLPHA 0.2mL双抗（青霉素加链霉素）0.1mL用3.5%NaHCO3溶液调pH到7.3，分装到20mL的培养瓶中，盖好盖子，用标签纸标清姓名，置于冰柜中保存。
用前从冰柜内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。
2.2 采血用酒精消毒手指皮肤，用采血针刺破皮肤，再用毛细管取血0.3mL全血，吹入瓶中,轻轻摇动几下，盖好盖子，直立置于37℃恒温箱内培养。
2.3 培养置37℃温箱内培养72 小时——这个时间恰好是白细胞分裂的两个周期。
2.4秋水仙素处理培养终止前在培养物中加入浓度为40μg/mL的秋水仙素0.1mL，最终浓度为0.8μg/mL，置恒温箱中处理4h。
2.5 低渗处理秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液(蒸馏水)5 mL，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置37℃温箱处理20 min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。
2.6离心以1000r/min，离心5min10s，弃去上清液，收集白细胞。
2.7 固定加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶l，临时配制)3 mL，片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15 min后，离心，吸去上清液，留下白细胞。
2.8再固定加入固定液2 mL，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15min （过夜也可以）。
2.9 再离心以1000r/min，离心5min10s，除去上清液，留下白细胞制片。
2.10 制片用吸管吸取细胞悬液自1m高处，滴在从冰柜中取出的一块干燥洁净的载玻片上,每片滴加悬液1—3 滴，用嘴轻轻吹散，在酒精灯火焰上微微烤干。
2.11 染色用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释过的Geimsa 染色液(1︰10)染色20min，然后倒去多余染液。
并用蒸馏水轻轻冲洗。
2.12 镜检待稍干后，在显微镜下观察。
先用低倍寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。
选择染色体清晰、分散度好的细胞进行核型分析。
3 结果分析3.1实验结果该图为显微镜视野内所拍到的图3.2 核型分析：人类每个体细胞有46 条染色体，22 对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
可以将人的46 条染色体分成A、B、C、D、E、F、G 七群，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。
三个参数：（1）染色体的相对长度（2）臂比率（3）着丝点指数4 分析讨论4.1实验误差分析实验利用的是植物凝血素(PHA)使停止分裂的细胞恢复分裂的原理来获得大量的有丝分裂细胞，从而便于对染色体经行观察。
但淋巴细胞经过培养后，制成的标本质量不佳，染色体不明显,视野中除有染色体以外还有杂菌等,其原因可能为：(1)未作灭菌处理，由于细胞培养是在37℃的环境中进行的，而此温度也是细菌繁殖的最适温度，所以杂菌会出现在视野中。
(2)秋水仙素处理不当，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。
(3)低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。
(4)低渗处理完后，细胞悬液可能并没有变浑浊，这有可能是用蒸馏水做低渗液没有使红细胞完全破裂，没有使白细胞充分的膨胀，从而会影响到观察的结果。
(5)在两次离心后，在离心管底没有看到明显的沉淀，有可能是培养基酸碱度没有调到最适的pH值或是培养时间短而导致白细胞量不足，从而影响了观察结果。
(6) 标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。
(7)载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流动而丢失。
(8)载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。
如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。
(9)核型图中染色体有的变粗，而有的很细小。
造成这种结果的原因可能是秋水仙素处理不彻底，一部分染色体加倍，而一部分没有。
4.2 实验注意事项4.2.1接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后24 小时内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,会影响细胞的活力.4.2.2在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA 的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要.人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃.培养液的最适pH7.2～7.4.4.2.3 适量的秋水仙素、适宜的处理时间，是获得良好分裂相的先决条件。
这将影响分裂相的多少和染色体的长短。
由于秋水仙素有强烈的毒性作用，用量过大，作用时间过长，可使缩短和发生异常分裂现象，甚至导致染色体破碎；反之，则染色体数量少而形态细长。
都不宜观察形态及计数。
故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
4.2.4 低渗处理是获得分散良好的分裂相的关键步骤。
低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。
低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。
低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。
太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。
注意，低渗液在使用前需要在37℃温箱预温。
4.2.5 充分的固定是制备良好分散的染色体的重要步骤。
如果染色体分散的不好，可在余下的细胞悬液中改为甲醇：冰醋酸=1:3的固定液，有时可改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷。
固定时间可以延长数小时或过夜。
特别要注意的是，固定液要新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定的效果。
4.2.6 固定液纯度要高，临用时新鲜配制，应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现毛刷状。
4.2.7 滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步。
首先载玻片要非常干净，否则将会影响染色体的分散的效果。
其次，滴片的距离、滴加量的多少、制片的方式都会影响到染色体分散的效果。
