实验方法—碧云天官网版
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碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线: 400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号阿尔新蓝-核固红染色试剂盒(pH2.5)产品编号产品名称包装C0155S 阿尔新蓝-核固红染色试剂盒(pH2.5) 100次C0155M 阿尔新蓝-核固红染色试剂盒(pH2.5) 500次产品简介:碧云天生产的阿尔新蓝-核固红染色试剂盒(pH2.5) (Alcian Blue & Nuclear Fast Red Staining Kit, pH2.5)是一种通过阿尔新蓝对含有硫酸根(sulfated)的组织如硫酸化黏液物质(sulfated mucosubstances)及含有羧基(carboxylated)的组织如唾液粘多糖蛋白(sialomucins)、透明质酸(hyaluronic acid)及上皮酸性黏蛋白(epithelial acid mucin)等进行染色的试剂盒,同时提供核固红进行复染。
本产品对不同组织的石蜡切片和冰冻切片均适用,也可用于血涂片和骨髓涂片的染色。
本试剂盒染色时无须额外的酸化操作步骤,染色步骤更加简单便捷。
阿尔新蓝(Alcian Blue),也称阿尔新蓝8G、阿利新蓝或爱先蓝,是一种类铜钛花青共轭染料,最初用于纺织纤维染色。
阿尔新蓝的分子式为C56H68N16S4Cl4Cu,分子量为1298.86,CAS号为33864-99-2,墨绿色结晶,有金属光泽,溶于水。
阿尔新蓝属于阳离子染料,中央含铜的酞菁环与四个异硫脲基通过硫醚键相连而成,异硫脲基呈中度碱性,使阿尔新蓝带阳离子。
阿尔新蓝使酸性物质着色的机制尚不十分明确,一般认为是阳离子的异硫脲基通过静电与组织内的多聚阴离子如酸性黏液物质的羧基或硫酸根形成不溶性复合物,即染料分子中带正电荷的盐键和酸性黏液物质中带负电荷的酸性基团结合呈蓝色。
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)产品简介:碧云天生产的细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法),即Autophagy Staining Assay Kit with MDC ,是一种使用丹酰尸胺,也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。
自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。
自噬与多种生理功能有关,在饥饿等环境条件下,细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分,为细胞的生存提供能量及原材料,促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。
自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。
由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用,自噬已经成为细胞生物学领域的一个研究热点。
MDC 是细胞自噬检测最常用的荧光探针之一。
MDC 可以通过离子捕获(ion trapping)和与膜脂的特异性结合,从而特异性标记自噬体(autophagosome),也称autophagic vacuole ,因而常用于细胞自噬的检测。
MDC 是一种嗜酸性荧光探针,很多酸性膜性结构也会被MDC 染色,因此MDC 染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。
本产品的染色原理决定了本产品只能用于培养的细胞或者组织的细胞自噬荧光染色检测,不能用于冻存的或固定的细胞、组织或者组织切片的染色检测。
使用本产品染色后可以通过荧光显微镜拍照观察,也可以通过荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光检测。
荧光显微镜观察时可以使用紫外区激发光激发,发出绿色荧光。
荧光酶标仪或流式细胞仪推荐的激发波长为335nm (330-360nm 均可),发射波长为512nm (510-540nm 均可)。
本产品用于细胞自噬染色的效果参考图1。
图1. 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)的染色效果图。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线:400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询:*****************网址:碧云天网站微信公众号Oligomycin A (ATPase抑制剂)产品编号产品名称包装SC0366-10mM Oligomycin A (ATPase抑制剂) 10mM×0.2mlSC0366-5mg Oligomycin A (ATPase抑制剂) 5mgSC0366-25mg Oligomycin A (ATPase抑制剂) 25mg产品简介:化学信息:化学名Spiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27, 2'-[2H]pyran]-3,9,13-trione,22-ethyl-3',4',5',6'-tetrahydro-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-[(2 R)-2-hydroxypropyl]-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethyl-, (1R,2'R,4E,5'S,6S,6'S,7R,8S,10R,11R,12S,14R,15S,16R,18 E,20E,22R,25S,28S,29R)-简称Oligomycin A别名oligomycin中文名寡霉素A化学式C45H74O11分子量791.06CAS号579-13-5纯度≥98%溶剂/溶解度Water <1mg/ml; DMSO 10mg/ml; Ethanol <1mg/ml溶液配制5mg加入0.63ml DMSO,或者每7.91mg加入1ml DMSO,配制成10mM溶液。
SC0366-10mM用DMSO配制。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线:400-168-3301或800-8283301 订货e-mail :******************技术咨询:*****************网址:碧云天网站 微信公众号脂质氧化(MDA)检测试剂盒产品编号 产品名称包装 S0131S 脂质氧化(MDA)检测试剂盒 100次 S0131M脂质氧化(MDA)检测试剂盒500次产品简介:碧云天的脂质氧化(MDA)检测试剂盒(Lipid Peroxidation MDA Assay Kit)采用一种基于MDA 和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应,随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA 进行定量检测,广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation) 水平检测的试剂盒。
丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物。
动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时,会发生脂质氧化。
一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物,其中包括MDA 。
此时通过检测MDA 的水平即可检测脂质氧化的水平,因此MDA 的测定被广泛用作脂质氧化的指标。
生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA ,例如thromboxane synthase 也可以催化产生,但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。
丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA 发生反应,形成红色的MDA-TBA 加合物,相应的反应原理图如下:MDA TBA MDA-TBA AdductMDA-TBA 加合物在535nm 处有最大吸收,据此可以通过比色法进行检测。
另外,MDA-TBA 加合物也可以在535nm 被激发产生最大发射波长553nm ,据此也可以进行荧光检测。
特点:本试剂盒中采用了特殊的抗氧化剂,可以有效地抑制样品在检测过程中产生新的MDA ,使检测更加准确。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线:400-1683301或800-8283301 订货e-mail :******************技术咨询:*****************网址:碧云天网站 微信公众号DEPC 水(DNase 、RNase free)产品编号 产品名称包装 R0022DEPC 水(DNase 、RNase free)500ml产品简介:碧云天生产的DEPC 水,即DEPC-treated Water ,是用DEPC(diethypyrocarbonate ,焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的Milli-Q 纯水。
经检测不含RNase 、DNase 和proteinase 。
DEPC 水可以用于RNA 沉淀的溶解,含有RNA 的各种反应体系如反转录、siRNA 的退火等,以及其它各种要求无RNase 、DNase 和proteinase 的反应体系。
DEPC 水不同于DEPC 。
DEPC 水是使用DEPC 处理过的水,基本上不含DEPC ,99.99%以上是水。
如需购买用于去除RNA 酶的DEPC ,可以选购碧云天的DEPC(ST036)。
包装清单:产品编号 产品名称包装 R0022 DEPC 水(DNase 、RNase free)500ml —说明书1份保存条件:室温保存,一年有效。
注意事项:如果每次的使用量很小,可以适当分装后再使用。
手上通常有RNase ,必须戴一次性手套操作,以防RNase 污染。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
相关产品:产品编号 产品名称包装 R0021 DEPC 水(DNase 、RNase free) 100ml R0022 DEPC 水(DNase 、RNase free)500ml ST036DEPC10g使用本产品的文献:1. Xu F, Yang T, Chen Y . Quantification of microRNA by DNA–Peptide Probe and Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry-Based Quasi-TargetedProteomics. Anal Chem. 2016 Jan 5;88(1):754-63. 2. Zheng Y , Liang W, Yuan Y , Xiong C, Xie S, Wang H, Chai Y , Yuan R. Wavelength-resolved simultaneous photoelectrochemical bifunctional sensor on singleinterface: A newly invitro approach for multiplexed DNA monitoring in cancer cells. Biosens Bioelectron. 2016 Jul 15;81:423-30.3. Zheng X, Pang X, Yang P, Wan X, Wei Y , Guo Q, Zhang Q, Jiang X. A hybrid siRNA delivery complex for enhanced brain penetration and precise amyloidplaque targeting inAlzheimer's disease mice. Acta Biomater. 2017 Feb;49:388-401.4. Liu L, Xu Q, Hao S, Chen Y .A Quasi-direct LC-MS/MS-based Targeted Proteomics Approach for miRNA Quantification via a Covalently ImmobilizedDNA-peptide Probe.Sci Rep-Uk . 2017 Jul 18;7(1):5669. 5. Xu F, Zhou W, Cao J, Xu Q, Jiang D, Chen Y .A Combination of DNA-peptide Probes and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS):A Quasi-Targeted Proteomics Approach for Multiplexed MicroRNA Quantification.Theranostics . 2017 Jul 8;7(11):2849-2862. 6. Zheng X, Pang X, Yang P, Wan X, Wei Y , Guo Q, Zhang Q, Jiang X.A hybrid siRNA delivery complex for enhanced brain penetration and precise amyloidplaquetargeting in Alzheimer's disease mice.Acta Biomater . 2017 Feb;49:388-401. 7. Guo S, Meng XW, Yang XS, Liu XF, Ou-Yang CH, Liu C.Curcumin administration suppresses collagen synthesis inthe hearts of rats withexperimentaldiabetes.Acta Pharmacol Sin . 2018 Feb;39(2):195-204. 8. Han B,Zhang Y ,Zhang Y ,Bai Y ,Chen X,Huang R,Wu F,Leng S,Chao J,Zhang JH,Hu G,Yao H.Novel insight into circular RNA HECTD1 in astrocyteactivation via autophagy by targeting MIR142-TIPARP: implications for cerebral ischemic stroke.Autophagy . 2018;14(7):1164-1184. 9. Xu L,Yu QW,Fang SQ,Zheng YK,Qi JC.MiR-650 inhibits the progression of glioma by targeting FAM83F.Eur Rev Med Pharmaco . 2018 Dec;22(23):8391-8398. 10. Yu C,Zhang X,Sun X,Long C,Sun F,Liu J,Li X,Lee RJ,Liu N,Li Y ,Teng LKetoprofen and MicroRNA-124 Co-loaded poly (lactic-co-glycolic acid)microspheres inhibit progression of Adjuvant-induced arthritis in rats.Int J Pharmacol . 2018 Dec 1;552(1-2):148-153. 11. Guo S,Meng XW,Yang XS,Liu XF,Ou-Yang CH,Liu CCurcumin administration suppresses collagen synthesis in the hearts of rats with experimentaldiabetes.Acta Pharmacol Sin . 2018 Feb;39(2):195-204.12.Xie Y,Hu JZ,Shi ZYMiR-181d promotes steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by targeting SMAD3 to inhibit osteogenic differentiation ofhBMSCs.Eur Rev Med Pharmaco . 2018 Jul;22(13):4053-4062.13.Kang Q,Zou H,Zhou L,Liu LX,Cai JB,Xie N,Li WH,Zhang C,Shi WH,Wang LM,Zhang WH,Zhu H,Wang SF,Zhang XWRole of the overexpression ofTRAF4 in predicting the prognosis of intrahepatic cholangiocarcinoma.Int J Oncol . 2018 Jul;53(1):286-296.14.Wang P,Chen Y,Wang L,Wu Y,Wang L,Wu Y,Gong Z.The intervention mechanism of folic acid for benzo(a)pyrene toxic effects in vitro and in vivo.Eur JCancer Prev . 2018 Jul 16.15.Cai Y,Dong ZY,Wang JY.MiR-520b inhibited metastasis and proliferation of non-small cell lung cancer by targeting CHAF1A.Eur Rev Med Pharmaco . 2018Nov;22(22):7742-7749.16.Pan SC,Cui HH,Qiu CGHOTAIR promotes myocardial fibrosis through regulating URI1 expression via Wnt pathway.Eur Rev Med Pharmaco . 2018Oct;22(20):6983-6990.17.Protective effect of cyclosporine on inflammatory injury of renal tubular epithelial cells.Eur Rev Med Pharmaco. 2018 Oct;22(19):6551-6559.Version 2020.03.232 / 2 R0022DEPC水(DNase、RNase free) 400-1683301/800-8283301 碧云天/Beyotime。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线:400-1683301或800-8283301 订货e-mail :******************技术咨询:*****************网址:碧云天网站 微信公众号细胞膜远红外荧光染色试剂盒(DiD)产品编号 产品名称包装 C1995S细胞膜远红外荧光染色试剂盒(DiD)200-1000次产品简介:细胞膜远红外荧光染色试剂盒(DiD),Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiD (Far-red Fluorescence)是一种以DiD 为荧光探针,并提供了染色增强剂、能快速灵敏地对细胞膜进行远红外荧光染色标记的试剂盒。
DiD 即DiIC 18(5),也称为DiD' solid ,全称为1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-Chlorobenzenesulfonate Salt ,分子式为C 67H 103ClN 2O 3S ,分子量为1052.08。
DiD 是DiI 的类似物,但具有更长的激发和发射波长,为远红外荧光,在一些细胞和组织染色中更有优势,特别适合用于进行多种荧光的同时染色。
DiD 是一种亲脂性羰花青(carbocyanine)染料,具有很长的亲脂性烃链,进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色,染色后非常稳定。
DiD 可被633nm 的氦-氖(He-Ne)激光所激发,DiD 在进入细胞膜之前荧光非常弱,仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。
DiD 被激发后可以发出远红外的荧光,DiD 和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考图1。
其中,最大激发波长为644nm ,最大发射波长为665nm 。
图1. DiD 和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线:400-168-3301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询:*****************碧云天网站微信公众号网址:Human Angiogenin ELISA Kit产品编号产品名称包装PA023 Human Angiogenin ELISA Kit 96次产品简介:碧云天的Human Angiogenin ELISA Kit (Human Angiogenin Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit),即人血管生成素酶联免疫吸附检测试剂盒,是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的Angiogenin的ELISA试剂盒。
本产品检测灵敏度高,特异性强,重复性好。
多次重复检测结果表明,最小检出量为4.75pg/ml,与EGF、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、TGF-α、TGF-β1,小鼠 EGF、GM-CSF、MIP-1α等均没有交叉反应,板内、板间变异系数均小于10%。
人血管生成素(Angiogenin, ANG)是一种分子量为14kDa的单链非糖基化蛋白,属于核糖核酸酶中RISBASE家族。
该家族成员不仅具有核糖核酸酶活性,还具有一些特殊的生物学功能。
ANG氨基酸长度为123,包括3个链内二硫键。
人ANG与小鼠ANG具有75%的氨基酸同源性,且具有一定的种间交叉反应。
能够表达ANG的细胞主要有血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、结肠柱状上皮细胞、淋巴细胞和部分肿瘤细胞。
ANG主要参与血管的形成过程。
基底膜的降解是血管新生过程中内皮细胞发生迁移的先决条件。
ANG首先与肌动蛋白结合,随后肌动蛋白-ANG复合物发生裂解,激活组织血纤维蛋白溶酶原。
这一过程产生的血纤维蛋白溶酶会降解基底膜中的层粘连蛋白和纤连蛋白。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线:400-1683301或800-8283301 订货e-mail :******************技术咨询:*****************网址:碧云天网站 微信公众号基因组编辑突变检测试剂盒产品编号 产品名称包装 D0508S 基因组编辑突变检测试剂盒 25次 D0508M基因组编辑突变检测试剂盒100次产品简介:碧云天生产的基因组编辑突变检测试剂盒(Genome-Editing Mutation Detection Kit),也称基因编辑突变检测试剂盒(Gene-Editing Mutation Detection Kit),是一种简单、可靠、快速的基于T7 Endonuclease I (T7EI)的用于检测基因组DNA 在基因编辑后发生突变的试剂盒。
本试剂盒主要利用了T7 Endonuclease I (T7EI)能识别并酶切不完全配对的DNA 双链(也称异源双链DNA ,heteroduplex DNA)的特性。
本试剂盒组分特别齐全。
提供了包括一步法基因组DNA 提取、高保真PCR 扩增、变性退火和T7EI 酶切的全套试剂,并且还提供了阳性对照。
本试剂盒使用特别便捷。
一步法基因组DNA 提取非常快速便捷,并且提取后可以直接用于高保真PCR 扩增,PCR 扩增产物也可以直接用于后续的变性退火和T7EI 酶切。
无需额外的分离纯化步骤。
本试剂盒检测基因组编辑突变的原理如下。
首先需要编辑的细胞、组织或器官通过转染、病毒感染等技术手段表达CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)或ZFN (Zinc-finger nucleases)等核酸酶。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线: 400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号pCMV-C-mOrange2 (橙色荧光蛋白)产品编号产品名称包装D2625-1µg pCMV-C-mOrange2 (橙色荧光蛋白)1µgD2625-100µg pCMV-C-mOrange2 (橙色荧光蛋白)100µg产品简介:pCMV-C-mOrange2是碧云天自行研发的哺乳动物细胞表达质粒,用于表达C端含mOrange2标签的融合蛋白。
mOrange2蛋白是一种极其明亮的桔色荧光蛋白,与mOrange蛋白相比,其蛋白稳定性得以提高。
pCMV-C-mOrange2含有CMV启动子,可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。
pCMV-C-mOrange2在多克隆位点的后面有一个mOrange2的完整编码序列,因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达C端含有mOrange2标签的融合蛋白。
利用mOrange2的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位,也可以利用mOrange2抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。
mOrange2与GFP没有序列同源性,不能使用GFP抗体检测mOrange2,但可以尝试使用抗mcherry的抗体检测mOrange2。
pCMV-C-mOrange2为卡那霉素抗性,并且含有Neomycin筛选标记,转染细胞后,可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-C-mOrange2质粒的主要信息如下:Feature Nucleotide PositionCMV promoter 1-602T3 promoter and T3 primer binding site 620-639Multiple cloning site 651-740mOrange2 741-1448 T7 promoter and T7 primer binding site 1498-1519 SV40 polyA signal 1531-1914 f1 origin of ss-DNA replication 2052-2356 bla promoter 2381-2505 SV40 promoter2525-2863 Neomycin/kanamycin resistance ORF 2898-3689 HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 3690-4148 pUC origin 4277-4944pCMV-C-mOrange2质粒(4996bp)的图谱如下:pCMV-C-mOrange2的多克隆位点的详细图谱如下:SmaISacI SacII NotI XmaI BamHI HindIII651 GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGC CCGGGCGGAT CCAAGCTTCTCTCGAGGTGG CGCCACCGCC GGCGAGATCG GGCCCGCCTA GGTTCGAAGAEcoRI EcoRV SalI XhoI XbaI mOrange2701 GCAGGAATTC GATATCGTCG ACAGATCTCT CGAGTCTAGA ATGTCTAAGGCGTCCTTAAG CTATAGCAGC TGTCTAGAGA GCTCAGATCT TACAGATTCC751 GAGAAGAAAA TAATATGGCT ATCATCAAGG AATTTATGCG TTTTAAGGTCCTCTTCTTTT ATTATACCGA TAGTAGTTCC TTAAATACGC AAAATTCCAG801 CGTATGGAAG GTTCAGTCAA TGGTCACGAA TTTGAAATTG AAGGTGAAGGGCATACCTTC CAAGTCAGTT ACCAGTGCTT AAACTTTAAC TTCCACTTCC851 AGAAGGTCGT CCATACGAAG GTTTTCAAAC TGCTAAATTG AAGGTAACCATCTTCCAGCA GGTATGCTTC CAAAAGTTTG ACGATTTAAC TTCCATTGGT901 AAGGTGGACC ATTACCTTTT GCATGGGATA TTTTGTCACC ACAGTTTACATTCCACCTGG TAATGGAAAA CGTACCCTAT AAAACAGTGG TGTCAAATGT951 TACGGAAGTA AAGCATATGT TAAGCATCCA GCTGATATTC CTGATTACTTATGCCTTCAT TTCGTATACA ATTCGTAGGT CGACTATAAG GACTAATGAA1001 TAAATTGAGT TTTCCTGAAG GTTTTAAATG GGAACGTGTC ATGAATTTTGATTTAACTCA AAAGGACTTC CAAAATTTAC CCTTGCACAG TACTTAAAAC1051 AAGATGGTGG AGTTGTCACC GTAACACAAG ATTCTTCATT GCAGGATGGATTCTACCACC TCAACAGTGG CATTGTGTTC TAAGAAGTAA CGTCCTACCT1101 GAATTTATCT ACAAGGTTAA ATTGCGTGGA ACCAATTTTC CATCTGATGGCTTAAATAGA TGTTCCAATT TAACGCACCT TGGTTAAAAG GTAGACTACC1151 TCCTGTCATG CAAAAGAAAA CAATGGGTTG GGAAGCAAGT TCTGAACGTAAGGACAGTAC GTTTTCTTTT GTTACCCAAC CCTTCGTTCA AGACTTGCAT1201 TGTACCCTGA AGATGGAGCC CTTAAAGGTG AAATCAAGAT GCGTTTGAAAACATGGGACT TCTACCTCGG GAATTTCCAC TTTAGTTCTA CGCAAACTTT1251 CTTAAGGATG GTGGACATTA CACTTCTGAA GTCAAGACAA CTTACAAGGCGAATTCCTAC CACCTGTAAT GTGAAGACTT CAGTTCTGTT GAATGTTCCG1301 CAAAAAGCCA GTACAGCTTC CTGGAGCTTA CATCGTTGGT ATCAAATTGGGTTTTTCGGT CATGTCGAAG GACCTCGAAT GTAGCAACCA TAGTTTAACC1351 ATATTACATC ACACAATGAA GATTACACTA TCGTTGAACA ATATGAACGTTATAATGTAG TGTGTTACTT CTAATGTGAT AGCAACTTGT TATACTTGCAApaI1401 GCAGAAGGTC GTCACTCTAC TGGTGGTATG GATGAACTTT ACAAGTAAG GCGTCTTCCAG CAGTGAGATG ACCACCATAC CTACTTGAAA TGTTCATTC C1451 GGGCCCGGTA CCTTAATTAA TTAAGGTACCCCCGGGCCAT GGAATTAATT AATTCCATGGpCMV-C-mOrange2中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-C-mOrange2)包括:AclI AfeI AgeI AhdI AscI AsiSI BbsI BcgI BlpI BmgBI Bpu10I BsiWI BsmBI BspEI BsrGI BssHII BstZ17I EarI EcoNI Esp3I FseI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI SapI SbfI SgrAI SpeI SwaI XcmIpCMV-C-mOrange2中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-C-mOrange2 once)包括:AccI GT’MK,AC 718 MluI A’CGCG,T 1914 AflII C’TTAA,G 1251 MscI TGG|CCA 3108 AleI CACNN|NNGTG 661 NarI GG’CG,CC3026 ApaI G,GGCC’C 1453 NheI G’CTAG,C597 ApaLI G’TGCA,C 4630 NotI GC’GGCC,GC 668 BaeI ,N)5’(N)10ACNNNNGTAYC(N)7,(N)5’ 1185 PaeR7I C’TCGA,G 729 BamHI G’GATC,C 687 PciI A’CATGT 49442 / 4 D2625pCMV-C-mOrange2(橙色荧光蛋白) 400-1683301/800-8283301 碧云天/BeyotimeBclI T’GATC,A 1685 PflFI CCAN,NNN’NTGG 3144 BglII A’GATC,T 723 PflMI G,GCGC’C 1146 BmtI G,CTAG’C 601 PluTI G,GCGC’C 3029 BsaI GGTCTCN’NNNN, 4015 PspOMI G’GGCC,C 1449 BsaXI ,NNN’(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN’ 2078 PstI C’TGCA,G 703 BseRI GAGGAG(N)8,NN’ 2844 PvuI CG,AT’CG 1531 BsgI GTGCAG(N)14,NN’ 1420 RsrII CG’GWC,CG 3524 BspDI AT’CG,AT 2866 SacI G,AGCT’C 655 BstBI TT’CG,AA 3708 SacII CC,GC’GG 662 BstEII G’GTNAC,C 893 SalI G’TCGA,C 717 BstXI CCAN,NNNN’NTGG 663 SfiI GGCCN,NNN’NGGCC 2801 BtsI GCAGTG,NN’ 1867 SfoI GGC|GCC 3027 ClaI AT’CG,AT 2866 SmaI CCC|GGG 682 CspCI ,NN’(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN’ 382 SnaBI TAC|GTA 346 DraIII CAC,NNN’GTG 2144 SrfI GCCC|GGGC 682 Eco53kI GAG|CTC 653 StuI AGG|CCT 2847 EcoRI G’AATT,C 705 TspMI C’CCGG,G 680 EcoRV GAT|ATC 713 Tth111I GACN’N,NGTC 3144 HindIII A’AGCT,T 693 XbaI T’CTAG,A 735 HpaI CC,TGCA`GG 1791 XhoI C’TCGA,G 729 KasI G’GCGC,C 3025 XmaI C’CCGG,G 680 MfeI C’AATT,G 1778 XmnI GAANN|NNTTC 871 pCMV-C-mOrange2质粒中推荐使用的测序引物序列如下:T3 primer (620-639): 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'C-mOrange2 primer (852-873): 5'- AACCTTCGTATGGACGACCTTC -3'pCMV-C-mOrange2的全序列信息请参考碧云天的网站上该质粒的信息。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线:400-1683301或800-8283301 订货e-mail :******************技术咨询:*****************网址:碧云天网站 微信公众号BeyoFusion™ PCR Master Mix (2X)产品编号 产品名称包装 D7250-1ml BeyoFusion™ PCR Master Mix (2X) 100次 D7250-5mlBeyoFusion™ PCR Master Mix (2X)500次产品简介:BeyoFusion™ PCR Master Mix (2X)是一种使用了高保真、扩增速度可以达到15秒/kb 的BeyoFusion™ DNA Polymerase 的高保真PCR 扩增用的2X 预混液。
本产品中含有2X BeyoFusion™ DNA Polymerase ,2X BeyoFusion™ Buffer (with Mg 2+),2X dNTP ,只需加入适量引物、模板和水即可进行高保真PCR 扩增。
大大简化了PCR 操作,使操作更加快捷,也减少了PCR 操作过程中可能导致的污染,使PCR 的重复性更好。
利用BeyoFusion™ PCR Master Mix (2X)可以进行各种常规的PCR 扩增,特别适合用于高保真和快速的定性和半定量的PCR 扩增,以及长片段DNA(长度最长可以超过12kb 的)的基因扩增和克隆。
扩增速度极快,扩增小于6kb 的DNA 片段时,延伸1kb 只需要15秒。
普通的DNA 聚合酶延伸1kb 通常需要1-2分钟。
BeyoFusion™ DNA polymerase 由于其超快的扩增速度,可以显著缩短PCR 扩增所需的时间。
BeyoFusion™ DNA Polymerase 是一种高保真DNA 聚合酶,不仅可以非常高效地催化5’至3’方向的依赖于DNA 模板的脱氧核苷酸的聚合反应,它同时还具有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity),它的错误发生概率比Taq 酶要低52倍,比pfu 酶要约低6倍。
Western实验步骤
Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA 裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳
冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。
电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。
SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。
为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90-120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP36/FFP39)。
硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液,加入Western封闭液(P0023B),在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
对于一些背景较高的抗体,可以4℃封闭过夜。
在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗。
用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
回收一抗。
加入Western洗涤液(P0023C),在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
注:Western结果通常需要提供内参作为对照,通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128),进行内参检测。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
二抗需根据一抗进行选择,例如,一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗,如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。
碧云天有多种二抗提供。
用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
加入Western洗涤液(P0023C),在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书,使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白。
压片可以采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。
如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片(FF057/FF081)。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵,可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。