人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案

人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。

由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。

Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。

必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。

常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。

②用于显带染色时能充分显示带型特点。

低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。

2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。

是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。

就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。

一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。

2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。

3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。

二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。

2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。

3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。

三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。

2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。

3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。

4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。

四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。

2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。

加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。

3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。

4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。

5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。

6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。

五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。

2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。

3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。

4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。

六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。

2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。

3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。

4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。

说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。

这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。

毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。

乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。

血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。

简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。

你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。

先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。

想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。

咱们要讲到“染色体标本制备”了。

这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。

你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。

所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。

为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。

你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。

在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。

人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。

由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。

Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。

必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。

常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。

②用于显带染色时能充分显示带型特点。

低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。

2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。

外周血染色体制备与分析技术规范原理：在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。

植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。

利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。

具有用血量少、操作简单等优点。

1、实验材料2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。

2、培养液配制无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：RPMI 1640或199 90%小牛血清 10%PHA（自制） 0.1ml 3%肝素 10u/ml 2%双抗 100u/ml（选择）分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。

3、植物油凝素的制备植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。

自制的方法常用生理盐水提取法。

（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。

恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。

每8-12小时摇荡一次。

（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。

在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。

注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。

（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。

二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。

组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。

这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。

染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。

根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。

对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。

第四大组实验方案外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1.了解动物细胞培养的方法。

2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

3.学会对人类染色体的组型分析。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。

人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。

核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

正常的核型能代表个体的核型。

组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。

对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个：1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。

2.臂指数，指长臂同短臂的比率。

按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。

他决定着丝粒饿相对位置。

按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。

人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究近年来，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术受到了研究者们的极大关注，为研究人类基因组的结构、组成、表达、功能以及毒性性质等提供了重要的理论支持。

一、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术1、技术基础：染色体制备技术基于染色体延伸链分析技术，可以在特定细胞类型中获得更多有关人外周血淋巴细胞的信息。

2、实验方法：首先，经过放免定向损伤，用VP-16/Adr真核表达载体PCR形成染色体重组，生成环状染色体；然后，用PCR用LUC7+2分离染色体，形成环染色体；最后，用IMD技术将染色体细化为单个的LUC7+2染色单体，并用Cross-Linking（CL）技术衍生细胞凋亡程序，即可获得高分辨率的染色体。

二、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术的应用1、研究基因表达和表达调节：通过对人外周血淋巴细胞的染色体制备，可以研究基因表达和表达调节机制、调控水平及其功能，有助于研究人体健康和病理状态的机制。

2、研究药物作用：人外周血淋巴细胞的染色体制备技术可以很好的帮助研究中药的作用机制及其药效，为临床治疗使用提供理论依据。

三、未来发展1、对不同类型细胞的染色体制备技术的研究：进一步研究不同细胞的染色体制备技术，提供更多的信息，以更好地研究基因结构和功能。

2、研究不同材料的染色体制备技术：进一步完善不同类型材料染色体（如核酸、细胞类型或体液类型）染色体制备技术，为研究更多的生物信息提供参考。

综上所述，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术日益受到研究者们的重视，他们可以利用这项技术研究人体健康状态及病理状态机制、研究药物作用机制和提供理论依据来指导临床治疗，为健康科学发展提供重要理论支撑。

未来，研究将持续着眼不同类型细胞和不同材料染色体制备技术，更加完善技术，帮助研究者更好地了解人体基因组结构、表达、功能和毒性性质的信息。

实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。

(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。

【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。

在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。

但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。

因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。

【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。

2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。

【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。

2、培养至68 -70h。

然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。

3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。

(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。

中途混匀一次。

(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。

浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备2008年第2期6月出版食品工程F00DENGINEERINC浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备Onthepreparationofchromosomeofperipheralbloodlymphocyteofhumanbody董烁谢振兴(河南大学医学院,开封475004)DONGShuo'XIEZhen—xing(MedicalSchool,HenanUniversity,Kaifeng475004,China)摘要染色体制备技术是医学遗传学中最常见而重要的一种技术,由于各个实验室实验条件和个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的制作方法也不尽相同.笔者就人体外周血淋巴细胞染色体的制片过程中容易出现的问题及近几年制作染色体标本总结的经验和实验方法改进进行探讨,并提出了有效的避免方法.关键词染色体;染色体制备技术;外周血;细胞培养AbstractThepreparationofchromosomeisafrequent andanimportanttechniqueinmedicalgenetics.Some problemsexistedinexperimentwereanalysed.Improvingoftheexperiments,experiencesandprecautionsduring thepreparationofchromosomeofperipheralbloodlym—phocyteofhumanbodytheseyearswerethoroughlydis-cussed.Someeffectivemethodshavebeengiveninthispaper?keywordschromosome;preparationofchromo—some;peripheralblood;cellculture染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体,他由DNA和蛋白质构成,具有储存和传递遗传信息的作用.人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体.生物体细胞染色体数目和结构是重要的遗传标志之一,特别是在真核细胞中.因此深入认识染色体的结构和功能,对生物的遗传,变异和进化以及细胞的增殖,个体的发生和生殖过程的平衡控制都具有十分重要的意义.每个物种的细胞都具有一定的数目,形态,大小的染色体特征,称为染色体董烁,女,1976年出生,1999年毕业于河南师范大学,生物教育专业,助教.收稿日期:2008—03—19组型,各种染色体技术已广泛应用于核型,鉴别变异,体细胞杂交分析和绘制基因图等方面,因此在染色体的分析研究中,制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本而重要的技术,而优良的染色体制片是其他技术的先决条件.正常情况下,人外周血中是没有分裂相细胞的,只有在异常隋况下才能发现.外周血淋巴细胞一般隋况下处于增殖期中的GO(GD期,未经培养的外周血中很难找到正在分裂的淋巴细胞.植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,能使处于GO期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂.利用PHA这一特性,淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,再用秋水仙素处理,即可获得终止于分裂中期的淋巴细胞, 进而得到所需的人体染色体图片.加之,淋巴细胞遍及全身,并在所有器官组织中不断循环,能反映个体整体水平情况而不象体细胞那样具有局部性.1细胞培养1.1无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件,也是实验成功与否的先决条件.收获细胞前的所有步骤都要保持高度的无菌,严防细菌和病毒的污染.当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞丢失了对生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代谢物质积累等,可导致细胞死亡.1.2恒定的温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.人体细胞培养的标准温度为36.5±0.5oC,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至食品工程2008年第2期6月出版死亡.如果温度高于37℃,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40℃,细胞受损,超过43℃,则导致细胞死亡.培养箱的温度应严格控制在37土0.5℃, 为了能精确有效的控温,在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪.若温度过高或过低,则会延缓分裂周期,造成收获时细胞分裂相减少.1.3气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有0和CO.CO既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,他在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4,培养基的pH值也应调整到7.2～7.4 之间,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响. 偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩. 细胞培养液pH的调节最常用的为加NaHCO的方法,因为NaHCO,可供CO,但CO易于逸出,故最适用于封闭培养.1.4培养液植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的关键,只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂, 因此要考虑他的质量和尝试,质量有问题药效会降低,浓度过高可能会导致红细胞凝集,都会造成实验效果差.2操作步骤2.1细胞接种接种就是将注射器中的血液注入到培养瓶中.将注射器针头刺人培养瓶的胶塞向培养液中加入0.4mL～0.5mL血液.细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行.接种时无菌操作是否规范,直接影响到细胞培养的成败.如接种时如不慎将手接触到培养瓶的瓶塞,或接触了注射器的针头,可能会造成细菌中霉菌的污染.接种时,加入血液量的多少也会对培养结果有影响,血液太少, 细胞稀薄,细胞生长速度减慢;血液太多,会造成培养时细胞生长时营养成分不够,影响细胞生存.接种操作是在酒精灯附近进行,接种时还应注意避免血液遇高温被破坏.操作时手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜,离火焰太近,血细胞可能被破坏,甚至被烧焦成块,肉眼可见呈团块;同时也会造成针头堵塞.出现这种情况,应及时更换针头.如已接种,应更换一瓶培养液.2.2秋水仙素适量的秋水仙素,适当的处理时机和时间,是获得足够数量的,良好细胞分裂相的条件.分裂相的多少和染色体形态及带型处理是否良好均受其影响. 秋水仙素是一种生物碱,干扰细胞中微管组装,抵制细胞纺缍体的形成,能使细胞分裂停止于分裂中期,以积累大量的中期细胞.其浓度范围较宽,可相差几十倍之多,常用质量浓度为8g/mL~0.5g/mL.一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系, 如果在培养中,浓度过低或处理的时间过短,则标本中的分裂细胞就少,染色体瘦长;用量过多,浓度过高,虽能获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得足够多的分裂相和长度收缩适度的染色体.另外,处理时间延长,染色体发生分离,同样使染色体变粗短,也不利于计数和分析.加秋水仙素的时间是收集细胞制备染色体前2h～3h,加入秋水仙素后,使秋水仙素的终质量浓度为0.04g/mL~0.08g/mL培养液.实验前应根据培养液的用量和秋水仙素的浓度计算出加入的剂量.通常采用的加秋水仙素的器具是容量为1mL的注射器,使用时也应注意控制好注射器活塞,避免推动时用力过猛,导致秋水仙素加入量过多.2.3收获细胞和制片收获细胞和制片包括收集细胞,低渗,固定,滴片染色等几个步骤,每一步操作失误都可能造成最后实验的失败,使玻片上观察不到染色体.2.3.1收集细胞此步骤操作不当,容易造成细胞丢失.培养瓶从恒温箱中取出时,大部分细胞都沉淀在瓶子的底部,在将培养瓶中液体吸入到离心管之前,应用吸管将细胞充分吹打均匀,再移人离心管中.离心之后,吸弃上清,也应小心操作,有时由于吸得过猛,将与上清液相接处的淋巴细胞层吸掉了,造成大量的分裂中期相细胞丢失.2.3.2低渗低渗处理是染色体制备中很重要的环节,是获得分散良好的分裂相的关键步骤,低渗时间和低渗温度都关系到制片的成功.低渗过度或不足都会造成染色体形态不良.在低渗处理时期细胞十分娇嫩,并且表面发黏,低渗细胞混匀时,吹打要适宜,避2008年第2期董烁,等:浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备6月出版27免细胞破碎及粘团,另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部,避免细胞丢失.通过对比实验认为采用0.075mol,LKC137cI=处理20min一25min较合适,效果较好.用0.075mol,LKC1溶液于处理中期细胞,使细胞核膨胀破裂,染色体分散良好,便于观察计数.当低渗处理时间过长时,细胞膜过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果低渗处理时间不足时细胞膨胀不够,则染色体分散不好,染色体仍然成团或相互重叠,不利于进行观察,计数,分析.经过低渗处理的细胞因已膨胀,容易过早破裂,造成分裂细胞丢失,所以低渗后操作应特别注意不要用力冲吸.另外低渗还可使红细胞膜破裂,经离心后,血影浮于上清液中被去除.在观察制片结果时,如发现玻片上染色体有的张不开,有的呈现团状,有的数目不够,这是由于低渗时操作不当引起的.低渗不充分,染色体聚在一起;低渗过头,染色体丢失.低渗是否能达到目的,操作时要注意两个方面:一是要使细胞充分与低渗液接触.这就需要在加入低渗液后,要充分将细胞吹打均匀;二是要注意低渗时的温度和时间.2.3.3固定固定技术也是制备良好分散的染色体的重要步骤.低渗处理完后,需加入固定液,固定的目的是对染色体形态进行固定.若染色体分散不良,可适当加大冰乙酸含量,其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷,但过量会造成染色体形态变化和影响分带结果.染色体形态不良与加固定液速度有关,加第一次固定液快或过快,可造成飘带样染色体.固定液每次使用必须新鲜配制,否则将会形成酯类,从而影响固定效果.如果固定液不新鲜或甲醇,冰醋酸的质量不佳时,染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景,固定液为分析纯的甲醇和冰醋酸按3:1的体积比配制.预固定和固定时间:加固定液时,应沿管壁慢慢加入并轻轻吹打均匀,预固定和以后的二,三次固定时,固定液加入太快,混匀太快,会使固定作用过强,染色体扭转;固定作用若不足,染色体出现毛刷状.固定液纯度要高,临时配制,固定后再彻底打匀.吹打细胞时,用力要适度,如吹打过重, 会导致核型中染色体的丢失或变形.采用甲醇和冰醋酸按3:1体积比的固定液进行固定,将常用的第一次固定时间5min,30min改为25min,20min,适当延长时间,固定效果较理想.2.3.4滴片滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步.首先是载玻片要非常干净,否则会影响染色体的分散和分带效果.滴片用的玻片应干净,无脂,无酸才行.其次是滴片的距离,滴加量多少,制片的方式都会影响染色体分散效果.如果冰片冷冻不够,细胞难以贴附而造成丢失.载玻片经过一系列处理擦干后,放置冰箱内,冰冻4h以上,即为冰片.滴片时现用现拿出,否则会融化,操作时采用0℃预冷的冰片滴片.滴片时导致实验失败的原因有以下几方面:①由于细胞悬液太稀,导致滴片时细胞稀少;②载玻片上水太多,导致细胞悬液顺着水流失;③载玻片不洁净,染色体分散不佳;④滴片后,应立即放入7OcI=的烤箱中,以利于细胞的进一步胀开. Giemsa染色液与pH的影响:染色液浓度高,染色时间应缩短,如果染色液浓度增高,染色时间又延长,染色体着色加深,形态结构不清,对裂隙, 染色体断裂的检出可能减少.pH偏碱,染色体着色发蓝,色泽不艳,pH稍酸,染色体呈玫瑰色,色调鲜艳,形态结构清晰,利于统计分析和畸变的检出.烤片是染色体制备中最后一步技术.烤片的温度,时间与染色体形态和分带有关.不宜温度过高和烤片时间过长.细胞培养和染色体制备实验从接种到制片长达76h,在整个实验过程中必须严谨,不能有任何差错.而且细胞培养实验不同于其他实验,步骤多,整体性强,操作要求严格认真,最终实验才会取得成功.总之,随着医学的发展及人们对遗传疾病的逐步认识,染色体制备技术现已是医学遗传学中最常见而重要的一种技术.作为一名技术人员,做出一张高质量的人体外周血淋巴细胞染色体标本是十分重要的,这样才能更好地为临床诊断及优生与遗传咨询工作服务.参考文献[1]左假.医学遗传学[M],北京:人民卫生出版社.2004:110-127.[2]周焕庚.人类染色体[M].北京:科学出版社.1987:85—86.[3]蔡绍京.细胞生物学与医学遗传实验指南[M].上海:第二军医大出版社,2002:47_48.。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。

掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。

3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。

初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA （植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。

通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。

在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。

G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。

外周血染色体制备及分析原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。

外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。

由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：一、试剂准备1、0.2%的肝素溶液2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）3、0.075mol/Ll氯化钾溶液4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。

置37℃培养箱内培养72小时。

每日早晚定时摇匀培养物1次。

收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。

摇匀后继续培养 2小时。

三、收获细胞培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。

1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。

2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。