手性醇脱氢酶与甲酸脱氢酶的融合蛋白体系的构建_吴希

酶-化学级联催化制备(S)-烟碱刘茜琳;高静;马丽;宋浩雷;贺莹;郑晓冰【期刊名称】《精细化工》【年(卷),期】2024(41)1【摘要】传统(S)-烟碱合成方法步骤复杂且依赖多种化学催化剂。

为了实现(S)-烟碱的绿色合成,设计了酶-化学级联途径:首先,构建了亚胺还原酶(IRED)与甲酸脱氢酶(FDH)的偶联体系,以麦斯明为底物合成(S)-降烟碱;然后,将(S)-降烟碱经Eschweiler-Clarke反应制备(S)-烟碱。

通过大肠杆菌宿主分别对IRED和FDH进行表达,得到含酶细胞及酶液,考察了pH和温度对细胞中IRED和FDH酶活力的影响。

优化酶催化制备(S)-降烟碱的反应条件,在30℃、pH 7.5条件下,添加质量浓度为30 g/L的麦斯明、600 U/L FDH细胞、900 U/L IRED细胞、0.6 mmol/L NADP^(+)和质量浓度为90 g/L的甲酸钠,(S)-降烟碱的产率>98%,对映体过量(e.e.)值>99%。

最后,通过化学法将(S)-降烟碱甲基化得到(S)-烟碱,此步骤产率和e.e.值均达99%以上。

【总页数】10页(P127-136)【作者】刘茜琳;高静;马丽;宋浩雷;贺莹;郑晓冰【作者单位】河北工业大学化工学院;河北亚诺生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】TQ203.2【相关文献】1.化学/酶复合催化法制备生物基化学品研究进展2.木质素制备燃料电池阴极电催化炭材料研究(Ⅱ)——改性酶解木质素炭的化学结构演变3.中国科学家使用酶-化学级联催化高效生产L-高苯丙氨酸4.类普鲁士蓝纳米酶材料的制备及其酶催化反应动力学探究——推荐一个分析化学综合实验因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专利名称：一种手性组装体及其制备方法专利类型：发明专利
发明人：孟德静,吴晓春
申请号：CN202010174620.2
申请日：20200313
公开号：CN111299569B
公开日：
20220222
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种手性组装体及其制备方法，所述手性组装体包括肩并肩排列的核壳结构的纳米棒颗粒以及设置在核壳结构的纳米棒颗粒表面的连接层；该手性组装体利用空间分离的方法将手性组装层中的手性驱动层与负责组装的组装层在空间上互相分隔，更好的构筑手性单元，达到更加稳定的组装体以及PCD信号；手性组装体的制备方法简单，原料易得，价格低廉，便于实现。

申请人：国家纳米科学中心
地址：100190 北京市海淀区中关村北一条11号
国籍：CN
代理机构：北京品源专利代理有限公司
代理人：巩克栋
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亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶共表达菌株发酵产酶条件优化及其在L-2-氨基丁酸合成中的应用徐建妙;陈策;张博;柳志强【摘要】亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建Escherichia coli(LeuDH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生.通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率.结果表明,在5L发酵罐上,在诱导温度为22℃、诱导剂乳糖质量浓度为8.0 g/L和诱导时间为17 h的条件下,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活分别达到79.2 U/g和216.1 U/g,催化效果最佳.利用该菌株全细胞为催化剂,耦合苏氨酸脱氨酶,在1L反应体系中进行了催化反应,L-苏氨酸质量浓度为180 g/L时,无需额外添加辅酶,8h反应后底物转化率达到99％,L-2-氨基丁酸e.e.值99.5％以上,时空产率19.3 g/(L· h).该研究为建立高效、低成本的L-2-氨基丁酸工业化生产方法提供了基础.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)010【总页数】7页(P29-35)【关键词】L-2-氨基丁酸;亮氨酸脱氢酶;甲酸脱氢酶;共表达;优化【作者】徐建妙;陈策;张博;柳志强【作者单位】浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州,310014【正文语种】中文L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyric acid, L-ABA)在化工、医药等领域具有广泛的用途，作为手性医药中间体可用于合成抗癫痫药物左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇[1-2]。

目前，L-2-氨基丁酸的生产主要有化学法和生物法两大类。

化学法主要有化学拆分法[3-4]和化学合成法[5-6]。

乙醛脱氢酶的克隆表达及其酶学性质豆欣喜;张明;林材;吴殿辉;李晓敏;孙军勇;蔡国林;陆健【摘要】The target gene ALDH2 was synthesized according to the sequences of human acetaldehyde dehydrogenase 2 in GeneBank after codon optimization of Saccharomyces cerevisiae.Then the ALDH2 gene expression cassette TRP1 L-URA3-TPIp-ALTH2-TPIt-TRP1 R was constructed using fusion PCR and electro-transformed into S.cerevisiaeW303-1A to produce the modified strain W303-ALDH2.The recombinant ALDH2 was obtained after purification by His TrapTM excel affinity chromatography,and its molecular weight and activity was 56 kDa and 20.70 U/mg,respectively.The results showed that the optimal reaction pH value and temperature for recombinant ALDH2 were 5.0 and35 ℃,respectively.Except Na +,the K +,Ca2 +,Mg2 +,Mn2 + could i ncrease the activity of ALDH2 in different degrees.When acetaldehyde was used as substrate,the Km value and maximum reaction rate Vmax of recombinant ALDH2 was 0.908 mmol/L and 114.94 U/mg,respectively.When NAD + was used as substrate,the Km value and maximum reaction rate Vmax of recombinant ALDH2 was 0.282 mmol/L and 58.82 U/mg,respectively.%将GeneBank中人源乙醛脱氢酶2的基因序列根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的密码子偏好性进行密码子优化后合成目的基因ALDH2,采用融合PCR技术,构建人源ALDH2基因的表达组件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R.通过电转化的方法将基因表达组件通过同源重组整合到酿酒酵母W303-1A的基因组上,获得基因工程菌W303-ALDH2.工程菌发酵后的粗酶液经HisTrapTM excel亲和层析柱纯化获得重组AL-DH2,其活性为20.70 U/mg;重组酶的相对分子质量是56 kDa;最适反应pH和温度分别为5.0和35℃;除Na+外,K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能不同程度地提高ALDH2的酶活.以乙醛为底物测得酶的Km值为0.908 mmol/L,最大反应速度Vmax为114.94 U/mg;以辅酶NAD+为底物测得酶的Km值为0.282 mmol/L,最大反应速度Vax为58.82 U/mg.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)004【总页数】7页(P22-28)【关键词】人源乙醛脱氢酶2;酿酒酵母;克隆表达;酶学性质【作者】豆欣喜;张明;林材;吴殿辉;李晓敏;孙军勇;蔡国林;陆健【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江苏省农垦麦芽有限公司,江苏射阳,224300;华润雪花啤酒有限公司,河北秦皇岛,066001;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122【正文语种】中文乙醇在人体内的代谢主要靠体内的2种酶[1]，一种是乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases, ADH, EC1.1.1.1)，将乙醇氧化成乙醛；另一种是乙醛脱氢酶(Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH,EC 1.2.1.10)，将乙醛氧化成乙酸。

Pseudomonas sp.101甲酸脱氢酶基因的合成、表达及定点饱和突变李天明;朱灵桓;刘天佳;戴宝新;冯惠勇【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)005【摘要】甲酸脱氢酶(FDH)是氧化还原酶辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的关键酶,具有重要的应用价值和产业化应用前景.通过采用重叠延伸PCR技术,人工合成编码FDH的基因fdh,构建原核表达载体pET30a-fdh,以E.coli BL21(DE3)为表达宿主,获得了能可溶性表达的甲酸脱氢酶的重组菌；经16℃IPTG诱导表达,重组酶的比活力为8.7 U/mgPro；为了提高FDH的稳定性,采用融合PCR方法对fdh基因进行了定点饱和突变,经筛选,获得了酶活未变但稳定性有所提高的突变酶Cys 146AlaCys354Ala,其稳定性比野生酶提高了2.5倍.【总页数】6页(P105-110)【作者】李天明;朱灵桓;刘天佳;戴宝新;冯惠勇【作者单位】河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;大连工业大学生物工程学院,大连116034;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018;河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018【正文语种】中文【相关文献】1.乳酸脱氢酶突变体D-LDHY52L在大肠杆菌中的重组表达及其合成D-苯基乳酸的研究 [J], 蒋卓越;季伟;钱蓓蓓;朱益波;齐斌2.人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析 [J], 陈熙;陈毓;齐小雨;张炜3.恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因克隆、可溶性表达及突变体活性分析 [J], 徐小玲;杨瑞仪;杨雪芹;冯丽玲;曾庆平4.拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得 [J], 陈荣荣;曹高燚;刘允军5.硒蛋白X基因克隆、定点突变、原核表达及多克隆抗体制备 [J], 赵华;汤加勇;曹蕾;周继昌;贾刚;刘光芒;陈小玲;王康宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

固定化双酶耦联体系制备手性胺任红;郭敏杰;霍鹤宇;姚光晓;王世珍【摘要】胺脱氢酶(amine dehydrogenase,AmDH)能够在辅酶的作用下不对称还原前手性酮制备手性胺,并与甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)构建耦联双酶反应体系,通过酶活检测与高效液相色谱法得出,AmDH和FDH浓度比为4:1、底物浓度为10 mmol/L、辅酶浓度为0.025 mmol/L时,是游离双酶耦联体系最优反应条件.为提高双酶耦联体系的稳定性,将聚乙烯亚胺-双酶复合物作为模板和催化剂,诱导钛前驱体Ti-BALDH(titanium(IV) bis-(ammoniumlactato)-dihydroxide)缩聚,形成固定化耦联体系.与游离酶体系相比,辅酶可在固定化酶体系的微环境中高效循环再生,大大提高了多酶耦联体系的催化效率.【期刊名称】《深圳大学学报（理工版）》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】7页(P354-360)【关键词】生物催化;胺脱氢酶;甲酸脱氢酶;手性胺;双酶耦联体系;固定化酶;聚乙烯亚胺【作者】任红;郭敏杰;霍鹤宇;姚光晓;王世珍【作者单位】厦门大学化学化工学院,福建厦门361005;厦门大学化学化工学院,福建厦门361005;厦门大学化学化工学院,福建厦门361005;厦门大学化学化工学院,福建厦门361005;厦门大学化学化工学院,福建厦门361005;厦门市合成生物学重点实验室,福建厦门310065【正文语种】中文【中图分类】Q814手性胺是香料、医药和有机合成工业的重要中间体[1]．手性胺不同对映异构体的立体结构的差异使不同的手性对映体的活性不同，作用于生命体时表现出的生理活性和毒害作用也不同[2]．因此，手性逐渐成为检验药物安全性和药效的重要因素，单一手性对映体药物的比例逐年上升[3]．手性胺的制备方法主要有化学法和生物催化法，与传统的化学催化剂相比，生物酶催化剂对手性分子的两种对映体具有天然的识别能力，使生物催化技术在手性药物选择性合成中具有显著的优势[4-5]．此外，生物催化还具有高效、高选择性、条件温和以及环境友好等优点．胺脱氢酶(amine dehydrogenase, AmDH)能够在辅酶的作用下催化前手性酮和游离氨不对称合成手性胺的，而催化反应过程需要辅酶作为电子传递体参与反应，可以使该反应与辅酶再生系统耦联，如葡萄糖-葡萄糖脱氢酶或甲酸盐-甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH)系统．CHEN等[6]构建了双酶耦联级联反应，利用亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)为模板定向设计获得突变体K77S/N270L与醇脱氢酶耦联合成手性胺．YE等[7]利用PheDH作为骨架进行酶改造获得的AmDH与葡萄糖脱氢酶耦联制备手性胺，其产物对映体选择性可达99%(对映体过量值)．酶有一般化学催化剂难以匹敌的优点，但仍有一些缺点令它难以在工业生产中广泛使用，其中影响最大的就是酶的稳定性较差．将酶蛋白进行固定化不仅能够提高酶的稳定性，且能够回收重复使用酶蛋白．仿生合成也称模板合成[8]，是模拟生物矿化中生物矿物的形成过程，选择有机物作为模板，在模板的诱导或调控下生成无机物的一种合成方法． 2003年，SUMEREL等[9]首次将硅蛋白(silicatein)用于氧化钛的合成中，结果发现，硅蛋白能作为催化剂诱导钛前驱体二(2-羟基丙酸(二氢氧化二铵合钛))(titanium(IV)bis-(ammoniumlactato)-dihydroxide, Ti-BALDH)的水解和缩聚，并生成无定形的氧化钛，该研究开启了仿生钛化的新篇章．近年来，已有诸多有关基于仿生钛化的有机-无机杂化层层自组装的研究成果应用于酶的固定化方面[10-12]．支链聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)携有大量带正电的氨基，能够通过静电引力和氢键催化钛前驱体和硅前驱体缩聚，因此，可以用于仿生钛化[8,13-14]．本文分别研究了游离AmDH-FDH耦联体系和仿生钛化的AmDH-FDH制备手性胺，旨在探究一种辅酶循环效率高的多酶耦联体系．1 材料与方法1.1 菌株培养及纯酶制备所用菌株为实验室保存的表达AmDH(源自Bacillus badius， GenebankD50261 436-1578)以及表达FDH(源自Candida boidinii， Genebank number AJ011046.2)的重组大肠杆菌．将菌种(接种体积分数量1%)接种到10 mL含50 μg/L卡那霉素的液体LB培养基中，于37 ℃、200 r/min下过夜培养．取体积分数为1%的培养菌液转接到100 mL含50 μg/L卡那霉素液体LB培养基中，37 ℃下培养2～3 h至光密度D(600)为0.6～0.8．加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度为0.1 mmol/L，25 ℃培养12 h后离心收集重组菌菌体．将菌体用PBS缓冲液冲洗两次后重悬制备菌悬液，用细胞超声破碎仪破壁后离心，上清液即为粗酶液．由于pET-28a(+)质粒带有His6-tag标记，使表达得到的AmDH与FDH带有His6-tag，因而选择GE公司的HisTrap HP柱进行纯化．纯化方法如下：首先用结合缓冲液进行预平衡10个Histrap HP柱体积，平衡后将蛋白样品注入Histrap柱，用结合缓冲液平衡20个柱体积，接着用洗脱缓冲液20 mmol/L的磷酸钠缓冲液(含0.5 mol/L氯化钠, 500 mmol/L 咪唑, pH=7.4)进行梯度洗脱，自动收集流出液，检测其酶活性，收集具有酶活性的纯化样品，以Millipore超滤管(截留分子质量为10 kDa，1Da=1 u)进行浓缩和脱盐后保存于4 ℃．1.2 胺脱氢酶与甲酸脱氢酶反应体系及活性检测AmDH和FDH分别是还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)和氧化型辅酶NAD+依赖型氧化还原酶，NADH在340nm波长附近有最大光密度值，因此，可通过检测辅酶NADH的消耗或生成速率来计算AmDH和FDH的活性．酶活力单位的定义：规定条件下，单位体积每分钟催化生成或消耗1 μmol NADH 所需酶量为1个酶活力单位(单位：U/mL)．酶活力单位=(VT ×ΔD ×K)/(ε×VS×L)(1)其中， VT 为反应液总体积； VS为抽提液样品体积；ΔD为每分钟光密度变化值；K为样品稀释倍数；ε为摩尔吸光系数，ε=6.22 L/(mmol·cm)； L为样品中的光程， L=0.5 cm．1.3 手性胺的催化合成与产物分析AmDH-FDH催化生成手性胺的反应体系包括：200 mmol/L的氯化铵-氨水缓冲液(pH=9.5)、20 mmol/L的苯氧基-2-丙酮、50 mmol/L的甲酸铵和0.05mmol/L的NAD+．将上述溶液置于冰上，以氨水调节体系pH=9.5，加入适量的AmDH与FDH，于30 ℃、200 r/min条件下反应，每隔一段时间取样保存于-80 ℃待分析．产物分析：将样品置于沸水浴中15 min后，于1.3×104g离心10 min去除蛋白质沉淀，加入等体积的正己烷萃取产物，摇匀，低速离心2 min，取上清，重复萃取3次，合并萃取液，以0.22 μm滤膜过滤2次后用于高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)分析．底物酮浓度和产物胺的浓度及光学纯度以Chiral CEL OD-H液相色谱柱进行分析．高效液相色谱条件为：流动相V(正己烷)∶V(乙醇)∶V(乙二胺)=90∶10∶0.1，柱温为35 ℃，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm．2 结果与分析2.1 胺脱氢酶的酶学性质及动力学性质氧化还原酶与辅酶再生酶的耦联体系中，耦联并不是单纯的混合，而是基于各个酶单独的反应条件，即基于酶的活性和稳定性等因素来选择多酶体系的反应条件；各个酶反应动力学参数的匹配，综合考虑酶浓度配比、辅酶与底物的配比，以及辅酶循环效率等因素．同时，还要考虑到底物抑制和产物抑制等限制因素．因此，本研究分别测定了AmDH与FDH的酶学性质及其动力学参数．利用HiSTrap HP柱对分别重组AmDH与FDH进行纯化得到纯酶，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析其纯度，结果如图1，两个酶的理论大小分别为41.5 kDa(ku)和42 kDa(ku)，电泳结果符合预期．图1 AmDH和FDH的SDS-PAGE分析结果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified AmDH and FDH图2为AmDH及FDH的最适温度及最适pH值的测定结果．实验结果表明，FDH的最适温度为30 ℃，而AmDH的最适温度为35 ℃．对于FDH而言，温度对活性的影响并不大，35 ℃时，其活性能够达到最适温度条件下活性的90 %，因此，对于耦联体系的温度，选择AmDH的最适温度，该条件下FDH也保持了较高的酶活力．通过实验研究pH值分别对AmDH及FDH酶活的影响，结果如图2(c)和(d)．由图2(c)和 (d)可见，两个酶均是在碱性条件下催化反应，AmDH 的最适pH=9.5，FDH的最适pH=8.0，两酶的最适pH值相近，有利于双酶耦联体系的构建．双酶参与的反应是在同一反应pH值下发生的，这意味着pH值的选择会牺牲掉某个酶的部分活力，本实验测定的FDH活性高于AmDH，且FDH在pH=9.5条件下仍能保持80%的最高活性．同时，耦联体系是以AmDH反应为主体，因此采用能够为体系提供游离氨的氯化铵-氨水缓冲液．耦联反应的催化条件为35 ℃，pH=9.5的氯化铵-氨水缓冲液．对纯化的AmDH及FDH分别以苯氧基-2-丙酮和甲酸铵为底物，测定2个酶的动力学参数．反应体系中苯氧基-2-丙酮的浓度为1.25～60 mmol/L，甲酸铵的浓度为1.25～100 mmol/L，在其他条件相同的情况下，测定不同底物浓度下的AmDH及FDH酶活力，根据Michaelis-Menten方程计算米氏常数Km和最大反应速率Vmax(表1)． Km是表征酶与底物之间亲和力的常数， Km越小，表示酶与底物之间的亲和力越大，即达到最大反应速率1/2时所需要的酶量越小；kcat表示在最优条件下酶催化生成底物的速率．在表1中，根据动力学特征计算得到AmDH底物苯氧基-2-丙酮的Km=18.49 mmol/L，Vmax=0.22mmol/(min·m L)，FDH底物的Km=13.1 mmol/L，Vmax=0.23mmol/(min·mL)．FDH的Km(NAD+)与AmDH的Km(NADH)数值相近，可以推测，在FDH与AmDH的耦联反应体系中，FDH对氧化型辅酶NAD+的需求量与AmDH对还原型辅酶NADH的需求量相当． kcat/Km的值是衡量一个酶催化效率的最重要参数，也是考虑了酶转化底物的最大速率与酶与底物之间亲和力的一个综合参数.图2 AmDH和FDH的酶学性质(以各自最高酶活力为100%计算)Fig.2 The enzymatic property of AmDH and FDH (calculated by the maximum activity of 100%)表1 AmDH及FDH的动力学参数Table 1 Kinetic parameters of AmDH and FDH酶底物Km/(mmol·L-1)Vmax/(mmol·min-1·mL-1)kcat/(min-1)kcat·Km-1/ (L·mmol-1·min-1)FDH甲酸铵13.100.2321.401.63NAD+0.090.043.7241.30AmDH苯氧基-2-丙酮18.490.228.820.48NADH0.070.053.7954.20根据文献[15]研究工作，测定了AmDH游离酶及固定化酶在不同温度下的稳定性(图3)，随着温度的提高，游离AmDH的失活速度越快． AmDH的稳定性不是很好，其游离AmDH在60 ℃下孵育5 min即失活；AmDH-PEI复合物的在60 ℃下孵育20 min仍可保存20%的活性，而AmDH-PEI-TiO2固定化酶则在60 ℃下孵育30 min仍可保存20%的活性．而FDH的稳定性较好，其游离酶可在60 ℃下保存30 min仍存有30%的反应活性[16]．两个酶相比较而言，在30 ℃条件下，FDH比较稳定，且酶活力在反应后期的变化不是很大；而AmDH的稳定性较差，在反应初期存在一定的活性降低，中间有较长一段时间的稳定过程，当反应时间超过120 min后，AmDH仅保留10%左右的活性．而且FDH的活性远远高于AmDH，AmDH催化的还原胺化反应是整个耦联体系催化的限速步骤，因此，耦联体系的构建初始并未考虑酶稳定性的问题．图3 AmDH、游离酶FDH与不同固定化酶的温度稳定性(60 ℃)Fig.3 Thermalsta bilities of the free and different immobilized AmDH and FDH(at 60 ℃) 2.2 游离胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系的构建在双酶耦联的催化反应体系中，涉及到两个酶各自催化的氧化还原反应，它们各自催化氧化或还原底物，周而复始的实现辅酶NADH的再生与消耗，既相互独立又相互影响．由于涉及到两个同时发生的氧化还原反应，这使得协调两个酶各自催化反应的速率，进而使提高酶催化效率的过程变得更加重要．如果一个反应速率过快或过慢，势必会对总体的催化效率及辅酶循环效率产生不利的影响．纯酶催化体系可以通过在体系中调节适当比例的双酶浓度，使参与反应的两个酶保持较高的催化效率．因此，实验中研究了酶浓度配比、底物浓度和辅酶浓度对游离双酶耦联体系的影响．图4 c(AmDH)/c(FDH)、辅酶浓度、底物浓度对生物催化过程的影响Fig.4 Effects of AmDH/FDH ratio, coenzyme and substrate concentration on biocatalytic process实验过程中检测到的FDH活性远高于AmDH，因此，AmDH的催化反应是整个催化过程中的限速步骤，在体系中提高AmDH酶和FDH酶浓度比，即提高c(AmDH)/c(FDH)比值，会大大加速反应的初速度．但AmDH与FDH的酶稳定性不同也会影响耦联体系催化的过程，如图4(a)，随着反应时间的延长，酶浓度对于反应速率的影响逐渐减小，最终反应的转化率没有明显差异，原因可能是随着反应时间的延长，AmDH的活性逐渐下降，对反应的催化作用减弱．由图4(b)可见，随着辅酶NAD+浓度的升高，产物转化效率明显下降．原因可能是体系中的辅酶NAD+同时参与AmDH的氧化脱氨反应，随着辅酶NAD+浓度的升高，产物氧化脱氨的速率加快，导致了产物的总生成速率下降．同样，随着反应时间的延长，AmDH的活性下降，辅酶浓度对于反应速率的影响逐渐下降，且对转化率无明显影响．由图4(c)可见，随着底物浓度的升高，产物的生成速率升高，但是最终反应的转化率会明显降低．原因可能是酶的结合位点有限，随着底物浓度升高，反应速率会达到饱和，同时随着反应时间的延长，AmDH活性逐渐降低，催化效果下降，最终导致转化率降低．分析双酶浓度比、底物浓度和辅酶浓度对游离双酶耦联体系的影响时发现，AmDH酶的稳定性会大大影响耦联体系的反应速率及转化率，因此，提高AmDH的稳定性成为影响耦联体系催化效率的重要因素．2.3 固定化胺脱氢酶-甲酸脱氢酶体系的构建PEI是一种水溶性的大分子聚胺，链上拥有大量的氨基(支链PEI，分子链上有伯仲叔胺)．PEI上带有大量的氨基，当pH<10时，其分子链上的氨基多处于质子化状态，而AmDH与FDH在pH<10时带负电，所以，PEI对酶分子具有一定的静电吸引作用，能够通过静电作用使酶分子发生离子吸附而被固定化[17]．PEI如“绳子”一般缠绕在酶分子表面，能够在一定程度上抑制多亚基酶亚基之间的解离．同时，PEI可以作为模板和催化剂催化钛前驱体水解缩聚形成二氧化钛[14]，进一步固定化已经被PEI包裹的酶分子，提高酶分子的稳定性．根据文献[15]工作，选择pH=8.5的PEI对AmDH-FDH进行包裹，使PEI终浓度达到0.25 mmol/L时，酶的活力达到最大，且稳定效果也最好．利用AmDH-FDH-PEI复合体作为诱导剂催化钛前驱体Ti-BLADH水解缩聚形成包裹着酶分子的TiO2颗粒球．如表2，对3种耦联体系来讲，底物浓度不变时，辅酶浓度提高，总转化率(total turnover number, TTN)值会下降，说明辅酶重复利用率会下降．固定辅酶浓度，提高底物浓度虽然会提高反应速率，但是转化率会明显降低．表2 底物浓度与辅酶浓度对于游离体系及两种固定化多酶耦联体系的影响Table 2 Effects of the concentration of substrate and coenzyme on the free system and immobilized multi-enzyme coupling system底物浓度/(mmol/L)NAD+浓度/(mmol/L)游离体系TTN/%转化率/%PEI固定化体系TTN/%转化率/%仿生钛化体系TTN/%转化率/%100.12559.7274.6665.0081.2667.3084.13100.10073.8873.8880.4780.4783 .3383.33100.07599.9474.96108.7681.57112.5784.43100.050150.7275.36163. 9481.97169.6684.83100.025301.6475.41328.0482.01339.5284.88250.02539 2.4039.24418.9041.89429.8042.98200.025365.8445.73392.2449.03403.2850. 41150.025323.8253.97350.2858.38361.6260.27100.025304.1676.04330.608 2.65342.0485.5150.025199.9899.99199.9899.99199.9899.99综合考虑辅酶的利用率和底物的转化率，选择辅酶浓度为0.025 mmol/L、底物浓度为10 mmol/L作为最适反应条件做进一步研究．其反应过程的进程曲线如图5．耦联体系刚开始反应时，游离体系的转化率最高，但随着时间的推移，游离酶活性逐渐降低，转化率随之下降，而其他两种固定化酶耦联体系能够较好地维持反应速率．PEI固定化体系虽然能够在一定程度上抑制酶亚基的解离，进而稳定酶的活性，但是，PEI与酶分子之间是通过静电作用吸附而交联固定的，其过程是可逆的．而AmDH-FDH-PEI复合物诱导钛前驱体Ti-BALDH形成的TiO2包裹的耦联体系，是化学反应，形成了有限空间的“笼效应”，并为催化反应提供了适宜的微环境，其耦联体系酶活力得以保存，因此，随着时间的延长有更好的催化能力．辅酶可在固定化酶体系所创造的微环境中高效循环再生，因而提高了多酶耦联体系的催化效率．图5 游离体系、PEI固定化体系和仿生矿化固定化体系的反应时间-转化率曲线Fig.5 Reaction time conversion curve of free system, PEI immobilized system and biomimetic mineralization immobilized system实验过程均采用纯酶进行反应，其产物均为R-苯氧基-2-丙胺，未能检测到S型产物，3种耦联体系反应在产物光学纯度上都表现出较好的对映体纯度 (对映体过量值>99.9%)．结语通过分别研究AmDH与FDH的单酶理化与动力学性质，并基于以上性质对参与耦联体系的双酶的酶活力配比、底物浓度和辅酶浓度进行优化，进而实现高效经济的辅酶再生循环．采用PEI对耦联体系进行固定化，并进一步利用PEI-酶复合物诱导钛前驱体Ti-BALDH水解缩聚形成TiO2，同时包裹PEI-AmDH-FDH形成固定化耦联体系．两种固定化方法过程简单，所需时间短，固定化后的酶保持了较高的酶活，同时具有更高的稳定性．相比游离酶耦联体系，固定化耦联酶体系可以在低底物浓度和低辅酶浓度条件下保持较高的催化效率．参考文献：【相关文献】[1] CONSTABLE D J C, DUNN P J, HAYLER J D, et al. Key green chemistry research areas:a perspective from pharmaceutical manufacturers[J]. Green Chemistry, 2007, 9(5):411-420.[2] KASPRZYK H B. Pharmacologically active compounds in the environment and their chirality[J].Chemical Society Reviews,2010,39(11):4466.[3] BROOKS W H, GUIDA W C, DANIEL K G. The significance of chirality in drug design and development[J]. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2011, 11(7): 760-770.[4] LEISCH H, MORLEY K, LAU P C. Baeyer-Villiger monooxygenases: more than just green chemistry[J]. Chemical Reviews,2011,111(7):4165-4222.[5] DUNN P J. The importance of green chemistry in process research and development[J]. Chemical Society Reviews, 2012,41(4):1452-1461.[6] CHEN Feifei, ZHENG Gaowei, LIU Lei, et al. Reshaping the active pocket of amine dehydrogenases for asymmetric synthesis of bulky aliphatic amines[J]. ACS Catalysis, 2018,8(3):2622-2628.[7] YE Lijuan, TOH H H, YANG Yi,et al. Engineering of amine dehydrogenase for asymmetric reductive amination of ketone by evolving rhodococcus phenylalanine dehydro-genase[J]. ACS Catalysis,2015,5(2):1119-1122.[8] CORADIN T, LIVAGE J. Effect of some amino acids and peptides on silicic acid polymerization[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2001, 21(4):329-336.[9] SUMEREL J L, YANG Wenjun, KISAILUS D,et al. Biocatalytically templated synthesis of titanium dioxide[J].Chemistry of Materials,2003,15(25):4804-4809.[10] JIANG Yanjun, YANG Dong, ZHANG Lei, et al. Preparation of protamine-titania microcapsules through synergy between layer-by-layer assembly and biomimetic mineralization[J]. Advanced Functional Materials, 2009,19(1):150-156.[11] JIANG Yanjun, SUN Qianyun, JIANG Zhongyi, et al. The improved stability of enzyme encapsulated in biomimetic titania particles[J]. Materials Science & Engineering C, 2009, 29(1):328-334.[12] JIANG Yanjun, YANG Dong, ZHANG Lei, et al. Biomimetics synthesis of titania nanoparticles induced by protamine[J].Dalton Transactions,2008(31):4165-4171.[13] YUAN Jianjun, JIN Renhua. Bioinspired synthesis of continuous titania coat with tunable nanofiber-based network structure on linear polyethylenimine-covered substrates[J].Langmuir,2010,26(6):4212-4218.[14] SEWELL S L, WRIGHT D W. Biomimetic synthesis of titanium dioxide utilizing the R5 peptide derived from Cylindrotheca fusiformis[J]. Chemistry of Materials,2006,18(13):3108-3113.[15] REN Hong, ZHANG Yonghui, SU Jieru, et al. Encapsulation of amine dehydrogenase inhybrid titania nano-particles by polyethylenimine coating and templated biomineralization[J]. Journal of Biotechnology, 2017, 241:33-41.[16] LIN Peng, ZHANG Yonghui, REN Hong, et al. Assembly of graphene oxide-formate dehydrogenase composites by nickel-coordination with enhanced stability and reusability[J]. Engineering in Life Sciences, 2018,18(5):326-333.[17] ANDERSSON M M, BRECCIA J D, HATTI-KAUL R. Stabilizing effect of chemical additives against oxidation of lactate dehydrogenase[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry,2000,32(3):145-153.。

第49卷第8期2021年4月广州化工Guangzhou Chemical IndustryVol.49No.8Apr.2021手性催化剂研究进展及其在不对称合成中的应用武文超（内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特010110）扌商要：手性催化被认为是合成手性化合物最有效的途径，近几十年来一直受到人们的广泛关注。

本文介绍了手性催化剂在不对称合成中的重要作用，并详细介绍了近年来生物催化剂、手性金属络合物催化剂、手性有机小分子催化剂（重点介绍手性磷酸催化剂和手性硫JR类催化剂）的相关研究进展，同时也介绍了各类催化剂在不对称催化合成中的应用，为后续的研究提供理论依据。

关键词：手性催化剂；生物催化剂；手性金属络合物催化剂；手性有机小分子催化剂；不对称合成中图分类号：06-1文献标志码：A文章编号：1001-9677（2021）08-0003-05Research Progress on Chiral Catalysts and Their Applicationin Asymmetric SynthesisWU Wen-chao(School of Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Huhehot010000,China)Abstract:Chiral catalysis is considered to be the most effective way to synthesize chiral compounds,which has attracted much attention in recent decades.The important role of chiral catalysts in asymmetric synthesis was introduced, and the research progress on biocatalysts,chiral metal complexes catalysts and chiral organic small molecular catalysts (chiral phosphoric acid catalysts and chiral thiourea catalysts)in recent years was introduced in detail.The application of various catalysts in asymmetric catalytic synthesis was also introduced,it provided a theoretical basis for the follow-up research.Key words:chiral catalyst；biocatalyst；chiral metal complex catalyst；chiral organic small molecule catalyst；asymmetric synthesis手性即不对称性，是指一个物体与其镜像不能完全重合的特征，是自然界中普遍存在的属性之一。

毕赤酵母的非甲醇诱导系统研究进展ZHAO Yixin;ZHANG Jianguo【摘要】毕赤酵母是一种能以甲醇为唯一碳源生长的甲基营养型酵母,常用作表达外源蛋白的细胞工厂.目前毕赤酵母常用的高效启动子AOX1(PAOX1)是一个严格的底物依赖型启动子,受甲醇的严格诱导,受葡萄糖、甘油、乙醇等非甲醇碳源抑制.但是甲醇有毒、易燃、易爆的特性使得其在食用、医用产品生产等领域受到很大的限制.本文将主要从PAOX1机制改造、新型启动子和非甲醇诱导物研发的角度阐述毕赤酵母非甲醇诱导的研究进展.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2019(049)003【总页数】8页(P46-53)【关键词】毕赤酵母;PAOX1调控机制;新型启动子;非甲醇诱导物【作者】ZHAO Yixin;ZHANG Jianguo【作者单位】【正文语种】中文巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii，曾称Pichia pastoris)是目前具有代表性的甲基营养型酵母。

其它研究较多的甲基营养型酵母还有多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、球拟酵母属(Torulopsis)。

其中毕赤酵母外源基因表达系统发展最为迅速。

巴斯德毕赤酵母最初由Guilliermond于1920年从法国栗树的分泌物中分离得到，并在之后几十年中陆续纯化得到几种分离菌株。

其中菌株NRRL Y-11430 (CBS7435)被Philips Petroleum公司开发成为单细胞蛋白表达系统[1]。

直至1995年YAMADA根据核糖体基因序列数据将巴斯德毕赤酵母重新归类为一个新属——Komagataella[2] [3]。

而且根据26S rRNA序列将巴斯德毕赤酵母分成K. pastoris、K. phaffii、K. pseudopastoris、K. poluli、K. ulmi和K. kurtzmanii等几个种[4]。

文章编号:1004-1656(2016)08-1064-06秋水仙碱与醇脱氢酶相互作用的光谱学和分子对接研究庹㊀浔,刘明浩,胡满根,杨淑玲,吕小兰,胡㊀昱*(南昌大学化学学院基础化学实验中心,江西㊀南昌㊀330031)摘要:在模拟人体生理条件下,利用光谱学和分子对接技术研究了秋水仙碱(Col)与醇脱氢酶(ADH)之间的相互作用机理㊂不同温度条件下的荧光光谱实验证明秋水仙碱能够通过氢键和范德华力与ADH结合形成复合物,从而抑制ADH的酶活力并引起ADH荧光的静态淬灭;不同温度条件下,Hill系数n H均约等于1,表明秋水仙碱对后继配体没有协同作用;同步荧光和红外光谱实验表明秋水仙碱对ADH的构象没有影响㊂紫外光谱和分子对接研究表明Col与乙醇类似,都是通过O上的孤对电子与ADH活性中心的Zn离子结合并进行定位㊂关键词:秋水仙碱;醇脱氢酶;相互作用;光谱法;分子对接中图分类号:O657．3㊀㊀文献标志码:AStudy on the interaction between colchicine with alcohol dehydrogenase by spectroscopy and molecular modeling methodTUO Xun,LIU Ming-hao,HU Man-gen,YANG Shu-ling,lV Xiao-lan,HU Yu* (Education Center for Basic Chemistry Experiments,College of Chemistry,Nanchang University,Nanchang330031,China) Abstract:The interactions between colchicine and alcohol dehydrogenase(ADH)were investigated by fluorescence,ultraviolet-visi-ble absorption,FT-IR spectra techniques and molecular modeling method.The results indicated that the activity of ADH was inhibi-ted by colchicine,and the combination between them is a static quenching process.The corresponding thermodynamic parameters in-dicated that hydrogen bonds and van der Waals forces were the main binding force between colchicine and ADH.The values of Hill s coefficients were equal to1approximately at different temperatures,which indicated there was almost no cooperativity in col-chicine binding with ADH.Furthermore,the primary binding for colchicine was located at Zn2+,in the active center of ADH was confirmed by ultraviolet-visible absorption spectroscopy and molecular modeling method.The effect of colchicine on the conformation of ADH was analyzed by synchronous fluorescence and FT-IR spectroscopy.Key words:colchicine;alcohol dehydrogenase;interaction;spectroscopic methods;molecular modeling method㊀㊀秋水仙碱(Colchicine,简称Col)是从百合科植物秋水仙(Colchicum autunale)中分离得到的一种具有消炎作用的卓酚酮类生物碱㊂人类使用含有秋水仙碱的植物提取物治疗痛风已有数千年的收稿日期:2015-11-02;修回日期:2016-01-25基金项目:国家自然科学基金项目(21562031)资助;江西省科技计划项目(20133BBE50016)资助;江西省教育厅项目(GJJ10361)资助;南昌大学校基金(Z04297)资助联系人简介:胡昱(1979-),男,副教授,硕士生导师,主要从事手性药物的拆分及其性质研究㊂E-mail:huyu494@163．com第8期庹㊀浔,等:秋水仙碱与醇脱氢酶相互作用的光谱学和分子对接研究历史[1]㊂近年来的研究表明,秋水仙碱在治疗某些恶性肿瘤㊁白塞氏病㊁家族性地中海热㊁心脏损伤后综合征和增值性玻璃体视网膜病变等方面都取得了很好的疗效[2-4]㊂但是,秋水仙碱对于肝肾功能不全者具有较强的毒副作用[1]㊂因此,需要进一步开展有关秋水仙碱的药理学和毒理学作用机制研究㊂药物小分子进入生物体内后,会与体内的蛋白质通过分子间作用力形成超分子化合物,进而影响蛋白质的功能及其所涉及的代谢通路㊂因此,研究Col与蛋白质之间的相互作用对理解Col 的药理学和毒理学机制具有重要的意义㊂乙醇脱氢酶(ADH)是一种广泛存在于哺乳动物肝脏的代谢酶,是肝脏中代谢酒精的一条主要途径[5]㊂ADH在很多生理过程中起着重要作用,并且与某些肝脏疾病密切相关[6]㊂近年来,采用光谱法研究药物和蛋白质的相互作用已成为生命科学㊁化学㊁药学和临床医学领域的研究热点[7-8]㊂该方法通过研究药物小分子物质对蛋白质色氨酸残基㊁酪氨酸残基和苯丙氨酸残基荧光的影响,从而得到两者之间如:结合常数㊁结合位点数㊁作用力类型以及结合位点等重要信息㊂因此,本文在模拟生理条件下,通过荧光光谱㊁红外光谱㊁紫外光谱并结合分子对接技术了秋水仙碱与ADH的相互作用,以期揭示Col在肝脏中的作用机制,为了解Col的毒副作用提供一些重要的信息㊂1㊀实验部分1．1㊀仪器与试剂F-4500型荧光光谱仪(日本日立公司),测试条件:激发和发射狭缝均为10nm,扫描速度1200 nm㊃min-1;YJ-501超级恒温仪(上海跃进医疗器械厂);PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂); UV1870DPC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司);TENSOR27红外光谱仪(德国布鲁克公司)㊂乙醇脱氢酶(ADH,EC1．1．1．1,美国Sigma 公司),1ˑ10-3mol㊃L-1,临用现配;秋水仙碱(上海市国药集团),配制成浓度了1ˑ10-3mol㊃L-1储备液,使用时根据需要稀释;氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,Sigma公司)配制为0．05mol㊃L-1溶液;三羟基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲液,pH7．4,0．05mol㊃L-1(上海蓝季科技发展公司);实验所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水㊂1．2㊀实验方法在比色皿中加入3ml Tris-HCl缓冲溶液后,根据实验需要依次加入适量的ADH和Col溶液(总体积<100μL)㊂由于后加入的体积远小于初始溶液,可以忽略稀释效应㊂1．2．1㊀ADH酶活的测定㊀按照文献[9]的方法得到不同Col浓度条件下,ADH的酶活变化㊂1．2．2㊀荧光光谱㊀固定ADH的浓度(3．3ˑ10-6 mol㊃L-1),并逐次加入10μL Col溶液(间隔递增为3．3ˑ10-6mol㊃L-1),快速混匀后以280nm为激发波长,在F-4500型荧光光谱仪上记录300~400 nm波长范围内的发射光谱㊂固定荧光发射与激发的波长差分别为әλ=15nm和әλ=60nm,扫描ADH同步荧光光谱㊂1．2．3㊀红外光谱㊀分辨率为4cm-1,取样次数为60,在1200~1800cm-1范围内,分别扫描ADH和Col-ADH复合物的红外光谱㊂1．2．4㊀紫外光谱㊀固定Col的浓度(3．3ˑ10-3mol ㊃L-1),并逐次加入10μL Zn2+溶液,以相应的Zn2+溶液为参比,在UV1810紫外可见分光光度计上分别扫描Col和Col-Zn2+复合物的吸收光谱㊂1．2．5㊀分子对接㊀Col的结构采用ChemBio3D Ultra14．0生成,并使用MMFF94分子力场进行优化㊂BSA的结构来源于RSCB数据库(编号: 1ADC)㊂使用用AutoDock4Zn程序对两分子进行对接,采取Lamarckian遗传算法(参数为默认设置)来预测两者对接时Col可能的构象[10]㊂使用MGLTools-1．5．7软件对聚类分析最多且结合自由能相对较低的构象进行分析㊂2㊀结果与讨论2．1㊀ADH酶活实验ADH是一种含锌金属酶,能够以NAD为辅酶催化伯醇和醛之间的可逆反应:CH3CH2OH+NAD ѳңADH CH3CHO+NADH㊂当以340nm为激发波长时,NAD没有荧光而NADH会产生很强的荧光[9]㊂因此,通过检测NADH的荧光强度的变化,可以监测ADH酶活力的变化㊂如图1所示,随着体系内Col量的增加,相同时间内ΔF逐渐降低,5601化学研究与应用第28卷表明催化生成的NADH的量逐渐减少,即秋水仙碱抑制了ADH的活力㊂因此,可初步判断秋水仙碱对ADH的荧光淬灭为静态淬灭[11]㊂图1㊀秋水仙碱对ADH的抑制动力学曲线Fig.1㊀The effect of colchicine on the Kinetic curves of ADHC col(μmol㊃L-1):1-0;2-3．3;3-6．7(ˑ10-6mol㊃L-1)2．2㊀秋水仙碱对ADH荧光淬灭机理研究在模拟人体生理条件下,随着体系中Col量的增加,ADH的荧光强度逐渐降低,且最大发射波长蓝移了约7nm,表明秋水仙碱与ADH具有相互作用(图2)㊂化学小分子物质引起蛋白质荧光淬灭机理分为动态淬灭和静态淬灭,可根据根据Stern-Volmer方程:F0F=1+K sv[Q]=1+Kqτ0[Q](1)判断其具体淬灭类型㊂其中F0和F分别为加入淬灭剂前后的荧光强度;[Q]为猝灭剂的浓度;K SV为猝灭常数;K q为双分子荧光猝灭速率常数;τ0生物大分子的荧光平均寿命,约为10-8s-1㊂按照实验方法2,分别在295㊁298和301K时测定了秋水仙碱对ADH荧光的影响㊂以F0F对[Q]作图(图2A),由拟合直线的斜率可得不同温度下的K SV,结果见表1㊂随着温度的增加,K SV值逐渐降低,即温度升高使Col对ADH的淬灭程度降低,这说明ADH荧光猝灭不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭,而是Col与ADH形成基态复合物的静态猝灭过程[12]㊂不同温度条件下Col对ADH的淬灭常数均达到1012L㊃mol-1s-1数量级,远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2ˑ1010L㊃mol-1s-1,进一步证明Col对ADH的荧光淬灭过程是静态淬灭[13]㊂该结果与ADH酶活实验一致㊂图2㊀Col-ADH体系的荧光光谱图Fig.2㊀Fluorescence spectra of Col-ADH systemC col from1to6:0,3．3,6．7,10,13．3and16．7(ˑ10-6mol㊃L-1) 2．3㊀结合常数、结合位点数及作用力类型对于荧光静态淬灭过程,可用Langmuir单分子吸附模型公式:log(F0-F)F=log K a+n log[Q](2)对实验数据进行进一步处理㊂以log (F0-F)F对log[Q]作图(图3B),由拟合曲线的截距和斜率即可求得体系的结合常数K a和结合位点数n㊂由表1所示,在不同的温度下结合位点数n均接近与1,表明Col与ADH有一个独立的结合位点;结合常数Ka随温度增加而降低,即Col-ADH体系的稳定性随着温度的升高而降低,同样表明Col对ADH的荧光淬灭为静态淬灭㊂化学小分子物质可以通过氢键㊁疏水作用力㊁范德华力和静电作用力与蛋白质形成超分子化合物㊂不同种类的药物与蛋白质之间的作用力不同㊂Ross等[14]提出可以通过热力学参数判断出药物与蛋白的作用力类型:若ΔH>0㊁ΔS>0,主要表现为疏水作用;若ΔH<0㊁ΔS>0,主要表现为静电作用;若ΔH<0㊁ΔS<0,主要表现氢键或范德华力㊂改变体系反应温度,可根据下列公式计算Col-ADH体系的热力学参数:Ln K2/K1=әH(1/T1-1/T2)/R(3)әG=-R Tln K=әH-TәS(4)结果见表1,әG<0表明反应是自发进行的,әH与әS均<0,表明秋水仙碱与ADH之间作用力主要为氢键和范德华力㊂2．4㊀药物协同性药物之间的协同性可以用过Hill方程进行判断[15]㊂根据秋水仙碱-ADH体系荧光值计算n H6601第8期庹㊀浔,等:秋水仙碱与醇脱氢酶相互作用的光谱学和分子对接研究值㊂各温度条件下n H 值均约等于1,表明配体秋水仙碱与ADH 结合后对后继配体没有协同作用㊂图3㊀不同温度条件下Col 与ADH 的相互作用图A :Stern-Volmer 图B :双对数图Fig.3㊀Curves of Col-ADH system at different temperaturesA :Stern-Volmer plotsB :Plots of log [(F 0-F )/F ]vs log [Q ]表1㊀不同温度条件下Col-ADH 体系反应常数㊁热力学参数以及Hill 系数Table 1㊀The association constants (Kˑ104L ㊃mol -1),relative thermodynamic parameters ,and Hill coefficient of Col-ADH system at different temperaturesT(K)K SV R K a n R ΔG (kJ ㊃mol -1)ΔH(kJ ㊃mol -1)ΔS(J ㊃mol-1㊃K -1)n H R 2954．40．9954．90．950．993-26．491．1020．9902984．20．9983．51．060．999-25．92-81．97-188．20．98190．9993014．00．9952．21．170．996-25．021．02580．9982．5㊀秋水仙碱对ADH 构象的影响为了研究秋水仙碱对ADH 构象的影响,固定ADH 的浓度,扫描了不同浓度Col 存在条件下ADH 同步荧光(图4)和红外光谱(图5)的变化㊂当Δλ=15nm 时的同步荧光仅显示ADH 中酪氨酸的光谱特征,Δλ=60nm 时同步荧光仅表现ADH 中色氨酸的光谱特征㊂随着Col 的量的增加,色氨酸和酪氨酸残基的强度逐渐降低,但是最大发射波长都没有变化,说明秋水仙碱对ADH 的构象没有影响㊂红外光谱研究也发现秋水仙碱的加入不会导致ADH 的酰胺I 带和酰胺II 红外发射峰波数和峰形发生改变,同样说明秋水仙碱对ADH 的构象没有影响㊂研究表明,某些极性药物在不改变蛋白质二级结构的情况下,仍然能够与蛋白质发生较强的作用[16-17]㊂Col 具有非对称的结构且含有极性基团,易溶于水,具有较强的极性,这可能是其与ADH 结合但不改变ADH 二级结构的重要原因㊂图4㊀Col-ADH 体系同步荧光图Fig.4㊀Synchronous fluorescence spectra of Col-ADH systemA :Δλ=15nm ;B :Δλ=60nm ;C col from 1to 5:0,3．3,6．7,10and 13．3(ˑ10-6mol ㊃L -1)7601化学研究与应用第28卷图5㊀Col-ADH体系红外光谱图Fig.5㊀FT-IR spectra of Col-ADH system 2．6㊀结合位点ADH是一种含锌的金属酶,Zn2+是其活性中心,用于结合乙醇分子上的-OH基并且进行定位[18]㊂综合上述的同步荧光㊁红外光谱以及酶活实验的结果,可以推测Col通过与ADH活性中心的Zn2+结合从而导致了ADH荧光的猝灭㊂因此,按照实验方法1．2．4,扫描不同浓度Zn2+存在条件下秋水仙碱吸收光谱的变化㊂如图6所示,随着Zn2+浓度的增加,Col的峰形发生变化并且在250 nm和340nm两处吸收峰的吸光度值逐渐增加,表明秋水仙碱和Zn2+之间发生了相互作用㊂因此,可以初步判断秋水仙碱与ADH的结合位点位于其活性中心的Zn2+㊂图6㊀Col-Zn2+体系吸收光谱图Fig.6㊀The ultraviolet-visible absorptionspectra of Col-Zn2+systemC col=3．3ˑ10-3mol㊃L-1;C Zn2+from1to3ʒ0,1．6and3．3(ˑ10-3mol㊃L-1)分子模拟可以从理论上对生物大分子与配体的作用模式进行合理预测㊂本文使用AutoDock4Zn 程序预测了Col与ADH结合可能存在的构象,选择聚类分析最多且结合自由能相对较低的构象进行下一步分析㊂如图7A所示,Col分子嵌于ADH 的活性中心(圆球包裹的空间),并且该活性中心有足够的空间来容纳Col分子㊂进一步放大模型(图7B)可以发现Col分子中的三个CH3O-全部朝向ADH活性中心的Zn离子(圆球),因为CH3O-中O的孤对电子可与Zn发生配位作用,使得Col 被定位与ADH的活性中心㊂分子对接的结果表明Col与乙醇类似[18],都是通过O上的孤对电子与ADH活性中心的Zn离子结合并进行定位㊂分子对接的结果与紫外光谱实验结果一致㊂图7㊀Col与BSA的分子对接模型A:结合位置B:结合方式Fig.7㊀Molecular docking of Col and ADHA:binding site B:binding model3㊀结论本文通过荧光光谱㊁紫外光谱和红外光谱并结合分子对接技术研究了秋水仙碱与乙醇脱氢酶(ADH)的相互作用㊂结果表明Col通过氢键和范德华力与ADH分子形成稳定的复合物,能够抑制ADH的酶活,该结合对后继配体的结合没有协同作用㊂Col通过CH3O-中O的孤对电子与ADH活性中心的Zn2+结合并定位,并且Col不会引起ADH的构象发生改变㊂这些信息将为我们在蛋白水平揭示Col在生物体内的分子作用机制提供一些有用的信息㊂参考文献:[1]Molad Y.Update on colchicine and its mechanism of ac-tion[J].Curr Rheumatol Rep,2002,4(3):252-256. 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·专家论坛·合成生物学在医药领域的应用进展李瀚纯王鑫瞿旭东王舒［弈柯莱生物科技（集团）股份有限公司上海 200241］摘要近20年来，合成生物学在生物回路构建、生物元件标准化，以及各种基因组/代谢工程工具和方法的开发方面不断取得突破。

合成生物学的快速发展正在改变生物技术行业的产业布局。

目前，合成生物技术已广泛应用于天然产物合成、医学、能源、工业等多个领域。

医药的需求也推动了合成生物学的发展，包括将体外催化技术应用于手性医药化学品的绿色制造，将异源途径整合到细胞中以有效生产药物等。

合成生物学凭藉更经济、环境友好等突出特点，将颠覆一部分传统医药的制造方式。

本文概要介绍合成生物学在手性医药化学品的绿色制造和植物天然产物的生物制造方面的应用进展。

关键词合成生物学 医药化学品 天然产物 萜类化合物 芳香族化合物中图分类号：Q819; O629.71 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2024)07-0024-08引用本文李瀚纯, 王鑫, 瞿旭东, 等. 合成生物学在医药领域的应用进展[J]. 上海医药, 2024, 45(7): 24-31; 55.Applications of synthetic biology in the pharmaceutical fieldLI Hanchun, WANG Xin, QU Xudong, WANG Shu(Abiochem Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 200241, China)ABSTRACT In the past two decades, synthetic biology has made breakthroughs in the construction of biocircuits, the standardization of biological elements and the development of various genomic/metabolic engineering tools and approaches.Its rapid development is changing the industrial layout of biotechnology industry. At present, synthetic biotechnology has been widely used in many fields such as natural product synthesis, medicine, energy and industry. Pharmaceutical demands have also driven its development, including the application of in vitro catalytic technology in the green manufacturing of chiral pharmaceutical chemicals and the integration of heterologous pathways into designer cells to efficiently produce medicines and so on. Synthetic biology, with its more economical and environmentally friendly features, will subvert some traditional pharmaceutical manufacturing methods. This article reviews the applications of synthetic biology in the green manufacturing of chiral pharmaceutical chemicals and the biological manufacturing of natural plant products.KEY WORDS synthetic biology; pharmaceutical chemicals; natural products; terpenoids; aromatic compounds合成生物学是采用工程科学研究理念，对生物体进行定向设计、理性改造甚至创造新型生物体的一门学科。