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结核病实验室诊断技术2017.10.13

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肺结核诊断标准2017

肺结核诊断标准2017


报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察 100个视野， 3+、 4＋时至少观察50个视野。

不典型抗酸菌（如：颗粒体、丝状体、巨球体 等），按实际观察情况描述报告结果。例如：萋尼氏染色阳性颗粒体（2＋）。

3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 3.4.3 结核病病理学检查 典型的结核病变由融合的上皮样细胞结节组成， 中心为干酪样坏死，周边可见郎罕多核巨细胞， 外层为淋巴细胞浸润和增生的纤维结缔组织。

3.4.1 细菌学检查 a) 涂片显微镜检查阳性 b) 分枝杆菌培养阳性，菌种鉴定为结核分枝杆 菌复合群





萋-尼氏染色抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视 野，未发现抗酸杆菌； 萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性 抗酸杆菌菌数： 1～8条 /300视野； 萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（1＋）： 3～9条/100 视野，连续观察300个视野； 萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（2＋）： 1～9条/10视 野，连续观察100个视野； 萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（3＋）： 1～9条/1视野； 萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条/1视野。

3.1 流行病学史 3.2 临床表现 3.2.1 症状 3.2.2 体征


3.3 胸部影像学检查 3.3.1 原发性肺结核 3.3.2 血行播散性肺结核 3.3.3 继发性肺结核 3.3.4 气管、支气管结核 3.3.5 结核性胸膜炎

3.4 实验室检 3.4.1 细菌学检查 3.4.2 分子生物学检查 3.4.3 结核病病理学检查 3.4.4 免疫学检查 3.5 支气管镜检查

结核病实验室诊断技术介绍

结核病实验室诊断技术介绍

1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。

1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。

目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。

1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。

扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。

目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。

目前在国内区县级应用评估。

1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。

直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。

夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。

夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。

1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。

同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。

2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。

虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。

2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。

结核病实验室诊断ppt课件

结核病实验室诊断ppt课件

结核病细菌学实验室 在国家结核病控制规划（NTP)中 起到举足轻重的作用
应当得到各级政府、领导和有关单位 的高度重视！
分枝杆菌生物学概述
分枝杆菌属裂殖菌纲，放线菌目，种类甚多，目前已命名
的有50多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。
结核分枝杆菌是1882年郭霍（Robert Koch）从肺结核
5
置37C温 箱培养
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养阳 性率较高；
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟，否则 影响阳性率；
涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产生气溶 胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方可报告 阳性。
细 胞 质
是带粘滞性的液体，充满了细胞膜内的整
个空间。 细胞浆内含有核糖体及其他多种颗粒。 功能： 细胞合成蛋白质和核酸等生命活性物质 的 场所 细菌对营养物质进行同化作用和异化作 用的场所
核 质
由单一双股DNA组成。 电镜下由极细的纤维物质所组成，
与细胞质不分开，无核膜、核仁。
操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；
快速，数小时可报告结果。
痰涂片镜检的缺点
敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌 才可得到阳性结果； 特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不能区分结 核和非结核分枝杆菌； 镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。
分离培养的重要意义
革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌为淡兰 色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光染色镜下的 抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。
抗 酸 性
分枝杆菌不易着色，一旦着色可以抵抗盐酸酒精的脱色， 称为“抗酸性”。 抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的 细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。

结核病的实验室诊断方法

结核病的实验室诊断方法

结核病的实验室诊断方法结核病实验室检查主要有；涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定、分枝杆菌基因分型、分枝杆菌血清学及核酸扩增检测等。

细菌学检查细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量。

正确地采集、转送标本，是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提。

各种标本(痰液、血液、伤口分泌物和各种感染组织等)采集时应充分考虑到选择恰当合理的时问，考虑到可能存在的病原菌的性质，按要求采集标本，这样可使标本包含细菌，并为后续检验步骤打下良好的。

合格的痰标本在低倍镜视野里上皮细胞应<10个，白细胞数应>25个。

涂片染色显微镜检查根据我国结核病防治规划的要求，对咳嗽、咳痰>13周或有咯血或血痰的肺结核可疑症状者，应留取3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)进行痰涂片抗酸染色检查。

即时痰为病人就诊时咳出的痰液：清晨痰为清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前1天晚睡前咳出的痰液。

留取的痰液标本常规涂片后，进行要尔－尼尔逊氏染色法(ziehl-Neelen)染色。

分枝杆菌分离培养结核分枝杆菌是兼性需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH为6.5～7.2。

分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。

是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的。

当前，我国普遍采用改良L-J(改良罗氏)培养基来分离培养结核分枝杆菌。

通常情况下，当每1ml标本中微生物含量达102～3CFU(菌落形成单位)时，即可培养阳性。

分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪(MIGT、BacT/A1err、ESP)，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。

在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的祛污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。

孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。

分枝杆菌药物敏感性试验分枝杆菌药物敏感性试验对于结核病人合理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有积极的作用。

结核病实验室诊断技术

结核病实验室诊断技术

细胞免疫学技术：T-SPOT.TB（Oxford Immunotec公司）
新型诊断技术产品比较
企业
美国 Cepheid
方法
GeneXpert
产品特点
同时检测MTBC和判断利福平耐药； 快速；简便；安全
比利时 Innogenetics
德国 Hain Lifescience
线性探针杂交法 （INNO-LIPA）
目前诊断方法回顾
细菌学检测方法 ： 涂片、常规培养、快培 其他辅助检查方法：皮试、结核抗体
目前诊断方法的局限性
涂片的缺点： 敏感性低；
特异性差；
无法区别死菌与活菌 培养的缺点： 耗时久，一般需4~8周； 阳性率低，约30%~50%；特异性差， 无法区别MTB与NTM
皮试的缺点： 敏感性低特异性差
抗体检测缺点：敏感性低特异性差
GenoType MTBDR and MTBDRplus；INNOLiPA Rif.TB Frane; LW Scientific; Zeiss 诊断结核感染及对利福 平和异烟肼药物敏感性 诊断结核患者
自动化检测和MDR筛 选实验（2010年）
Cepheid GeneXpert
诊断结核感染及对利福 平的耐药性
总结
目前结核病的实验室诊断主要依赖于常规的结核病 实验室诊断方法，可应用的方法有限，不能满足临 床需要。 新的实验诊断技术可弥补传统方法的不足，提高诊 断的灵敏度和特异性，但各有缺点或不足，难以完 全满足临床检测需求，因此，新型结核杆菌诊断技
术及产品的研发势在必行。

WHO推荐的结核新诊断技术
方法 DNA微阵列芯片法 商品 检测目的
生物结核分枝杆菌耐 诊断结核感染及对利 药基因检测试剂盒 福平和异烟肼的药物 敏感性 T-SPOT.TB; QFT 诊断结核感染

结核病实验室诊断技术

结核病实验室诊断技术

阴、 无 痰及 Ｌ型结核 菌的肺结 核病人则难以诊断 。Ｐ Ｐ Ｄ试验 、 血 清结 核抗 体检查对结核病 的诊断有一定参 考价值 ， 但 无法区分 Ｂ Ｃ Ｇ接种 、 既往感染 和正在感染 ， 而且其 灵敏性和特异性不理想 。随着 分子生 物学技 术 的发展 ， 基因诊断技术 因具有较高 的敏感性 、 特异性而 日益显示其优越性 。 目前用 于结核 分枝 杆菌诊断 的方法有聚合酶链反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ） 、 Ｄ Ｎ Ａ探针技 术 、 基 因芯片技术 。Ｐ Ｃ Ｒ技术具 有快速 、 特异、 灵 敏和 可无培 养依赖性特征 。Ｄ Ｎ Ａ探针技术用于结核病 的诊 断 ， 及进行菌种鉴定 与分类 。Ｄ Ｎ Ａ序列 测定 不但 为结 核病 的诊断和鉴别诊断提供准确病原学依据 而且 作为鉴定结核分枝杆菌耐药基 因突变 的重 要手段。基因芯片 法（ Ｇ Ｃ Ｔ ） 具有高效率 、 微 型化 、 自动化 、 成本低 、 防污染 等特 点。总之将这些诊断方法不断进行改进 。在临 床工作 中将各种诊断技术有机 的结 合 ， 综合分析 ， 合理 的为临床服务 ； 从而做出正确 的诊断 ， 以使结核病能
的 检 测 方 法 较 常 用 的有 ： 斑点金免疫金渗滤试验 （ Ｄ Ｉ Ｇ Ｆ Ａ） ， 是
一
、
痰涂片镜检 、 痰 结 核 菌 培 养 法
结核病 的 实 验 室诊 断 主要 依 赖 细 菌 学 涂 片 和 培 养 检 查 Ｊ ， 痰样本涂 片抗酸 染色 显微 镜检 查 和痰 抗酸 杆菌 培养 ， 是结 核病实验室诊断的主要方法 。具有简便 、 快速 、 价廉 等特 点， 对结核病早期诊 断起着 重要作 用 。痰样本 涂 片检查无 法 区分死 菌 和 活 菌 ， 且 敏 感 性低 ， 阳 性检 出率 约 为 １ ９ ． ９ ％ 一 ３ ５ ％ 。目前杨松等 研究临床报道较 高 的也 只有 ３ ６ ． ４ ％。

结核病实验室诊断技术PPT课件

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结核病实验室诊断技术
医者人之司命，如大将提兵，必谋定而后战。
开始啦！请将手机调成静音，如有疑问可以随时打断我！
3
结核病 — 全球的公共健康问题（2018报告）
全球范围内，结核病是导致死亡的十大原因之一，每年有数百万人患上结核病。2017年， HIV阴性人群中，结核病导致约157万人死亡;而且在HIV阳性人群中，也有30万人死于结核。 2017年，估计有1000万人新感染结核:中国估计有88.9万人新感染结核。
• 菌株是革兰氏阳性菌，很难被染色，有 些甚至不能被染色，细胞壁含60%脂质， 一般用萋尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
• 棒状，无运动能力，专性需氧 • 生长缓慢 • 每16-20小时分裂一代，需4-6周才能长成
菌落。 由于结核分枝杆菌的遗传特性决定其生长
周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵 敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素 较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发 展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。
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抗原MPT-64
耐多药 泛耐药
细菌学检查
• 结核病人的细菌学检查不8 仅是发现传染源的主 要途径和手段，也是结核病确诊和制订化疗方 案，考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。
• 涂片法 抗酸染色 荧光染色 液基夹层杯
• 培养法 改良罗氏培养 液体培养（BD960)
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细菌学检查-涂片法
抗酸染色
总体而言，90%的结核患者是成年人(≥15岁);9%同时伴随HIV感染(其中有72%是在非洲); 三分之二的结核患者来自8个国家:印度(27%)、中国(9%)、印度尼西亚(8%)、菲律宾(6%)、 巴基斯坦(5%)、尼日利亚(4%)、孟加拉国(4%)和南非(3%)。全球病例中只有6%出现在欧洲 地区(3%)和美洲地区(3%)。

结核病的实验室诊断方法及评价

结核病的实验室诊断方法及评价

耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。

耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。

因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。

1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。

其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。

2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。

3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。

基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。

多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。

这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。

由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。

结核病诊断技术

结核病诊断技术

第2章实验室检验技术结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。

结核病细菌学检验主要包括4项基本技术，即涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定。

检验人员应依据临床医师检验申请要求并结合实验室的设备和技术条件，负责对标本进行检验，及时、准确地填写检验报告。

近年来，国内、外研究者在分子生物学、分子微生物学及免疫学领域建立了若干快速、敏感、特异的检测新技术，为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来了新的希望。

列入“规范”的结核杆菌临床基因扩增(PCR)检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学检测技术，因有多种试剂盒(试剂)及分析仪器可供选择，目前尚难制定统一的技术操作规范，故暂定为辅助操作技术。

具备开展这些技术项目条件的实验室(或检验科)，须经有关主管部门批准后，严格按照相应技术所附的说明书与操作规程实施。

鉴于结核病实验室检查，特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施，制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病实验室的质量控制督导和培训。

第一节结核茵检验实验室安全操作规则结核病细菌学实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室工作人员得到充分的防护，并避免造成环境污染。

1．实验室应有合理布局及合适的单向(外排)通风体系。

2．实验室应配备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。

分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等。

3．实验室工作人员应按正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等。

4．实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理。

5．建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等。

6．进行下列操作时应严格按照技术操作规范，防止产生细菌气溶胶：①涂片制作；②培养液的倾倒和转移；③高速混合含菌液体；④滴加、接种培养物；⑤吸管稀释和混合菌悬液；⑥取样器和振荡器的使用；⑦细菌细胞超声粉碎；⑧感染动物实验等。

结核病的实验室诊断分析

结核病的实验室诊断分析

率较高，此技术已趋向淘汰
瓶外检测技术
瓶内检测技术 易导致污染及生物安全问题
15－21天
不详
无药敏试剂提供
只有3种一线药物
BACTEC ? MGIT? 960/320
指示器系统
阴性培养2 O2
CO2 O2 CO2
O2 O2
FFFOOF22OFF2FOO22FFFOO22
? 1882年由德国医生Koch发现。 ? 结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌
纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝 杆菌属。 ? 分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、 非洲型和田鼠型，而人型结核分枝 杆菌是人类主要的致病菌。
2018/6/17
GDTB
8
结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1. 细胞壁中含有大量 脂质 2.引起的疾病都呈慢性， 并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
生长特点：
生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内 约需要15～20小时，在静脉感染未经 免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬 细胞内约需要15～20小时，在家兔角 膜中约需要20～22小时。
实验室检查方法的历史
1880s
1900s 1920s
1930s 1940s 1950s
Tubercle bacilli 的发现 Ziehl-Neelsen 染色方法 Mantoux test (TST with tuberculin) Petragnani medium Purified Protein Derivative （PPD ） Lewenstein-Jensen 培养基 Dubos agar, Ogawa 培养基 Middlebrook 7H9
结核病的实验室诊断
主要内容
1 结核病的流行情况 32 结核病的病原学 3 结核病的实验室诊断 34 结核病的分子药敏

结核病的实验室诊断

结核病的实验室诊断
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
灵敏度
Reference Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53 Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34* Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30* Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50* Meier et al EJCMID 2005 24;529-536 Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65* Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8 Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44. Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8* Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703 Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56* Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71* Chee et al J Clin Microbiol. 2008 Apr 9* Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8* Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8 Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9 Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259 Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624* Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34* Kobashi et al. J Infect. 2008 [Epub ahead of print].* Domí nguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008.* [Epub ahead of print] Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.* Bosshard et al. Respir Med. 2008. [Epub ahead of print] Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. [Epub ahead of print]* TOTAL Sensitivity 100.0% (12/12) 83.3% (20/24) 96.6% (84/87) 91.3% (21/23) 95.9% (70/73) 92.2% (59/64) 98.3% (57/58) 90.0% (27/30) 92.9% (26/28) 92.9% (26/28) 80.8% (80/99) 85.7% (36/42) 94.1% (254/270) 84.6% (11/13) 87.2% (34/39) 100.0% (10/10) 100.0% (22/22) 100.0% (9/9) 87.5% (42/48) 90.0% (36/40) 84.2% (32/38) 89.9% (62/69) 98.4% (62/63) 95.9% (47/49) 92.0% (1139/1238)
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• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
分枝杆菌培养适用标本
• 痰液：脓性、干酪痰、褐色血痰、或含少量新鲜血液的 血痰、黏液痰为合格标本
• 脑积液 • 胸腹水、滑膜液 • 支气管灌洗液 • 坏死组织、穿刺物 • 尿液 • 大便
分支杆菌的菌落形态（MTB）（L-J）
分支杆菌在罗氏培养基中的形态（NTM）
分支杆菌在MGIT960培养物的形态 （MTB)
结果报告-比例法
计算耐药百分比：
含药培养基上生长的菌落数 • 耐药百分比= -------------------------- ----------- × 100%
对照培养基上生长的菌落数
• 若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结 核药物耐药 （R）
结核分枝杆菌药敏试验的方法（基于表型）
• 焦磷酸测序法： 仪器昂贵 要求样本菌株纯度高-纯菌种
• PCR-反向点杂交法: 仪器相对便宜 可对同一样本混合菌株同时鉴定 目前可鉴定的菌种17-24种
结核分枝杆菌药敏试验-菌种鉴定
临床数据
1. 2016年湖南省胸科医院分枝杆菌分离情况
方法
菌株数
MTBC
NTM
MGIT 960法
4856
4415 90.9% 441 9.1%
物的鉴定 优点：快速，15分钟出结果；敏感度99%，特异性98.9% 结果解释：阳性-结核分枝杆菌复合群，注意可能存在非结
核分枝杆菌，阴性-部分MPB64基因缺失MTB菌株及非 结核分枝杆菌。
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
基于结核分枝杆菌特异分泌蛋白 MPB64抗原的快速检测鉴定技 术
结核分枝杆菌药敏试验-菌种鉴定（基因检 测）
结核分枝杆菌药敏试验-MGIT960法
特点：全自动、全封闭； 快速、样本量 大； 联合 （SIRE）药敏，可进行 PZA药敏试验；结果仪器 自动判读。
结核分枝杆菌药敏试验-MGIT960法
结核分枝杆菌快检测系统 （BACTEC960系统）
结核分枝杆菌药敏试验-固体培养基
• 纯培养、生长活跃的结核菌作为测试 (2 – 4 周). 如果生 长不充分 (少于20 菌落, 1+), 不能很好的解释DST结果
传感器
无荧光或弱荧光
阳性培养
O2 O2
O2
O2
O2 CO2
FFOF2
F F
F
F FFO2 F
强荧光
分枝杆菌分离培养-MGIT960法
优点
• 快速 4-15天培养阳性 • 灵敏 培养阳性率高于L-J法 • 简便 操作简便、自动化检测
缺点
• 无法观察菌落形态 • 污染率略高于罗氏培养 • 仪器与试剂价格较贵 • 无法区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌
• 研究表明：任何一个单一的抗原检测患者的 抗体反应是针对许多结核分枝杆菌抗原的
免免疫学诊断方法-体液免疫（抗体）
免疫学诊断方法-体液免疫（抗原）
• SFDA批准的只有两种试剂 • 杭州创新和济南杏恩 • 快速检测结核抗原MPT64（标本：培养物） • 金标法
3. DST自身问题
DST临界值的确定； DST的标准化不同； DST技术的差异 DST药品质量及培养基中药物稳定性
免疫学诊断方法-体液免疫（抗体）
• 结核患者免疫功能不同而导致对结核分枝杆菌抗原识别 的差异
• 结核患者对抗原的识别差异存在阶段特异性（结核菌潜 伏感染期、结核病非活动期、活动不排菌期等）
4
9
新金分枝杆菌
3
10
外来分枝杆菌
3
11
三重分枝杆菌
3
12
马赛分枝杆菌
2
13
亚洲分枝杆菌
2
14
堪萨斯分枝杆菌
2
25.23 24.62 18.62 18.62 2.70
1.5 1.5 1.2 0.9 0.9 0.9 0.6 0.6 0.6
结核分枝杆菌药敏试验-基于固体罗氏培养 基础上的方法
1.绝对浓度法（中国防痨协会推荐）： Meisnner， 1963
2.比例法（WHO推荐方法） Canetti , 1963
临界药物浓度（单个药物浓度度μg/ml ） ）：SM 4；INH0.2； RFP40；EMB2；PAS1；OFX2；KM30；AMK30；CPM40； TH1321 40 临界菌群比＝耐药菌群数/全菌群数（ 1% ）
菌液浓度10-2mg/ml， 10-4mg/ml，接种量0.01ml
分支杆菌培养方法
• 培养方法：固体培养（改良罗氏培养基（L-J）；液体 培养（MGIT 960）
• 原理： 1.标本经过消化液（ 4%NaOH ）处理杀灭杂菌，分枝杆
菌由于具有对强酸强碱的耐受性仍保留活性，根据在专 用培养基上的生长情况，判断标本中是否含有分枝杆菌 2. Bactec MGIT 960系统原理将荧光物质包埋在7H9液体 培养管的底部，分枝杆菌生长过程中，O2被消耗，底物 产生荧光，仪器通过测定荧光强度，用生长指数来表示 测定结果，培养时间通常需要7~42天。
about 50,000
90
• 1-9 in 1 field
about 100,000
96
• ≥ 10 per field
about 500,000
99.95
指导患者留痰后对涂片显微镜检查结果的影响 [in Indonesia Setting]
Alisjahbana B et al, Int J Tuberc Lung Dis 2005, 9: 814
Patients
- ZN positive - 1st sputum positive - 2nd sputum positive - 3rd sputum positive
Control n = 93
35 % 26 % 31 % 27 %
Instructed n = 81
51 % 46 % 40 % 41 %
痰涂片检查的优点
1.痰涂片检查作为传染性肺结核诊断的准确性高于X线检查 2. 痰涂片检查技术简单、容易标准化 3.痰涂片检查投入设备投入少 4.痰涂片检查成本低廉，易于接受 5.痰涂片检查报告结果的时间短,满足临床诊断需要 6.痰涂片检查及时和准确评价涂阳患者的治疗效果
痰涂片检查的缺点
1.特异性差：无法结核分支杆菌与非结核分枝杆菌 2.无法区别死菌与活菌。 3.敏感性低：直接涂片法5000—10000条菌／ml
结核病实验室诊断技术
湖南省结核病防治所 易松林
2017.10.13
结核病实验室诊断技术
• 分枝杆菌涂片检查 • 分枝杆菌分离培养 • 分枝杆菌分子生物学诊断 • 结核分枝杆菌免疫学诊断
分枝杆菌涂片检查
• 直接涂片检查法
1.试剂：萋苨氏染色法：石炭酸复红染液（8%），盐酸
酒精（5%），美兰染液（%）；荧光染色法：金安O染 液，盐酸酒精，复染液（高锰酸钾） 2.操作流程：标本送检（三份痰标本：晨痰、及时痰、夜 间痰）-涂片（20*30mm卵圆形痰膜）-染色-镜检-报告
• SD BIOLINE AG MPT64
免疫学诊断方法-细胞免疫
γ -干扰素释放试验（IGRA）
T淋巴细胞分为效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞。记忆 T淋巴细胞在首次感染结核杆菌后长期存在 ,当再次受 到结核杆菌相关抗原刺激后 ，这些记忆T淋巴细胞迅速 增殖成为效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞分泌细胞因子, 如γ-干扰素(IFN-γ)。通过定量检测释放的IFN-γ的 水平或可以有效释放IFN-γ的细胞，可以对结核杆菌感 染情况做出判断。
分支杆菌MGIT培养物的形态（MTB)
分枝杆菌快检测系统（BACTEC960 系统）
特点：全自动、全封闭、快速、样本量 大 原理：分枝杆菌对NaOH的耐受性；分 枝杆菌在液体培养基生长更快，添加了 丰富的营养物质；分枝杆菌生长耗氧， 荧光增强，仪器自动探测荧光的变化。 试剂组成：MGIT培养管、MGIT生长 添加剂、PANTA杂菌抑制剂、SIRE药 敏试剂。 标本适用范围：除血液标本以外的所有 标本