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作物病原真菌的拮抗菌筛选及其活性物质初步鉴定作者：胡洪涛张亚妮张舒李金泉张佑宏汪本福曹春霞任淑惠朱志刚姚经武龙同黄大野杨自文来源：《绿色科技》2017年第23期摘要：从湖北、安徽等地的水稻、小麦、豇豆、西瓜等种植区采集土壤，进行了微生物分离和培养。
采用对峙培养法，筛选到20株对11种重要作物病原真菌，如水稻稻瘟菌、小麦赤霉菌、豇豆根腐菌、西瓜枯萎菌等，具有不同拮抗活性的细菌，其中2株具有广谱抗真菌活性。
利用高效液相色谱和质谱对其中一株菌株的代谢产物进行了制备和结构初步鉴定，发现其主要活性成分为多烯类物质，分子量为803.67。
继续深入研究抗菌物质结构和抑菌机理，将有助于新型生物源杀菌剂的开发。
关键词：生防菌；稻瘟菌；赤霉菌；抑菌活性；高效液相色谱；质谱中图分类号：S476文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）23-0164-041 引言作物真菌性病害，如水稻稻瘟病（Rice blast）、小麦赤霉病（Fusarium head blight）、西瓜枯萎病（Fusarium wilt of watermelon）、豇豆根腐病（Cowpea root rot）等，是世界性重要作物病害，全球每年仅因稻瘟病和赤霉病流行导致的经济损失就高达数十亿美元[1，3]，同时，赤霉菌所产生的真菌毒素严重威胁着食品安全[4]；西瓜枯萎病和豇豆根腐病是重要土传性病害，常导致西瓜和豇豆大面积死亡。
目前，防治真菌性病害的方法众多，但多以化学药剂防效最好，然而，化学药剂大量施用，不仅导致农药残留超标，也给环境和食品安全带来极大隐患。
生物农药环境兼容性好、对生物安全，是作物病害绿色防控技术体系的关键。
供药筛选的化合物主要由3种获取途径，购买已知化合物库、分离和提取天然产物以及化学合成，其中微生物来源的天然产物因其种类众多、易扩大和再生，而成为药物开发的最主要来源[5]。
由于前人研究多关注放线菌和真菌，因而在过去所发现的2万多种微生物来源的活性物质中，绝大部分来源于放线菌和真菌[5]，只有小部分约7%来源于细菌，说明细菌来源的活性物质亟待研究和开发。
豆科植物内生固氮菌的分离与筛选管芩澜;唐梅;张智锦;龚明福【摘要】@@%以阿须贝无氮培养基为选择分离条件,对豆科植物内生细菌进行初步分离筛选,并通过固氮酶活性测定方法测定所得菌株的固氮酶活性,筛选有较高固氮酶活性的菌株.获得52株内生固氮菌,均具有固氮酶活性,其中2株固氮酶活性较高,具有潜在的应用价值.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)009【总页数】2页(P70-71)【关键词】豆科植物;内生固氮菌;分离;筛选;固氮酶活性【作者】管芩澜;唐梅;张智锦;龚明福【作者单位】峨眉山特色生物资源重点实验室/乐山师范学院化学与生命科学学院,四川乐山614004;峨眉山特色生物资源重点实验室/乐山师范学院化学与生命科学学院,四川乐山614004;峨眉山特色生物资源重点实验室/乐山师范学院化学与生命科学学院,四川乐山614004;峨眉山特色生物资源重点实验室/乐山师范学院化学与生命科学学院,四川乐山614004【正文语种】中文【中图分类】S643.01内生固氮菌能在植物根、茎、叶等各种组织内发挥固氮作用，相对于土壤自生固氮菌具有更明显的优势[1-2]。
相继在甘蔗、卡拉草Es-73等禾本科植物中发现的内生固氮菌与宿主之间形成的高效固氮系统，为人们研究生物固氮开辟了一条新的途径[3]，为减少化学氮肥的使用，促进农业的可持续生产具有重要意义[4]。
本研究通过选择培养法从豆科植物中分离获得内生固氮菌，从中筛选出固氮效率高、性能稳定的内生固氮菌株，以期为研制与应用植物微生物接种剂，建立豆科植物高效固氮体系，促进植物生长，增强植物抗逆性，为内生固氮菌在农业中的应用提供依据。
1 材料与方法1.1 分离材料从乐山地区不同地点采集豆科植物植株，包括根瘤、根、茎、叶、花、果、种子。
1.2 培养基内生固氮菌分离及固氮酶活性测定均采用阿须贝无氮培养基[5]。
1.3 内生固氮菌的分离纯化从乐山地区不同地点采集长势良好、无病虫害的豆科植物植株，其根、茎、叶、花、果、种子分别用自来水冲洗晾干后，各称取5 g(果10 g)，用无菌水反复冲洗4～5次，用70%乙醇浸泡消毒5～10 min，用2%次氯酸钠表面消毒5～30 min，无菌水冲洗3～4次，取最后1次冲洗液0.1 mL涂布无菌NA平板进行无菌检验。
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定一、培养基1 放线菌培养基高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。
放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。
2 放线菌形态及培养特征研究用培养基察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。
燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。
甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。
第33卷 第1期西北农林科技大学学报(自然科学版)V o l.33N o.1 2005年1月Jour.of N o rthw est Sci2T ech U niv.of A gri.and Fo r.(N at.Sci.Ed.)Jan.2005拮抗放线菌的筛选培养基与筛选方法研究Ξ高 鹏,薛泉宏,常显波,封 晔(西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌712100) [摘 要] 从黄土高原人工植被土壤中分离得到若干放线菌,研究了从中筛选的50株拮抗性放线菌在不同培养基上对8种供试靶标菌的拮抗性。
结果表明:①在黄豆粉琼脂和玉米粉琼脂培养基上,放线菌生长较好,在PDA 和高氏1号琼脂培养基上生长次之。
玉米粉和黄豆粉琼脂均可作为拮抗性放线菌的筛选培养基。
②反向放置琼脂块是筛选拮抗性放线菌的一种有效且可靠的方法。
③筛选拮抗性放线菌时,制备琼脂块的培养时间应控制在8～12d,培养时间过长将会导致拮抗作用减弱。
④筛选得到的50株供试放线菌中对辣椒疫霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯萎菌、西瓜枯萎菌、青霉、假丝酵母、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌有拮抗性的放线菌株数分别为27,26,33,36,35, 29,35和20株。
[关键词] 放线菌;培养基;拮抗菌筛选;拮抗性试验[中图分类号] Q939.92 [文献标识码] A[文章编号] 167129387(2005)0120059205 放线菌能产生多种抗生素。
拮抗性放线菌的筛选是新医药和新农药开发的重要基础性工作。
拮抗性放线菌的筛选培养基通常采用黄豆粉琼脂培养基[1～5],但有时发现在其他培养基上,有些放线菌的拮抗圈远大于黄豆粉琼脂培养基。
目前,对黄豆粉琼脂培养基以外的抗生素产生菌筛选培养基研究很少[6],为了寻求更适合于拮抗性放线菌筛选的培养基和琼脂块放置方法,本试验初步研究了培养基种类、琼脂块放置方式及培养时间对50株拮抗性放线菌的拮抗性,旨在探索拮抗性放线菌筛选的适宜培养基与筛选方法。
拮抗农业致病真菌放线菌株BOS-010的分离、抗菌活性及鉴定研究周霖;王勇;王宁宁;闫从阳【摘要】28 strains of actinomyces were obtained by dilution ing 20 kinds of agricultural common pathogenic fungi as the detected fungi,the strains were screened with the method of inhibiting hypha growth rate.Finally,the strain BOS-010 was selected and determined as the microbial biocontrol agent.Moreover,the morphology,cultural characteristics,physiological-biochemical characteristics and 16 S rDNA sequences of this strain were studied.By comparing with the published 16 S rDNA sequences,it was showed that the homology reached up to 99％between the strain BOS-010 and Streptomyces recifensis.Depending on the phylogenetic tree and principles of taxonomy,the strain BOS-010 belonged to S.recifensis.%采用稀释分离法得到28株放线菌,以20种农业常见致病真菌作为供试检测菌,采用抑制菌丝生长速率法对放线菌进行抗菌活性筛选,优选出BOS-010菌株作为目的生防菌.通过形态学、培养特征、理化指标检测,对BOS-010放线菌菌株进行初步鉴定;通过16 S rDNA序列比对,发现该菌株16 S rDNA与累西菲链霉菌(Streptomyces recifensis)16 S rDNA同源性达99％.根据多项分类原则和系统进化树的构建分析,确定该菌株归属累西菲链霉菌类.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2013(052)001【总页数】4页(P101-104)【关键词】放线菌;抗菌活性;BOS-010;农业致病真菌;鉴定【作者】周霖;王勇;王宁宁;闫从阳【作者单位】辽宁科技大学化工学院,辽宁鞍山 114044;辽宁科技大学化工学院,辽宁鞍山 114044;辽宁科技大学化工学院,辽宁鞍山 114044;辽宁科技大学化工学院,辽宁鞍山 114044【正文语种】中文【中图分类】S482.2放线菌是具有巨大使用价值的一类微生物资源，迄今已知的抗生素中近2／3是由放线菌产生的［1，2］，其中已被使用的抗生素有75%由链霉菌产生［3］。
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
苦豆子内生放线菌的分离鉴定及其拮抗菌筛选顾沛雯(宁夏大学农学院,宁夏银川750021) 摘 要:采用3种消毒时间对健康苦豆子植株体内的内生放线菌进行分离。
结果表明:消毒3min消除非内生菌的影响效果较好;同一植株分离内生放线菌的数量,根部比茎、叶部多。
经初步鉴定,苦豆子内生放线菌以链霉菌属和诺卡氏菌属为最多,分别占分离总数的35%和27%;其次为小多孢菌属,占12%;而类诺卡氏菌属、小单孢菌属、孢囊放线菌属和分枝杆菌属分离较少。
26株纯化菌株对茄子枯萎病菌进行平板对峙培养,筛选出3株抑菌带宽度达到10mm以上的菌株,其中菌株K DS22发酵液抑菌效果最好。
关键词:苦豆子;内生放线菌;分离;拮抗菌筛选中图分类号:S482.5+1;S436.411 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2009)06-0012-05 茄子枯萎病(Eggplant fusarium wilt)是一种毁灭性的植物土传病害,不仅引起叶片坏死和茎秆枯萎等症状,还能够造成整株萎蔫死亡,在高温高湿的保护地栽培条件下发病尤为严重。
目前生产上没有抗病品种可以利用,而药剂防治用药量大、效果差,且容易引起病原菌抗药性和土壤中农药残留等环境污染问题,因此,探索无公害防治措施势在必行。
近年来,生物防治已经作为一种重要的方法用于控制植物土传病害[1]。
有关土传病害的生物防治国内外已进行了大量研究,筛选到的有效生防微生物主要有放线菌(Actinomycetes)[2]、假单孢菌(Pseudomonas sp)[3]、作者简介:顾沛雯(1969Ο),女,宁夏银川人,博士,副教授,现主要从事植物病理学的教学和科研工作。
EΟmail:gupeiwen2005@ya2 。
基金项目:国家科技支撑计划资助项目(2007BAD57B02);宁夏自然科学基金资助项目(nz0619);宁夏大学自然基金资助项目。
收稿日期:2009-01-16哈茨木霉(Trichoderma harzianum)[4Ο5]、芽孢杆菌(B a2 cillus sp)[6]和内生芽孢杆菌(Endophytic B acillus)[7]等。
但有关药用植物内生放线菌防治土传病害的研究鲜为报道。
研究发现药用植物中蕴含着大量的内生菌,这些内生菌与宿主之间具有紧密的生态关系,产生的次生代谢产物在病虫害的生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐增大,成为寻找新的天然活性产物的重要方向[8]。
沙生药用植物苦豆子(Sophora alopecuroi des L.)主要分布于西北干旱荒漠和半荒漠地区,在宁夏种群优势突出,是宁夏重要的道地药材之一[9Ο11]。
由于其较高的药用价值和生态学功能,目前成为国内外研究的热点[12],但在植物内生菌方面研究较少。
该研究通过对宁夏沙生药用植物苦豆子内生放线菌进行初步的分离鉴定,并以茄子枯萎病菌为靶标菌,从分离的内生放线菌中筛选对该菌有拮抗作用的生防菌株,以便为该病的生物防治提供理论依据。
average weight per fruit by4.1g,the average weight per spike by60.4g,the yield of Fujiminori grape by1.42kg,the content of soluble solid to1.7%,and V C by0.6mg/g,and also can decrease the content of the titrated acid by0.2%. We also tested the effect of the different amount of fertilization of the No.4fertilizer on the yield and quality of Fujimino2 ri grape which can be notably affected.According to the experiment results,the optimal amount of fertilization was100 mL per plant,since comparing to the reference,the yield and quality of Fujiminori grape were markedly enhanced.The yield and quality of Fujiminori grape were indeed improved with the increasing amount of fertilization,but comparing to that of100mL per plant,there was no notable enhancement at125mL per plant.Therefore,the economical amount of fertilization of the No.4fertilizer should be100mL per plant.K ey w ords:Fujiminori grape;FermentΟbacterium fertilizer;Amount of fertilization1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试植物 2008年7月采自宁夏盐池县毛乌苏荒漠的野生苦豆子。
1.1.2 供试靶标菌 茄子枯萎病菌(Fusarium ox yspo2 rum f.sp.melongenae Matuo et Ishigami Schlecht.)由宁夏大学农学院实验室提供。
1.2 内生放线菌的分离和鉴定1.2.1 培养基 NA、高氏1号培养基与PDA培养基的成分及配制参照文献[13]。
1.2.2 植株处理和内生放线菌的分离 称取苦豆子样品0.5g,用清水洗去污泥后,在超净台中无菌水清洗数10次后,用75%酒精浸泡30s,再用3%的次氯酸钠浸泡5、3、1min后,立即用无菌水洗涤3次,研碎,加入到装有10mL无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中,涡旋振荡1 min,将悬液以3000r/min离心3min,上清液和最后一遍冲洗无菌水分别涂于3种培养基平板上,28℃培养1周,计数。
1.2.3 内生放线菌的鉴定 挑取分离纯化培养的内生放线菌,采用插片法,28℃培养,用光学显微镜观察形态,根据放线菌基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态特征进行分类鉴定[14Ο15]。
1.3 内生拮抗放线菌的筛选1.3.1 内生放线菌的皿内对峙培养 采用琼脂块对峙培养法,打孔器截取直径4mm的茄子枯萎病菌菌块于PDA平板中央,同时在距中心2.5cm均匀反贴4株内生放线菌菌块,每个菌株重复3次,25℃恒温培养。
以仅接靶标菌的培养皿为对照。
待对照长满培养皿时测量抑菌带的宽度。
1.3.2 内生拮抗放线菌发酵液的抑菌活性测定 选择在皿内对茄子枯萎病菌拮抗性好的抑菌圈直径≥10mm 的内生放线菌,以液体发酵培养的方法进行繁殖,测定发酵滤液对病原菌的拮抗性,其方法[16]为:将放线菌菌株斜面的孢子用无菌水配成菌悬液,使孢子最终浓度为107～108cfu/mL。
按1%的接种量接入发酵培养基(黄豆饼粉2%,葡萄糖1%,淀粉1.5%,碳酸钙0.25%磷酸氢二钾0.05%,p H7.0),置于28℃,转速170r/min的恒温摇床上培养3d。
测定时,将发酵液于80℃下水浴恒温处理30min,取15mL于5000r/min离心30min,然后吸取上清液2mL于培养皿中,将熔化(50℃左右) PDA培养基8mL倒入皿中与上清液混合均匀,冷却凝固后接病原菌的菌饼,重复3次,以加蒸馏水作对照。
28℃培养,待对照长满全皿时,交叉测量菌落直径。
2 结果与分析2.1 去除非内生菌的方法在研究内生菌的过程中,内生菌的分离方法很重要,灭菌过轻或过重都会造成对植物内生菌调查准确性的影响。
由表1可以看出,采用不同消毒时间处理植株,除消毒1min对照无菌水中含有菌外,其它2种处理对照无菌水中均不含有菌,说明消毒时间过短不能完全去除植株表面的微生物。
消毒处理5min所得的菌量极少,可能是由于消毒时间过长化学试剂渗入植株内部,用无菌水冲洗表面不能阻止其在植物内部作用,大量内生菌被杀死。
所以,该试验选用消毒处理3min的方法来消除非内生菌的影响。
表1不同消毒时间处理3种培养基上的菌量变化 T able1The m icrobe numbers in three culture medium with different sterilizing time cfu/g处理方法T reatment细菌Bacterium放线菌Actinomycetes真菌Fungi总菌量T otal microbenumber对照无菌水总菌量T otal microbe number of control water5min1000100 3min10226101380 1min2033439276872.2 不同部位内生放线菌的种类从采自宁夏盐池县毛乌苏荒漠的野生苦豆子上共分离内生放线菌26株,编号分别为K DS1～K DS26。
在植物不同组织中所获得的内生放线菌以根部最多,达到13株,其次为叶部8株,茎部5株。
2.3 内生放线菌的鉴定结果合并形态相同的分离物,从苦豆子根、茎和叶供分离26株内生放线菌,经初步鉴定(表2),9株为链霉菌属,7株为诺卡氏菌属。
3株为小多孢菌属,其余分属于类诺卡氏菌属、小单孢菌属(图1A)、孢囊放线菌属(图1 B)和分枝杆菌属。
链霉菌属的不同类群以灰褐类群(图1C)和白孢类群占优势,黄色类群比较少见(图1D)。
诺卡氏菌属产生淡黄(图1E)、白色(图1F)、红橙、粉红、黄绿、黑褐色等不同颜色的菌落。
不同属内生放线菌形态特征见表2。
2.4 内生放线菌的离体拮抗作用用平板对峙培养,测试26株苦豆子内生放线菌对茄子枯萎病菌的拮抗作用。
其中12株有抑制作用,抑菌带宽度大于10mm以上的有3株,分别为K DS9(图3 A)、K DS13(图3B),以及K DS22(图3C)。
其它菌株不具有抑制性或抑制性较弱。
2.5 苦豆子内生放线菌发酵滤液的抑菌作用对拮抗性好的苦豆子内生放线菌K DS9、K DS13和K DS22分别进行发酵液抑菌试验,筛选的3株内生放线菌发酵液均有不同程度的抑菌作用,其中K DS22抑菌活活性物质,这尚有待于进一步研究。
性最强(图4)。
表明菌株K DS22发酵液中含有某种抑菌图3 苦豆子内生放线菌对茄子枯萎病菌的抑制作用 注:A:K DS9、K DS10、K DS11和K DS12的皿内对峙培养;B:K DS13和K DS14的皿内对峙培养;C:K DS21和K DS22的皿内对峙培养;CK:对照。
