微生物来源的酶抑制剂的筛选

酶 ）， 从 而 延 缓 了 糖 类 的 消 化 和 吸 收 ， 以 改 善 餐 后 高 血糖 。
１１ 阿卡波糖 （ ｒａ ｏ ｅ） ． ａｃ ｂ ｓ
１ ６６年 ， 野 尻 霉 素 （ ０ ｉ ９ Ｎ ｉｒ ｍＹＣ ｎ ｉ ｉ ）， 从 ｓ ．
ｒｏｓｅ ｃｈ ｏｍｏ ｎ Ｒ ６８ Ｓ，ｌ ｅ ｕｌ ｅ Ｆ ２５ ０ ｒ ｇｅ ｅｓ －４ ａｖ ｎｄ ａ Ｓ 一４
２型 糖 尿 患 者 ， 餐 后 高 血 糖 不 仅 极 易 诱 发 各 种 并 发
ＡＣ ｔ ｎ ｐ ａ ｅ “ ａ ｅ Ｓ Ｓ 酵 液 中 分 离 得 到 阿 卡 ｅ ｊ ｏ ｌ ｄ ｓ ｔｈ Ｄ ｊ 发
症 ，还 极 大 地 提 高糖 尿 病 的死 亡 率 。故 降 低 餐 后 血糖
是预 防糖 尿 病 、减 少 并 发 症 和 降 低 死 亡 率 的 重 要 措 施 之 一 。临 床 应 用 中 ， ａ一 萄 糖 苷 酶抑 制 剂 类 药 物 不 葡
下。
１２ 伏格列波糖 ． 伏 格 列 波 糖 （ ｏ ｌｂ ｓ ） 商 品 名 倍欣 ， 是 日本 ｖ ｇｉｏ ｅ ， 武 田开 发 研 制 的 新 一 代 ａ一 萄 糖 苷 酶 抑 制 剂 ， 它 是 葡 从放 线 菌 培 养 液 中发 现 的 氨 基糖 类 似 物 。 口服 后 能竞 争拮抗 性地抑 制肠道 内双糖类 水解酶 （ ａ一 萄 糖 苷 葡
低 ， 增 强 组 织 对 胰 岛 素 的 敏 感 性 ， 减 少 胰 岛 素 的 分 泌 。 对 预 防 和 延 缓 糖 尿 病 并 发 症 的 发 生 具 有 很 好 的 作 用 … 。 国 内 以 仿 制 药 为 主 ， 近 几 年 其 市 场 份 额 呈 上 升 趋势。
合 成 步 骤 烦 琐 、 成 本 高 、 效 率 低 ，进 展 较 为 缓 慢 。 国 内 受 技 术 和 成 本 限 制 ， 大 多 是 从 中 草 药 ， 如 甘 草 Ｉ —ｌ Ｉ 、茶 叶 、桑 、 虎 杖 和 五 味 子 中筛 选 ， 张 哲 等 从 Ｉ 钝 顶 螺 旋 藻 中 分 离 。 目前 井 冈霉 素 产 生 菌 和 野 尻 霉

ACAT抑制剂
类固醇类：

Aspergillus fumigatus FO-1289 中分离到的
pyripyropenes是一类令人激动的发现, 不仅抑制活性很 强, 且可以选择性抑制ACAT2 PyripyropeneA-R, 其中A和C是目前发现最强天然抑制 目前为止只在微生物来源的抑制剂中发现了一种选择性抑 制ACAT2的物质, 即pyripyropene A


现国内已有6种他汀类药物可供临床选用：
洛伐他丁(lovastatin) 、普伐他丁(pravastatin)、 辛伐他丁(simvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、 阿托伐他汀(atorvastatin）、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)
超级他汀 ：


罗伐他汀(rosuvastatin）2003年在美国获批上市 伊他伐他汀（itavastatin,NK-104,亦即 pitavastatin，匹伐他汀），2003年在日本获批 上市
他汀类药物的非调脂作用





抗凝固作用 改善内皮细胞功能作用 抗炎症作用 抗骨质疏松作用 抗肿瘤作用 预防痴呆 防治慢性心力衰竭 防治高血压 防治周围动脉疾病 抗心律失常 保护心脏瓣膜

毒副作用较少 肌病（CK） 肝毒性（谷丙和谷草转氨酶）

1998年美国心脏协会（AHA）主席指出，我 们面临一场"脂质革命"，进入了一个"他汀 "的全新时代。他汀类药物在动脉粥样硬化 的预防方面的贡献和成就将至少相当，甚 至超出青霉素问世对传染性疾病和风湿热 预防的贡献与成就。
4、胰酯酶抑制剂

胰酯酶对食物中甘油三酸酯的吸收起着关 键性作用，高营养性脂肪的吸收会造成肥 胖。

谷胱甘肽转移酶（GST）还原型谷胱甘肽占绝大多数。

谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。

GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。

GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。

通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。

研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。

因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。

与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。

近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。

抗肿瘤药物与GSH作用模式图：图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起，其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤；③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。

机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。

吸附或融合抑制剂筛选模型


将纯化的CD4或HIV一1 gpl20包被至ELISA 板上，在不同浓度药物存在的情况下，检 测另一种蛋白的结合量 特异识别HIVgp41六股a一螺旋束核心结构 空间构型的单克隆抗体，以该抗体建立夹 心ELISA方法
2 、抑制辅受体相互作用

趋化因子CCR5，为G蛋白偶联因子超家族（GPCR）成员的 细胞膜蛋白，是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一

1、HIV吸附或融合抑制剂：

HIV侵入T淋巴细胞的起始阶段是HIV吸附于细胞膜 表面，是由于HIV膜蛋白gp120与T细胞表面受体 CD4的高度特异性结合。
霉酚酸(MPA)


从Penicillium sp. FO28017培养液中分离得到的小分 子物质, 是一种次黄嘌呤核苷酸脱氢酶( IMPDH ) 抑制剂和抗H IV抑制剂 蛋白印迹分析MPA能减少H IV的gp120表达从而抑 制H IV的感染，其作用机制主要是通过减少H IV 表面膜蛋白gp 120的表达来抑制合胞体形成。

蛋白酶抑制剂筛选模型



HIV-1蛋白酶与短肽链（含Tyr-Pro键）反 应 通过对肽键的测定推算出HIV-1蛋白酶的活 力 以此为对照，在系统中加入待测样品
4、逆转录酶抑制剂： 逆转录酶由pol基因编码，功能为转录和复 制病毒基因组 逆转录酶是艾滋病选择性化疗的首选靶位 之一 quinoxapatin A和quinoxapatin B 由放线 菌产生,为非竟争性酶抑制剂,具有可逆性
7个微生物代谢产物类CCR5 抑制剂
3、蛋白酶抑制剂：


HIV蛋白酶由pol基因编码，功能为切割聚 合蛋白 gag基因编码聚合蛋白→基质蛋白（p17）、 核衣壳蛋白（p7、p9）、衣壳蛋白（p24）

酶抑制剂的作用方式
1.直接抑制病原微生物或人体内生物合成 途径中的某种关键酶，减少某种产物的 生成。 2.通过抑制人体内生物合成途径中的某种 酶使人体有益的底物得以积累，从而达 到治疗的目的。 3.通过抑制与某种生物合成途径直接相关 且必需的另一个生化反应的酶来减少有 害物的生成。
酶抑制剂的作用方式
1逆转录酶抑制剂rti2蛋白酶抑制剂3整合酶抑制剂目前国际上治疗艾滋病的药物共17种尚未有治疗艾滋的特效药高效抗逆转录病毒疗法逆转录酶抑制剂法及蛋白酶抑制剂的联合治疗是目前治疗中的基本治疗其他均为辅助治疗如免疫增强剂及中草药设计酶抑制剂筛选方法的基本原理在筛选酶抑制剂时要分离或精制得一定量的筛选酶再根据筛选酶与特定底物的特异性反应后所生成的反应物来设计反应程序从反应体系中底物的减少或消失和生成的产物的数量来判断待筛物的抑制活性强弱
设计酶抑制剂筛选方法 的基本原理
在筛选酶抑制剂时,首先要分离或精 制得一定量的筛选酶，然后再根据 筛选酶与特定底物的特异性反应后 所生成的反应物来设计反应程序,最 后从反应体系中底物的减少或消失 和生成的产物的数量来判断待筛物 的抑制活性强弱。
筛选模型的建立
筛选模型就是在筛选实验中所应用的实 验模型，由于抑制剂筛选要求实验方案 有标准化和定量化的特征，因而在传统 药理实验中常见的动物实验在抑制剂筛 选中较少应用，根据实验模型的不同， 药物筛选可以分为分子水平的筛选和细 胞水平的筛选。
1.比色检测法 比色检测法是最经典的酶检测方法，主要通过 测定反应底物或产物在紫外或可见光下的吸收 值，通过在特定波长下检测吸光值的变化．间 接地反应体系中酶的活性。比色检测法的关键 是在筛选反应体系中含有特定吸收波长、可用 于检测的化合物。对仪器要求简单，普通的酶 标仪就能够满足一般的高通量筛选的要求，也 是最为方便的检测方法之一，但是该方法的灵 敏度有时相对较低，有时为了达到信号在线性 范围内，需要较大的酶量和底物浓度。

能抑制α-淀粉酶的抑制剂如链霉菌YM-25菌株产生的hairm；链霉菌S. corchoruchii菌株产生的paim以及链霉菌S. dimorph ogenes菌株产生的萃他丁(trestatin)等都是α-淀粉酶抑制剂，它们对不同来源的α-淀粉酶均显示出强的抑制作用，但不抑制β-淀粉酶和β-糖苷酶。

以萃他丁为例：它含有A,B,C三个组分的α-淀粉酶抑制剂属于低聚糖同系物。

它是无色粉末，紫外光谱呈末端吸收，对蒽酮、酚-硫酸呈阳性反应，对坂口、红四唑呈阴性反应。

Trestatin对猪胰α-淀粉酶、曲霉α-淀粉酶、枯草杆菌α-淀粉酶都有抑制作用，但不抑制β-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶。

国外α-淀粉酶抑制剂研究起步较早，早在上世纪四十年代就有小麦种子中α-淀粉酶抑制剂的报道[5~7]。

它是一种电迁移率为0.2，分子量为21000的蛋白质。

但在随后的25年间很少有这方面的报道[8]。

之后Shainkin和Birk[9]提出小麦粉中存在两种α-淀粉酶抑制剂，并阐述了它们的分离和性质。

它们的电迁移率不同，对不同来源的α-淀粉酶专一性不同。

从后来的研究[10~14]知道：它们在小麦种子中是多分子形式的蛋白质，能不同程度的抑制昆虫和哺乳动物的淀粉酶。

1945又在普通大豆上有过报道[15~16]，1972年α-淀粉酶抑制剂曾经在微生物上有过报道，因其在医药上的价值而被广泛研究。

α-淀粉酶抑制剂在20世纪70年代被深入研究，在20世纪80年代和90年代，由于发现其在医学上的重要性，尤其在抑制糖尿病和高血糖以及对昆虫选择性控制等方面具有重要作用而加速研究[17]。

70年代以来，已研究发现100多种来自植物和微生物的抑制α-淀粉酶的活性物质，有的已经进入临床实验[18]。

微生物来源的糖苷水解酶抑制剂的筛选研究在近些年来已成为比较活跃的领域之一，尤其在联邦德国和日本。

现已报道的这类酶抑制剂20~30种。

Namiki等报道从一株链霉菌发酵液中分理出一种新的寡糖类α-糖苷水解酶抑制剂Adiposin。

合， 更 要观 察药 物对 酶 活性 的影 响 。 根 据酶 的特点 ， 酶 的反 应底 物 和产 物 都可 作 为检 测指 标［ ２ １ 。以酶 为 作用 靶 点 的 高
通量 检 测 方 法 ， 绝 大 多数 是 直 接 检测 酶 的活 性 ， 主 要 有 基
酶 的专 ＿ 二 抑制 剂 作 为药 物 ， 来调 节体 内的异 常代 谢 。 酶 抑 制剂 作 为药 物 的治 疗 基 础 是 通 过 限制 酶 催 化底 物 的 反 应 能力 ， 使 底 物 浓 度增 高 或 代 谢 产 物 浓度 降 低 ， 以 达 到 改善 症状 的 目的 。在一 系列 酶 促 反应 中 ， 以抑 制 限速 酶 或 关键 酶 的效 果 最好 。在 目前 上市 的 药物 中 ， 以受 体 为
靶 点 的药 物 占 ５ ２ ％， 以酶 为靶 点 的药 物 占 ２ ２ ％， 以离 子 通 道 为靶 点 的药 物 占 ６ ％， 以核酸 为靶 点 的 药物 占 ３ ％。酶 抑 制 剂 的开 发是 新药 的 重要 来源 。随 着现 代 生物科 学技 术 的
于放 射性 的方法 和基 于 比色 、 荧 光 的方 法 两大 类［ ３ １ 。 曹鸿 鹏 等 采 用荧 光 分 析法 建立 了流 感 病 毒 神经 氨 酸 酶抑 制 剂 的高 通量 筛选 模 型 ， 从 甲型及 乙 型流 感 病 毒 中制 备 出神 经氨 酸酶 ， 以有荧 光 特性 的化合 物为 酶 的底 物 ， 利 用
为分 子水 平 的筛 选模 型 ，也 有 少量 细胞 水 平 的筛 选 模 型 。
筛选 以酶 为 作 用靶 点 的药 物 ，不 仅 要 观 察 酶 与 药 物 的 结
域 。随着 酶学 研究 的深 入 ， 对 酶结 构 的认 识 ， 已能在 分 子水

界 糖尿 病 在成 人 中发 病率 为 ４ ， 预计 在 ２ ２ ０ ５年 将达
ｌ
醛柑还原嗍
ＮＡＤＰ ＮＡＤＰＨ
Ｉ Ｉ Ｉ 梨孵脱 酶
Ｉ 磷酸激酶
到 ８ 口 。尽 管 可 以用 胰 岛素对 糖尿 病患 者进 行治 疗 ， ］ 但 还 是 会 留下 危 及 许 多 组 织 和 器 官 的 糖 尿 病 并 发 症
糖 尿病 （ ｉｂ ｔｓｍｅｌ ｕ ， ｄａ ｅｅ ｌｔｓ ＤＭ） 一 种 多 病 因 的 ｉ 是 代谢 性疾 病 ， 特 征之 一 就 是葡 萄 糖 代谢 异 常 和 某些 其
Ｄ￣ ．ｏ －Ｕ；ｔ ，ｔ Ｊ ｌ ： … 梨 醇 果 糖
组 织 中高 血糖 状 态 。１ ９ ９ ５年 ， 界卫 生 组 织统 计 全世 世
ｓ ａ ｃ ｎ ａ ｄｏ ｅ ｒ ｄ ｔ ｓ ｎｈｉ ｉｏｒ ｒ ｍ ｉ ｒ ｏ ｇａ ｉ ｍ ｓ ｅ ｒ ｈ ｏ ｌ ｓ ｅ ｕｃ ａ ｅ ｉ ｂｔ ｓｆｏ ｍ ｃ ｏ ｒ ｎｓ ．
ＫＥＹ ＯＲＤＳ Ａｌ ｓ ｅ ｃ ａ ｅ ｉ ｂｉｏｒ Ｗ ｄｏ ｅ ｒ ｄｕ ｔ ｓ ｎｈｉ ｔ ｓ； Ｄｉｂｅ ｉ ｏ ｐ ｉａ ｉ ｎｓ； Ｍ ｉｒ ｂｉ ｌｏｒｇ ｎ ａ ｔｃ ｃ ｍ ｌｃ ｔｏ ｃ ｏ ａ ｉ ｉ
（ ｉｂ ｔ ｏ ｌ ａｉｎ ） 如 糖 尿 病 性 白 内障 、 脉 粥 ｄａ ｅｉ ｃ ｍｐｉ ｔ ｓ ， ｃ ｃ ｏ 动 样 硬化 、 围神 经 疾 病 、 周 肾脏 病 变 和 视 网 膜 病 变等 ［ 。 ２ ］
４ Ｃｈ ｍｉｔ ｙ ａ ｄ Ｌ ｆ ｃ ｅ ｃ ｐ ｒ ｍｅ ｔ ｅ ｓ ｒ ｎ ｉｅ Ｓ ｉｎ ｅ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ，Ｗ ｅ ｔＡｎ ｕ ｉ ｅ ｓ ｔ ， ｓ ｈ ｉ Ｕｎ ｖ ｒ ｉｙ Ｌｉ ｎ ２ ７ １ ） ｕａ ３０ ２

产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达摘要：脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，广泛应用于食品、制药和生物工程等领域。

本文旨在概述产脂肪酶微生物的筛选方法以及如何克隆和表达脂肪酶基因。

通过筛选出高产脂肪酶的微生物，并利用基因克隆技术将其基因表达，可以为大规模生产纯脂肪酶提供基础。

1. 引言脂肪酶是一种催化脂质的水解反应酶，广泛存在于微生物中。

它们通过将脂肪酯水解为脂肪酸和甘油，起到重要的催化作用。

因此，寻找高产脂肪酶的微生物，并将其脂肪酶基因克隆和表达，具有重要的应用价值。

2. 产脂肪酶微生物的筛选产脂肪酶的微生物广泛存在于土壤、水体和动物消化系统等环境中。

筛选产脂肪酶微生物的方法主要有：直接筛选法、改进筛选法和基因工程筛选法。

2.1 直接筛选法直接筛选法是最常见也是最简单直接的方法之一。

通过将微生物菌株进行培养，然后检测菌液中产酶能力。

其中，利用酶抑制剂和显色剂的方法可以进行定性和定量的检测。

该方法的优点是操作简便，易于操作。

2.2 改进筛选法改进筛选法通过加入酶诱导剂、化合物诱导剂和高浓度含油样品等方式，提高产脂肪酶的微生物菌株筛选效果。

例如，可使用大豆油、浓缩桔子油等作为诱导剂，增强菌株胞外酶的产酶能力。

2.3 基因工程筛选法基因工程筛选法是利用基因工程技术构建含有脂肪酶基因的表达载体，转化到宿主菌株中，使其表达目标基因并产生脂肪酶。

这种方式可通过对基因进行改造和优化，提高脂肪酶活性和稳定性。

同时，基因工程筛选法还可以利用高通量筛选技术，如流式细胞术和高通量测序技术，提高筛选效率。

3. 脂肪酶基因的克隆和表达脂肪酶基因的克隆和表达是关键步骤，它们可以为脂肪酶的高效生产提供基础。

3.1 脂肪酶基因的克隆脂肪酶基因的克隆可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割和连接等方法实现。

首先，从目标微生物的基因组DNA或环境DNA中提取目标基因的DNA序列。

然后，使用特异性引物进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。

微生物源菊粉酶
菊粉酶(Inulinase), 学名为 β-2,1-D-果 聚糖酶,又称β-果聚糖酶,属于糖基水 解酶32家族(glycosyl hydrolases family 32)广泛存在于微生物和植物中。
菊粉酶分类
按照菊粉酶对底物作用方式的不同可将其分为内切 菊粉酶和外切菊粉酶两类。
1.内切菊粉酶可随机地将菊粉链内部的糖苷键断开, 水解产物主要为低聚果糖。
微生物产生的生理活性物质
20世纪60年代初,Umezawa 提出了酶抑制剂的概念认 为微生物有机体内酶及其 抑制剂是共存的。 导致了许多新的筛选模 型与方法的建立，开创了 从微生物代谢产物中寻找 其他生理活性物质的新时 代。
微生物来源酶抑制剂筛选 的先驱－－Hamao Umezawa
微生物产生生理活性物质
随着分子生物学和免疫学的发展, 高特异性、高选择性和低毒副作 用的新型免疫抑制剂成为近年来国内外研究热点
微生物来源的酶
微生物源果胶酶
果胶酶是指一类能够分解果胶物质的复 合酶，广泛存在于植物果实中，另外微 生物中的真菌、细菌和放线菌都能发酵 生产果胶酶的相关酶系，在对食品腐坏 的研究过程中科学家首次发现了微生物 产生的果胶酶，此后，很多研究者针对 微生物果胶酶展开了研究并获得了大量 成果，果胶酶在食品加工、纺织、造纸 等与国计民生息息相关等领域应用广泛。
菊粉酶的应用
1.利用外切菊粉酶生产高果糖浆：以菊粉为原料,可分别利用 酸法和酶法制备果糖。用酸法制备的果糖产量虽高,但副物 (葡萄糖和蔗糖)多,色素重,分离较困难,难以进行后续精制操作。 而利用外切菊粉酶制备果糖,不仅生产工艺简单,转化率高,而 且果糖纯且产量高,果糖含量可高达。因此,外切菊粉酶在生 产果糖及高果糖浆的工业应用上潜力巨大。 2.利用内切菊粉酶生产低聚果糖：工业上主要是利用内切菊 粉酶随机的断裂菊粉链内部的糖苷键生成低聚果糖,此法不仅 产物纯度高,而且生产过程易于控制。纯度高的低聚果糖热能 低,适用于特殊及肥胖人群,而高纯度低聚果糖的低吸湿性又 可用于制作粉剂及颗粒,在工业上的适用范围更广泛。 3.利用菊粉酶生产酒精：利用菊粉酶降解菊芋粗提液发酵生 产的酒精, 几乎能将菊芋粗提液发酵完全,且不需要再添加其 他的营养成分,酒精产量可达96%

从利用微生物资源的角度来讲，微生物资 源是可再生的和颇具潜力的。据估计，已知 的细菌(包括放线菌)近5000种，估计自然界 存在的细菌有40000种(已知仅占12％)。已 知真菌6万多种，实际可能有100多万种(已 知仅占5％) 。其中，已有34属600种放线菌， 97属300种细菌和2000属49000种真菌已用 于筛选微生物药物。当然，其中大部分的微 生物还属于难培养微生物。因此，开展难培 养微生物的培养对于发掘微生物资源至关重 要。
第二，近二十多年来又发现了30余
种新病原体，而且，16种已被控制 的传染性疾病如结核、霍乱等，出 现了程度不同的再流行。因此，临 床上迫切需要尽快提供更有效的抗源的免疫调节剂 环孢菌素A、FK-506、Rapamycin 微生物来源的酶抑制剂 lovastatin、simvastatin
从表1、表2列出的数据可以看出， 80代初的五年间从链霉菌代谢产 物筛选到的活性物质占51％，从 真菌代谢产物筛选到的活性物质只 占15．2％。到了90年代，从真菌 代谢产物筛选到的活性物质已占 35．3％，居各种来源的第一位。 从链霉菌代谢产物筛选到的活性物 质仅占24．7％，而海洋生物来源 也上升到20．7％。
到1974年止，放线菌来源的抗生素 几乎都由链霉菌产生，约占2000种 抗生素中的95%，但在随后6年的报 导中，由链霉菌产生的仅占25%。 稀有放线菌是发现新抗生素的极好 来源。
近几十年来随着对生理活性物质的筛选， 人们已经更多地从链霉菌属放线菌扩大 到稀有放线菌(链霉菌以外的放线菌)、 真菌、细菌、极端环境下生长的微生物 及海洋微生物。
可从稀有放线菌中寻找： 所谓稀有放线菌是指除链霉菌以外的 其它属的放线菌。如Lechevaliev等从 土壤中分离得到5000株放线菌进行鉴 定，结果95%为链霉菌、2%为诺卡氏 菌、1.4%为小单孢菌，其它如嗜热小 单孢菌、游动放线菌、小双孢菌、囊 孢链霉菌、马杜拉放线菌、小多孢菌、 假诺卡氏菌等仅占0.2%~0.04%。

第 44 卷第 2 期2021 年 2 月名袷中河么Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 2 February 2021新型a-葡萄糖苷酶抑制剂筛选及药理作用研究进展阎成炬h2,郭崇真“2,林建阳1.中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁沈阳1100012.中国医科大学药学院，辽宁沈阳110122摘要：a-葡萄糖苷酶抑制剂能有效降低餐后血糖，为临床一线降糖用药之一。

近年来报道了大量新化合物作为a-葡萄糖 苷酶抑制剂，不仅可以起到降糖的作用，而且还具有抗溶酶体堆积病、抗病毒、_抗菌和抗癌的药效。

a-葡萄糖苷酶抑制剂 新型化合物按照产出途径主要有微生物代谢产物、天然产物与化学合成产物。

就近年来开发的多种类型的a-葡萄糖苷酶抑 制剂及其抗癌、抗病毒和抗溶酶体堆积病作用进行了综述’旨在为&葡萄糖苷酶抑制剂或临床前候选药物提供更好的研究方向-关键词：a-葡萄糖苷酶抑制剂；2型糖尿病；作用机制：药理作用；抗病毒；抗溶酶体堆积病中图分类号：R977.1 文献标志码：A 文章编号：1674-6376 (2021) 02-0440-06DOI ：10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.02.029Research progress of screen and pharmacological effect for novel a-glucosidaseYAN Chengda1'2,GUO Chongzhen1,2,LIN Jianyang1,21. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China2. College of Pharmaceutical Science, China Medical University, Shenyang 110122, ChinaAbstract: Alpha-glucosidase inhibitor is one of the first-line antidiabetic medication which could reduce postprandial blood glucose effectively. In recent years, a substantial number of new compounds have been reported as alpha-glucosidase inhibitors, have multiple physiological effects including hypoglycemic effects, anticancer, antiviral, and anti-lysosomal storage disorders effect. The main types of new alpha-glucosidase inhibitor are microbial metabolites, natural products and chemically synthesized products. This review presents the various types of alpha-glucosidase inhibitors developed in recent years and its pharmacological effects, aimed to provide guidance to alpha-glucosidase inhibitors or clinical candidates.Key words: Alpha-glucosidase; type 2 diabetes mellitus; mechanism of action; pharmacological effect; research progress; antiviral; anti-lysosomal storage disorders糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，其临床主要 诊断特点是高血糖。

1969-1970年瑞士山道士公司在巴塞尔微生物研 究所进行抗真菌药物筛选时,从美国和挪威土壤 中分离到两种不完全真菌即光泽柱孢菌和多孔木 霉(后正名为雪白白僵菌)产生窄谱抗真菌抗生素 即环孢素。


1974年进行动物体内免疫抑制活性研究 1978年首次应用于临床肾移植实验 1980年实现CsA全合成 1983年FDA批准用于临床器官移植
中性十一环肽化合物

作用机制： 抑制T细胞活化过程中IL-2 基因的转录 增加TGF-β的表达

IL-2： 活化的T细胞产生 T细胞增殖和产生细胞因子 B细胞增殖分泌抗体
NF-AT

是一种T细胞特异性转录因子 完整的NF-AT有两个亚基组成： NF-Atn位 于核内， NF-Atc位于胞浆内


是第一个用专门设计的免疫抑制剂筛选模型筛选 出来的免疫抑制剂, 同时发现具有抗真菌活性 1988年阐明结构
1989年完成化学合成
1994年FDA批准作为器官移植用的免疫抑制剂应用
于临床

在结构上与CsA不相关，但两者作用机制相似，均 通过钙调磷酸酶的作用而阻断IL-2 的转录

不同点： FK506胞内的结合蛋白为 FKBP, FK506的肾毒性要比CsA小得多，因而治疗 窗口要大得多 FK506免疫抑制作用约为CsA的100倍，不良 反应亦较CsA少，故有望取代CsA成为器官 移植术后首选的免疫抑制剂 联合用药亦可取得协同效应
化学性质：



是一种中性、高亲脂性的由11个氨基酸组 成环聚肽免疫抑制剂。 氨基酸序列变异大，尤其是在2位 除CsA外，其天然的同系物有30多种
Me Me CH (MeLeu) CH2 Me

在糖尿病治疗中的应用
微生物来源胆固醇生物合成酶抑制剂
随着人们生活水平的提高，生活节奏的加快， 肥胖症、高脂血症正日益影响着人类的健康。
血液胆固醇含量过高，即高胆固醇血症，是 产生动脉粥样硬化，进而引发一系列疾病如 冠心病、心肌梗塞等的始动环节
在这一过程中涉及了许多酶促反应
血脂：中性脂肪（甘油三酯(TG)和胆固醇 （C） 一种为分子生物学的分类，根据末端氨基酸序列 及编码基因的位点来分，可分为四类（Ambler 分类） ：
A类，为丝氨酸酶，由质粒编码
B类，为金属酶，由染色体编码
C类，为丝氨酸酶，由染色体编码
D类，为丝氨酸酶，由质粒编码
另一种为临床上较为实用的分类方法，是 根据各种酶的底物及抑制剂类型分成五型 （Bush-J-M分类） ： ①CEP-N酶， ②PEN-Y酶， ③BSD-Y酶， ④EBS-Y酶即ESBLS（超广谱酶） ⑤金属酶。
（三）酶抑制剂的筛选
寻找新药取得成功基于以下诸因素： 微生物分离 筛选模型的有效性 发酵条件 所需的化合物的分离
其中关键在于建立有效的筛选模型
β-内酰胺酶抑制剂筛选模型
产色头孢菌素法：Nitrocefin(头孢硝噻吩) 是一种反应性很强的头孢菌素，易被β-内 酰胺酶水解，颜色由黄色转变为红色，提 取物或发酵液中如有抑制剂存在，则 Nitrocefin 颜色不变
他汀类药物的非调脂作用
抗凝固作用 改善内皮细胞功能作用 抗炎症作用 抗骨质疏松作用 抗肿瘤作用 预防痴呆 防治慢性心力衰竭 防治高血压 防治周围动脉疾病 抗心律失常 保护心脏瓣膜
毒副作用较少 肌病（CPK） 肝毒性（谷丙和谷草转氨酶）
1998年美国心脏协会（AHA）主席指出， 我们面临一场"脂质革命"，进入了一个"他 汀"的全新时代。他汀类药物在动脉粥样硬 化的预防方面的贡献和成就将至少相当， 甚至超出青霉素问世对传染性疾病和风湿 热预防的贡献与成就。

Ｓ Ｍ ＡＤＺ 公 司 。 Ｈ１ Ｕ
具有 ａ葡萄糖苷 酶抑制 活性 的药 物用于 临床 。这 三种 一 药物 中 ， 一种是直 接从 微 生物 次级 代 谢产 物 中 提取 活
性 物质 ， 而开发 为药物 ， 进 另外 两种 是先从微 生物次 级
１ ２ 培 养基和 培养条 件 ．
代谢产物 中发现其 先导 物 ， 而对 先 导物 进 行结 构 改 进 造开发成 药 物 。经 ａ葡萄 糖 苷 酶 抑 制 剂 筛 选 模 型 对 一 ３ ０ 余 株微生 物菌株 的次级代 谢产 物 进行 筛选 ， 中 ００ 其 编号为 ５ ６ ５ ０ １７的菌 株 的次 级代 谢 产物 对 ａ葡萄 糖苷 一
公司。
过 ＨＩ ｌｌ大孑 酚醛 弱 酸性 阳离 子交 换树 脂 柱 （ 析柱 Ｌ 层
规格 ： ｍ×１ ０ ｃ 装 柱 树脂 １Ｌ 流 速 为 ３ ５倍 ６ｅ ０ ｍ， ， ～
柱体 积 ・ｈ ） ３倍 柱体 积纯 水 洗柱 ， ， 再经 ０ ５ｍｏ ・ ． ｌ
Ｌ 氨水 洗 脱 ， 收集 洗脱 液活 性 组 分 。将 收 集 的 活性
对 ５６５ ０ １ ７茵株 次 级代 谢 产 物 的 活 性成 分进 行 分 离纯化 ， 所得 样 品 呈 白 色粉 末 状 ， 外 活 性 约 为 药物 拜 唐 苹 的 １ 体 Ｏ倍 。 通 过 ＨＰ Ｃ 紫外 光谱 、 、 Ｌ 、 ＭＳ ＮＭＲ分 析 ， 定 该 活性 成 分的 结 构 是 ４ ，－ 羟 基 异 黄 酮 ， 子 式 为 Ｃ 。 确 ７二 分 。Ｈ。 。 ０ 关 键 词 ： 葡萄 糖 苷酶 抑 制 剂 ； 离纯 化 ； 构 鉴 定 分 结 中图 分 类号 ： ８ Ｒ ２ ４ ２ Ｑ ７ ９ ８ ． 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ４ ５ ２ ０ ） Ｏ ０ ８ Ｏ １ ７ ～５ ２ （ ０ ７ １ —Ｏ ３ 一 ３

微生物生长抑制剂的筛选与分离微生物生长抑制剂是目前应用广泛的一类生物农药，它对有害微生物有强烈的杀灭和抑制作用，能有效地控制农业生产中的病害，同时具有环保、安全等优势。

因此，如何筛选分离出高活性的微生物生长抑制剂成为了研究的热点。

一、微生物生长抑制剂的筛选方法微生物生长抑制剂的筛选方法主要分为物理筛选和生物筛选两大类。

1.物理筛选物理筛选主要通过光谱、质谱、四极杆等仪器设备对样品进行测定。

在这种方法中，可以通过检测目标物质所特有的品质特征来进行筛选，从而找到具有生长抑制剂活性的物质。

例如，在草酸亚铁筛选中，可以通过草酸亚铁与生长抑制剂之间的络合反应来测定该物质的含量。

2.生物筛选生物筛选主要采用微生物样品作为研究对象，通过培养基的选择和微生物特有的生化反应来筛选出具有生长抑制剂活性的微生物样品。

这种方法是最常用的生物学方法之一，可以利用微生物之间的相互作用来筛选出具有生长抑制剂活性的微生物。

二、微生物生长抑制剂的筛选流程微生物生长抑制剂的筛选流程主要包括样品收集、分离、鉴定、活性筛选和特征检测等环节，每一环节都非常重要。

1.样品收集样品的选择非常重要。

首先需要确定需要筛选的目标作物，然后在此基础上选择不同来源的样品。

例如，需要筛选对西瓜病有生长抑制剂活性的微生物，则应选择西瓜的根、茎等样品作为收集对象，使筛选结果具有针对性。

2.分离首先对选定的样品进行体外洗涤和消毒处理，然后分离出目标微生物，通过胶层将其分离到单个克隆，并在选定的培养基中进行培养，使其形成纯种菌群。

3.鉴定在纯种培养基中进行生长后，需要对筛选出的微生物进行形态学、生理生化鉴定、基因序列检测等方面的研究，以确定是否为目标微生物，并了解其特点和生长环境。

4.活性筛选通过培养基中添加不同浓度的生长抑制剂，观察菌落的变化，筛选出具有生长抑制剂活性的微生物。

同时，可以与其他微生物混接培养，判断是否具有抑菌作用。

5.特征检测对于筛选出的具有抑菌作用的微生物，在活性鉴定之后应该对其启示菌株、表达基因等特征进行检测，并分离出其抑制剂成分。

微生物来源的昆虫几丁质酶抑制剂的筛选与分离纯化张洪斌;刘明艳;田玉敬;胡雪芹【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2010(031)023【摘要】通过对筛选条件进行优化,建立可靠的平板透明圈初筛方法和DNS比色复筛方法;以棉铃虫几丁质酶作为筛选靶标并用此筛选模型对500多株菌株进行筛选,筛选出包括A0901#菌株在内的具有几丁质酶抑制作用的活性菌株29株.采用活性追踪的方法对A0901#菌株发酵产物进行分离纯化,通过乙醇沉淀、Sevag试剂除蛋白及Sephadex G-100凝胶色谱得到一个纯的活性物质,经HPLC检测显示在保留时间15min左右为-单峰,DNS比色法验证其抑制率为54.2%,红外、质谱、元素分析表明此物质的分子式为C9H18O10,并证明其为一个多羟基的化合物.【总页数】5页(P271-275)【作者】张洪斌;刘明艳;田玉敬;胡雪芹【作者单位】合肥工业大学化工学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学化工学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学化工学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学化工学院,安徽,合肥,230009【正文语种】中文【中图分类】Q939.97【相关文献】1.放线菌A0101发酵产物中几丁质酶抑制剂的分离纯化及性质研究 [J], 顾东华;张洪斌;李秋萍;李瑶;胡雪芹2.海洋微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及性质研究 [J], 倪孟祥;马丽娜3.由真菌产生的大分子昆虫几丁质酶抑制剂的筛选和活性鉴定 [J], 吴霞4.微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用 [J], 于彩云;赵莉莉;张晶晶;魏涛5.海洋微生物几丁质酶分离纯化及其抗真菌活性 [J], 丁存宝;刘海燕;贾长虹;张俊杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。