人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备

人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。

由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。

Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。

必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。

常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。

②用于显带染色时能充分显示带型特点。

低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。

2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。

是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。

外周血细胞染色体培养操作实验六人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验目的1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。

2、初步掌握人外周血淋巴染色体的制备技术。

实验用品1.设备：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（带照相装置）、分水恒温培养箱、干燥箱、卧式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸汽灭菌器、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、，10ml培养瓶（可用环磷酰胺瓶代替）、2ml注射器、吸管、滴管试管架、三角瓶、染色瓶、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷板、铝饭盒、酒精棉球、消毒用碘棉球等。

2、材料：人外周血3.试剂：rpmil 640培养基（含10~20%小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、PHA、青霉素、链霉素、肝素、5%NaHCO 3溶液、1mol/lhcl、三重蒸馏水或二重蒸馏水、0.075mol/lkcl、甲醇、冰醋酸、吉姆萨储备液、pH 6 8磷酸盐缓冲液。

实验原理根据测量，健康成年人的淋巴细胞总数约为500×109，其中约2%在外周血中循环。

外周血淋巴细胞主要为小淋巴细胞（每毫升血液中的淋巴细胞含量可达1~3）×106）。

在正常情况下，它们处于间期的G0或G1期，因此很难看到分裂的淋巴细胞。

然而，Nowell （1960）发现，植物血凝素（PHA），一种从芸豆（菜豆）中提取的能够凝集红细胞的物质，可以刺激淋巴细胞有丝分裂。

在PHA的作用下，G0期淋巴细胞可转化为淋巴细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂。

体外培养约72小时后，大多数淋巴细胞处于第二个增殖周期。

此时，用有丝分裂阻断剂秋水仙碱治疗细胞，可以停止中间阶段的细胞分裂，然后进行低渗固定，其他治疗可以获得更多的中期染色体用于分析。

以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方便，用血量少（0.3～1.0ml即可），培养简单等优点，故该方法在临床上已得到广泛的应用。

内容和方法一、器材的清洗1.清洁培养瓶；将培养瓶在肥皂水中煮沸30分钟，趁热刷洗，然后用自来水冲洗肥皂。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。

说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。

这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。

毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。

乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。

血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。

简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。

你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。

先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。

想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。

咱们要讲到“染色体标本制备”了。

这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。

你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。

所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。

为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。

你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。

在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。

人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 6学时一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。

2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

向标本。

三、仪器设备显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。

四、相关知识点（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。

由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。

2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。

2）超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。

为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。

3）洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。

4）火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。

实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。

在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。

这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。

人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。

血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。

在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。

这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。

这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。

1912年，Warfter 最先研究人类染色体。

1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。

细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。

技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。

如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。

（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。

（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。

1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。

1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。

1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。

实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。

磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。

二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。

组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。

这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。

染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。

根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。

对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。