建 3. 双链cDNA的合成 ②置换合成法 利用Rnase H将杂交双链中的mRNA降解,形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的RNA片段. 利用这些RNA片段作为引物,引导合成第二链cDNA. 随着合成产物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作为引物的RNA片段均被新合成的互补链所置换. 通过DNA连接酶作用,将各段互补链连接成完整DNA链。 除去残存的5末端RNA片段,并用T4DNA聚合酶削平3端突出的单链cDNA,得到一个双链形式的cDNA片段. 该方法直接利用第一链反应产物,避免了中间处理和纯化过程造成的cDNA损失,是目前合成cDNA第二存 库在液体培养基中扩增保存 从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中,混合的细菌生长数代后,其培养物于-70℃储序列过多或过少.
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基因组DNA片段3凹端的不完全补平的策略
载体的遗传转化 电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段 插入片段NA,酶切脉冲电泳检查插入片段的大小,并根据数之有同源,至法 利用新合成的单链cDNA 3末端反转所形成的发夹的双链部分作为引物,引导DNA聚合酶以cDNA为模板,合成互补的第二链cDNA,反应结束后,用S1核酸酶降解发夹环的单链部分,即可得到双链的cDNA片段。 主要缺点是在用S1核酸酶去除发夹环时的反应条件要求极为苛刻,难以控制,目前已极少采用。
纯化mRNA样品的制备 选择特定发育阶段的特定组织为分离mRNA的材料。 mRNA的纯化:利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴与olgo(dT)互补杂交,使mRNA固定在固相介质上,再将mRNA洗脱下来,制备出纯属化的mRNA样品. mRNA样品完整性的检测:根据28S和18S rRNA电泳条带的亮度判断RNA的完整性,从而间接地判断mRNA的完整性。 如果28S rRNA条带的亮度是18S的2倍,RNA样品完整。 如果2条带的亮度反过来,说明RNA样品部分降解。 如果无清晰的条带,说明R为材料,特别适用天某些mRNA病毒等的基因组都含有一种mRNA序列,这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,因此,阳性杂交信号一般是有意义的,由此选择出接应用于基因工程操作. cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结完整的基因组所需要筛选的重组子数目添加标题