优良醋酸菌的分离纯化

藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【摘要】One Acetobacter strain, FJAT-13797, was isolated from Tibetan kefir. The image under scanning electronic microscope showed that the bacterium was rod-shaped with round ends, and presented in single or pairs without spores. The strain showed the bio-chemical properties of Acetobacter spp. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the strain, FJAT-13797, belonged to Acetobacter orientalis.%从藏灵菇中分离出醋酸菌株FJAT-13797,利用形态学观察、生理生化和16S rDNA方法对其进行细菌学鉴定,菌体形态为圆端直杆,单个或成对,无芽孢,其生理生化特征与醋杆菌属(Acetobacter)基本一致.经16S rDNA基因序列同源性比较和系统发育分析,菌株FJAT-13797鉴定为东方醋酸菌(Acetobacter orientalis).【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2012(027)012【总页数】4页(P1339-1342)【关键词】藏灵菇;鉴定;醋酸杆菌;东方醋酸菌【作者】曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】TS252藏灵菇是一种乳白色、胶质状的块状物（由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成），外形酷似米粒，上面栖息着多种微生物，长期在牛奶中培养，个体会增大很多，形状如盛开的雪莲，有人称之为“西藏雪莲”［1－3］。

第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。

醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。

醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。

黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。

醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。

醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。

醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。

本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。

2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。

试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。

表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。

2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。

醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌是一类常见于自然界中的微生物，主要分布于果酱、蜂蜜、果汁等酸性环境中。

醋酸菌能够利用酒精和氧气生成乙酸作为能量源，在食品加工、饮料发酵以及环境保护中具有重要的应用价值。

为了获得高效的醋酸菌菌种，需要进行菌种的分离筛选。

以下是醋酸菌菌种分离筛选方法的一般步骤：1.样品的收集与处理：从酸性环境中收集样品，如水果糖浆、果酱、蜂蜜等。

样品应保持新鲜，并避免污染。

如果样品是固体的，可以通过混合样品和生理盐水来制备悬浮液。

2.菌落计数：将悬浮液经过适当稀释，并均匀分布在含有固体培养基的琼脂平板上。

用细菌计数板或细胞计数器对菌落进行计数。

选取外形典型的菌落进行进一步的分离。

3.菌种分离：根据菌落形态、色素沉积、生理特性等进行分离。

选取外形典型的菌落，利用无菌环针在无菌琼脂平板上进行涂布。

4.筛选培养基的选择：醋酸菌是革兰氏阴性菌，最适生长温度一般在30-35°C范围内。

常用的筛选培养基包括葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂（GAC）和醋酸葡萄糖琼脂（GAA）。

也可以根据菌种特性选择适宜的培养基进行筛选。

5.培养条件控制：将分离出的菌种接种在含有适宜营养物质的筛选培养基上，并控制培养条件。

包括温度、pH值、搅拌速度等。

优化培养条件可以提高菌种的产量和质量。

6.菌种纯化：逐步单菌分离并培养，目的是获得纯种菌株，确保菌株的纯度和稳定性。

7.菌种特性分析：对分离出的菌种进行鉴定和特性分析，包括形态学观察、生理特性鉴定、生化指标检测和分子生物学方法确定其种属和亲缘关系等。

总结：醋酸菌菌种的分离筛选是一个多步骤的过程，需要进行样品收集、菌落计数、菌种分离、筛选培养基的选择、培养条件控制、菌种纯化以及菌种的特性分析。

通过这些步骤的实施，可以获得高效的醋酸菌菌种，为醋酸菌的应用提供有力的支持。

第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。

醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。

醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。

黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。

醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。

醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。

醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。

本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。

2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。

试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。

表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。

2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。

微生物实验设计-醋酸菌实验设计：醋酸菌的分离与纯化——生物科学2班秦琬莹辛吉瑀张博文一、实验目的学习醋酸菌的分离纯化、鉴定的原理。

掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。

二.实验原理1.菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

2.接种操作方法涂布平板法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

3. 结晶紫结晶紫是一种碱性染料，也一种极佳的精密酸指示剂，pH 0.5(绿)～2.0(蓝)~弱酸（蓝紫）~中性（紫色）~碱性（赭红色）；所以在醋酸菌分离纯化平板培养基中加入少量的结晶紫溶液，既不会影响醋酸菌的生长，又可根据变色圈的大小很快把产酸高的醋酸菌株分离出来。

二、材料、用品1.样品：食醋2.培养基：（1）分离纯化平板培养基葡萄糖1 g，酵母膏1 g，碳酸钙2 g，琼脂2g，水100mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃加入4mL无水乙醇和0.5mL 0.02％结晶紫冰醋酸溶液。

（2）液态发酵培养基葡萄糖l g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，水100 mL，pH6.5，灭菌后冷却至60 ℃以下加入无水乙醇3.5mL。

3.器材：接种环、冰箱、试管、培养皿、无菌玻璃涂棒、移液管、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅等。

醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。

醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。

可进行分离菌鉴别。

1.培养基：1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000ml CaCO310-15g 95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入） PH自然1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L 酵母膏10g/L CaCO3 15g/L PH 6.81.3乙醇30mL/L 酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO3 10-15g/L（常规筛选培养基） PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。

1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO3 15-20g/L 琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。

1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L 膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH2PO40.5g/L MgSO40.5g/L PH 6.5-6.82.菌种筛选：2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，30-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。

形态与醋酸菌相符即可分离。

2.2混菌法分离：（分离及初筛）适度稀释10-5、10-6、10-7 取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃ 24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。

挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃ 24-48h。

一、实验目的1. 掌握醋酸菌的分离和纯化方法。

2. 熟悉实验室无菌操作技术。

3. 了解醋酸菌的生长特性和代谢产物。

二、实验原理醋酸菌（Acetobacter）是一类能使糖类和酒精氧化成醋酸的短杆菌。

在适宜的条件下，醋酸菌可以将乙醇氧化成乙醛，再将乙醛氧化成醋酸。

本实验通过制备适宜的培养基，利用醋酸菌的氧化特性，对醋酸菌进行分离和纯化。

三、实验材料与仪器材料：1. 新鲜果醋2. 葡萄糖碳酸钙培养基3. 1%三氯化铁溶液4. 革兰氏染色液5. 0.1mol/L NaOH标准溶液6. 1%酚酞指示剂7. 无菌水8. 平皿9. 三角瓶10. 吸管11. 试管12. 玻璃珠仪器：1. 高压蒸汽灭菌器2. 灭菌锅3. 灭菌箱4. 恒温培养箱5. 显微镜6. 精密天平四、实验方法与步骤1. 制备培养基：- 称取30g米曲汁，加入500mL三角瓶中。

- 加入0.0002%结晶紫和3%-5%的乙醇。

- 加入3%-5%的碳酸钙。

- 加水定容至1000mL。

- 将培养基煮沸10分钟，过滤除菌。

- 将培养基分装至无菌平皿中，待冷却凝固。

2. 分离和纯化醋酸菌：- 将新鲜果醋进行10倍稀释。

- 取适量稀释液，滴加至平板培养基上，均匀涂布。

- 在平板培养基上滴加1-2滴1%三氯化铁溶液，以促进醋酸菌生长。

- 将平板倒置于恒温培养箱中，培养温度控制在30℃。

- 24小时后，观察菌落生长情况，挑取单菌落进行纯化。

3. 纯化后的菌落观察：- 将纯化后的菌落进行革兰氏染色，观察菌落形态。

- 将纯化后的菌落进行显微镜观察，观察菌体形态。

4. 验证纯化效果：- 将纯化后的菌落接种至葡萄糖碳酸钙培养基中，观察醋酸菌的生长情况。

- 将纯化后的菌落接种至葡萄糖培养基中，观察醋酸菌的代谢产物。

五、实验结果与分析1. 菌落形态：- 观察到纯化后的菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑、颜色为白色。

- 革兰氏染色结果显示，纯化后的菌落为革兰氏阳性菌。

2. 显微镜观察：- 观察到纯化后的菌落为短杆状，长度约为1.5-2.5μm，宽度约为0.8-1.2μm。

一株醋酸菌的分离鉴定及冬枣醋发酵条件的优化郭梦瑶; 韩烨; 李素燕【期刊名称】《《中国酿造》》【年(卷),期】2019(038)011【总页数】6页(P31-36)【关键词】柿子醋醋醅; 醋酸菌; 木醋杆菌; 冬枣醋; 发酵条件优化; 正交试验【作者】郭梦瑶; 韩烨; 李素燕【作者单位】天津大学化工学院天津300350【正文语种】中文【中图分类】TS201.3果醋是以水果或果品加工的下脚料为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵酿制而成的一种集营养食疗为一体的新一代酸性调味品或饮料[1]。

果醋的营养丰富，富含多种有机酸，人体所需的多种氨基酸、维生素及生物活性物质，起到促进血液循环、降血压、调节体液酸碱平衡、抑制血糖升高、抗菌消炎和催眠镇静的作用[2-4]。

醋酸菌是能够将酒精氧化为醋酸的一类微生物的总称。

醋酸菌对人及动物均无致病性，且大部分醋酸菌性状优良，营养要求较简单，环境适应能力强，可造成果实的细菌性腐败，造成酒的酸化，产生气味较温和的有机酸，引起酒的变色与风味改变[5-6]。

优良的醋酸菌菌种是影响果醋品质的重要因素。

国内外果醋酿造专用醋酸菌大都为食醋菌种AS1.41（Acetobacter rancens var.tubidans）和沪酿1.01（A.pasteurianus subsp.pasteurianus）等[7]。

选育方法常用的有自然选育法或诱变育种法，但总体来看选育后的菌株产酸能力、耐酒精能力有限，而且发酵果醋形成的风味也不佳[8]，转酸率高的菌株可以充分利用原料资源，节约成本，因此急需选育综合性能优良，特别是转酸率高的菌种。

冬枣也叫水果枣、冰糖枣，是目前枣中最高档的鲜食品种。

其营养丰富，含19种人体必需氨基酸，维生素A、维生素E，钾、铁、铜、硒等多种微量元素；同时，枣多酚、黄酮含量高，具有较强的抗氧化活性、调节血脂和防治脑血管疾病的功效，是天然的滋补佳品[9-11]。

我国有悠久的果醋制作历史，冬枣醋作为一种冬枣深加工产品，既具有冬枣特有的风味和营养价值，又兼有果醋的营养成分和保健功能，是一种新型的天然营养保健醋，具有广阔前景[12]。

醋酸菌分离及鉴定醋酸菌分离及鉴定一、培养基1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌后培养基温度降到75 ℃左右时加入。

2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。

3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。

二、醋酸菌分离纯化流程样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管保藏→产醋酸定性测试。

三、步骤1 、菌株分离取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。

取10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。

选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。

2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，4℃冰箱保存。

3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极其相似的菌株归为一大类。

4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上混匀后得到菌悬液。

四、鉴定1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。

2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。

醋酸菌中乙醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质张鸣明;宋勇强;李素岳;胡先望;梁宁;张春园【摘要】Acetaldehyde dehydrogenase (ALDH)was isolated and purified by the Acetobacter pomorum obtained from the self-screening of the laboratory,cell disruption,ammonium sulfate fractionation,DEAE-Sepharose fast flow chromatography and Superdex G-75 prep grade chromatography separation and purification of enzyme liquid aldehyde dehydrogenase,and its enzymatic properties was studied.The molecular weight of the enzyme was 221.60 kDa,in which the subunit molecular mass was 54.41kDa,respectively.The crude enzyme was purified 10.16 times with 20.25U/mg of enzyme activity and the recovery rate of ALDH was 6.53％.The enzyme properties showed that its optimal reaction temperature was50 ℃,and the enzyme had a good stability between 40 ℃℃ and 50 ℃;The optimal reaction pH of ALDH was 7.0,and there was a good stability between pH5.5 and pH7.5.The effects of different metal ions on enzyme activity showed that the enzyme was strongly inhibited by Na+,K+,Zn2+,Ba2+,however,Mg2+ 、Ca2+ 、Al3+ 、Li + 、Cu2+ activated the enzyme activity.The substrate specificity of ALDH showed that the enzyme had higher enzyme activity on acetaldehyde,which was on straight aldehydes.ALDH had high enzyme activity,which provided a foundation for further investigation of biological function.%以实验室筛选得到的醋酸菌(Acetobacter pomorum)为实验菌株发酵产酶,通过细胞破壁,采用(NH4)2SO4沉淀、透析、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化得到乙醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质.该酶分子质量为221.60 kDa,单个亚基分子质量约为54.41 kDa,为四聚体结构;纯酶液比活力20.25 U/mg,纯化倍数为10.16倍,乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的回收率为6.53％.酶学性质研究表明,ALDH促进乙醛分解的最适温度为50℃,40～50℃相对酶活力稳定性好;该酶的最适pH为7.0,当pH在5.5 ～7.5内酶活力表现稳定:金属离子对酶活性的影响实验表明,Na+、K+、Zn2+、Ba2+对该酶酶有不同程度抑制作用,而Mg2+、Ca2+、Al3、Li+、Cu2+具有促进作用;ALDH的最适底物为乙醛,相对偏好直链醛类.ALDH活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】5页(P100-104)【关键词】醋酸菌;乙醛脱氢酶;分离纯化;酶学性质【作者】张鸣明;宋勇强;李素岳;胡先望;梁宁;张春园【作者单位】甘肃省商业科技研究所,甘肃兰州730010;甘肃省商业科技研究所,甘肃兰州730010;甘肃省商业科技研究所,甘肃兰州730010;甘肃省商业科技研究所,甘肃兰州730010;甘肃省动物源性制品安全分析与检测技术重点实验室,甘肃兰州730010;甘肃省商业科技研究所,甘肃兰州730010;甘肃省商业科技研究所,甘肃兰州730010【正文语种】中文【中图分类】TS201.2+5乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH),是参与有机体内醛类物质与酸类相互转化的重要代谢酶类[1]。

传统广式米醋中醋酸菌的分离、鉴定及分批补料发酵法制备米醋工艺研究传统广式米醋以米酒及食用酒精为原料，采用静置表面发酵法生产，产品风味好，深受市场欢迎。

其发酵缸中的菌种由自然驯化的10年上野生菌构成，生产周期一般在40天左右，发酵总酸为3.5g/100mL--4.5g/100mL。

目前广式米醋存在发酵周期长，占地面积大，发酵总酸偏低等不足。

针对其主要发酵菌种研究较少，对发酵工艺改进的研究不多。

本文对广式米醋的主要生产菌进行了分离及鉴定，并对发酵工艺的改进进行了研究。

主要内容包括：（1）主要产酸菌的分离与鉴定；（2）发酵方式、碳源、氮源、磷酸盐及铵盐对其产酸的影响以及培养基的优化；（3）分批补料发酵法对广式米醋总酸度的影响及分批补料发酵工艺的优化。

主要研究结果如下：（1）通过分离纯化、产酸定性试验筛选出8株产醋酸菌，通过产酸定量试验得到一株醋酸高产细菌，模拟生产条件下8天产酸量在4.40g/100mL左右，通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA鉴定证实为葡糖醋杆菌属的木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）并命名为RF4。

（2）以总酸为指标，研究结果表明：静置发酵与摇床培养方式的产酸量分别为4.40g/100mL和3.20g/100mL，静置发酵方式的产酸量远远高于摇床培养，该菌最适酒精度为5.0%（v/v），最适葡萄糖浓度为7.0%（m/v），酵母粉为1.5%（m/v）时有利于木醋杆菌RF4的产酸代谢，磷酸氢二钠及硫酸铵最适添加量为0.7%（m/v）与0.9%（m/v）。

通过正交优化，培养基最佳配比为葡萄糖3%（m/v），无水乙醇5%（v/v），酵母粉0.5%（m/v），磷酸氢二钠0.9%（m/v），硫酸铵0.5%（m/v）。

（3）研究了分批补料发酵法对广式米醋总酸度的影响。

主要内容包括发酵过程中木醋杆菌RF4在发酵液及细菌纤维素膜内的菌落数分布、单批和分批补料发酵法总酸的变化规律及分批补料发酵法对总酸的影响。

醋酸菌的分离鉴定及冬枣醋饮料的研制的开题报告一、选题背景醋酸菌是一种能将乙醇氧化为醋酸的微生物，被广泛应用于醋的生产过程中。

目前，醋酸菌的分离和鉴定技术已经比较成熟，但是在醋的生产过程中，醋酸菌的选育和利用仍然存在着一些问题，如酸度不稳定、变异性大等。

因此，进一步研究醋酸菌的分离鉴定以及优化其利用方式对促进醋的生产具有重要的意义。

同时，随着人们生活水平的提高，市场对于新型饮品的需求量逐渐增加。

在此情况下，利用冬枣等特色农产品研发出具有健康特色的冬枣醋饮料，将有望满足市场需求并促进农业产业的发展。

因此，本文将以醋酸菌的分离鉴定和冬枣醋饮料的研制为主题，探究其相关技术和实现途径。

二、研究目的和意义1、研究醋酸菌的分离、鉴定和优化培养条件，为醋的生产提供技术支持。

2、探究以冬枣等特色农产品为原料，研制具有健康特色的冬枣醋饮料的相关技术，丰富饮料市场供给，促进农业产业发展。

三、研究内容1、醋酸菌的分离鉴定（1）选择适合的样品，进行分离鉴定。

（2）筛选、保留纯化的醋酸菌菌株，进行形态学特征和生理生化特性的鉴定。

（3）利用分子生物学技术对醋酸菌进行基因分型和系统发育分析。

2、醋饮料的研制（1）选择适合的冬枣作为原料，研究不同加工工艺对酸度、口感的影响。

（2）利用醋酸菌对冬枣等原料进行酸化处理，研制出口感适宜、具有医食同源健康特色的冬枣醋饮料。

三、研究方法1、醋酸菌的分离鉴定（1）样品的选择：从醋醅、果皮、土壤等多种来源中选取样品。

（2）分离并筛选醋酸菌：采用冷水浸泡法提取样品中的醋酸菌，采用PYE固体培养基进行分离和筛选。

（3）形态学鉴定：通过显微镜和孔径和散射仪对醋酸菌的形态学特征进行观察和描述。

（4）生理生化特性的鉴定：使用大量常规生化试验进行鉴定。

（5）分子生物学技术分析：通过PCR技术、序列比对和系统发育分析，对醋酸菌进行基因分型和系统发育分析。

2、醋饮料的研制（1）原料的选择与加工：选取高品质的冬枣，分别考虑蒸馏法、高温发酵法和自然发酵法等不同工艺对其的影响。