微生物来源的酶抑制剂的筛选

谷胱甘肽转移酶（GST）还原型谷胱甘肽占绝大多数。

谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。

GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。

GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。

通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。

研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。

因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。

与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。

近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。

抗肿瘤药物与GSH作用模式图：图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起，其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤；③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。

机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。

能抑制α-淀粉酶的抑制剂如链霉菌YM-25菌株产生的hairm；链霉菌S. corchoruchii菌株产生的paim以及链霉菌S. dimorph ogenes菌株产生的萃他丁(trestatin)等都是α-淀粉酶抑制剂，它们对不同来源的α-淀粉酶均显示出强的抑制作用，但不抑制β-淀粉酶和β-糖苷酶。

以萃他丁为例：它含有A,B,C三个组分的α-淀粉酶抑制剂属于低聚糖同系物。

它是无色粉末，紫外光谱呈末端吸收，对蒽酮、酚-硫酸呈阳性反应，对坂口、红四唑呈阴性反应。

Trestatin对猪胰α-淀粉酶、曲霉α-淀粉酶、枯草杆菌α-淀粉酶都有抑制作用，但不抑制β-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶。

国外α-淀粉酶抑制剂研究起步较早，早在上世纪四十年代就有小麦种子中α-淀粉酶抑制剂的报道[5~7]。

它是一种电迁移率为0.2，分子量为21000的蛋白质。

但在随后的25年间很少有这方面的报道[8]。

之后Shainkin和Birk[9]提出小麦粉中存在两种α-淀粉酶抑制剂，并阐述了它们的分离和性质。

它们的电迁移率不同，对不同来源的α-淀粉酶专一性不同。

从后来的研究[10~14]知道：它们在小麦种子中是多分子形式的蛋白质，能不同程度的抑制昆虫和哺乳动物的淀粉酶。

1945又在普通大豆上有过报道[15~16]，1972年α-淀粉酶抑制剂曾经在微生物上有过报道，因其在医药上的价值而被广泛研究。

α-淀粉酶抑制剂在20世纪70年代被深入研究，在20世纪80年代和90年代，由于发现其在医学上的重要性，尤其在抑制糖尿病和高血糖以及对昆虫选择性控制等方面具有重要作用而加速研究[17]。

70年代以来，已研究发现100多种来自植物和微生物的抑制α-淀粉酶的活性物质，有的已经进入临床实验[18]。

微生物来源的糖苷水解酶抑制剂的筛选研究在近些年来已成为比较活跃的领域之一，尤其在联邦德国和日本。

现已报道的这类酶抑制剂20~30种。

Namiki等报道从一株链霉菌发酵液中分理出一种新的寡糖类α-糖苷水解酶抑制剂Adiposin。

产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达摘要：脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，广泛应用于食品、制药和生物工程等领域。

本文旨在概述产脂肪酶微生物的筛选方法以及如何克隆和表达脂肪酶基因。

通过筛选出高产脂肪酶的微生物，并利用基因克隆技术将其基因表达，可以为大规模生产纯脂肪酶提供基础。

1. 引言脂肪酶是一种催化脂质的水解反应酶，广泛存在于微生物中。

它们通过将脂肪酯水解为脂肪酸和甘油，起到重要的催化作用。

因此，寻找高产脂肪酶的微生物，并将其脂肪酶基因克隆和表达，具有重要的应用价值。

2. 产脂肪酶微生物的筛选产脂肪酶的微生物广泛存在于土壤、水体和动物消化系统等环境中。

筛选产脂肪酶微生物的方法主要有：直接筛选法、改进筛选法和基因工程筛选法。

2.1 直接筛选法直接筛选法是最常见也是最简单直接的方法之一。

通过将微生物菌株进行培养，然后检测菌液中产酶能力。

其中，利用酶抑制剂和显色剂的方法可以进行定性和定量的检测。

该方法的优点是操作简便，易于操作。

2.2 改进筛选法改进筛选法通过加入酶诱导剂、化合物诱导剂和高浓度含油样品等方式，提高产脂肪酶的微生物菌株筛选效果。

例如，可使用大豆油、浓缩桔子油等作为诱导剂，增强菌株胞外酶的产酶能力。

2.3 基因工程筛选法基因工程筛选法是利用基因工程技术构建含有脂肪酶基因的表达载体，转化到宿主菌株中，使其表达目标基因并产生脂肪酶。

这种方式可通过对基因进行改造和优化，提高脂肪酶活性和稳定性。

同时，基因工程筛选法还可以利用高通量筛选技术，如流式细胞术和高通量测序技术，提高筛选效率。

3. 脂肪酶基因的克隆和表达脂肪酶基因的克隆和表达是关键步骤，它们可以为脂肪酶的高效生产提供基础。

3.1 脂肪酶基因的克隆脂肪酶基因的克隆可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割和连接等方法实现。

首先，从目标微生物的基因组DNA或环境DNA中提取目标基因的DNA序列。

然后，使用特异性引物进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。