酶促DNA合成研究的进展

酶分子的改造方法及研究进展裴蓓10生物技术及应用班摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能，大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率，生产有价值的非天然酶。

本文对常见的酶分子的改造方法做了一个简单的介绍化学修饰法、生物酶工程法、定点突变法，最后结合当今的形式对酶改造的发展前景做了描述。

关键词：酶分子改造方法前景正文：1 酶分子改造的目标1.1 提高酶的稳定性1.2 提高酶的活性1.3 增强酶的选择性1.4 改变酶的表面特性2 改造酶分子的方法近年来，特别是随着蛋白质工程的(protein engineering)应用，即把分子生物学、结构生物学、计算生物化学结合起来，根据蛋白质结构与功能关系的知识，经过计算机辅助的分子设计，按照人类的需要，产生性能优良的酶分子。

就目前情况来看，现在常用的酶分子修饰方法有：2.1化学修饰法在应用过程中，有时会因酶的稳定性差、活力不够理想及具有抗原性等缺点而使其应用受到一定的限制，为此常需对酶进行适当再修饰加工，以改善酶的性能。

酶的修饰可分为化学修饰和选择性遗传修饰两类。

酶分子的化学修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造,造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状扩大酶的应用以达到较高的经济效益。

酶分子的化学修饰常见的方法有：部分水解酶蛋白的非活性主链，利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰，酶辅因子的置换等。

2.2生物酶工程法酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段。

随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定、基因重组技术的应用等，可以彻底地改造、合成并且模拟酶。

这也就是生物酶工程的主要内容。

生物酶工程主要包括基因工程技术生产酶和蛋白质工程技术改造酶两方面内容。

对自然酶的化学结构进行修饰以改善酶的性能的方法很多。

例如，a一淀粉酶一般有 Ca2+，Mg等金属离子，属于杂离子型，若通过离子置换法将其他离子都换成Ca2=，则酶的活性提高3倍，稳定性也大大增加；胰凝乳蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖酐结合，酶的空间结构发生某些细微改变，使其催化活力提高4倍；还有对抗白血病药物——天冬酰胺酶的游离氨基进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性也得到很大的提高。

dna酶促合成法DNA酶促合成法，也称为DNA合成酶法，是一种通过酶促反应合成DNA的方法。

该方法是通过DNA合成酶（DNA polymerase）催化DNA链的合成，经历DNA复制、转录和修复等过程，以实现DNA的合成。

DNA合成酶法通常包括以下步骤：DNA模板的制备、DNA酶的选择与准备、DNA合成反应条件的优化以及DNA合成产物的检测和应用等。

在DNA合成酶法中，首先需要准备优质的DNA模板。

DNA模板可以是从细菌、动植物等生物来源中提取的基因组DNA，也可以是经过PCR扩增得到的特定DNA片段。

DNA模板的制备需要保证其纯度和完整性，常用的方法有有机提取、酶切和凝胶电泳等。

选择合适的DNA酶对于成功进行DNA合成酶法至关重要。

DNA polymerase是一种能够催化DNA链的合成的酶，根据其来源、产地以及功能等方面的不同，可分为多个家族和亚型。

在DNA合成酶法中常用的DNA polymerase有Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymerase和Klenow fragment等，每一种DNA polymerase都有其独特的优点和适用范围。

DNA合成反应条件的优化是确保DNA合成效率和特异性的关键。

反应体系中的缓冲液、镁离子和dNTPs等组分需要根据所用的DNA polymerase的要求进行优化。

缓冲液可以提供适宜的pH和离子强度，镁离子可以作为DNA合成酶的辅因子，而dNTPs是DNA链的合成基本单元。

DNA合成反应的温度和时间等条件也需要根据所使用的DNA polymerase进行调整。

一般而言，DNA聚合酶反应的工作温度在37至72摄氏度之间，通常在50-70摄氏度之间能够获得较好的DNA合成效果。

此外，反应时间的长短与所需合成的DNA片段长度和目标浓度等因素有关。

检测和应用DNA合成产物是DNA合成酶法的重要环节。

常用的方法包括凝胶电泳、限制酶切和测序等。

酶催化反应机制及其研究进展酶催化是生命体系中一种重要的化学反应过程。

通过酶催化反应，生物体能够高效地合成、分解有机物质，维持正常的生命活动。

酶催化反应涉及多种生物化学过程，包括代谢环路、信号转导、DNA复制等。

了解酶催化反应机制及其研究进展，对于揭示生命体系的生物化学过程和研究开发新药物具有重要意义。

1. 酶催化反应机制酶催化反应的机制是一种复杂的生物化学过程。

酶是一种生物催化剂，可以加速化学反应的速率，但不改变反应物之间的化学结合能。

酶催化反应的机制一般可以分为两个主要方面：酶与反应底物的相互作用、酶催化过程中的过渡态和中间态。

酶与反应底物的相互作用：酶与反应物相互作用是酶催化反应的第一步，也是反应速率决定步骤。

酶通过其特定的结构与反应底物相互作用，形成酶底物复合物。

酶底物复合物的形成受多种因素影响，如温度、pH值、离子强度、酶浓度等。

酶催化过程中的过渡态和中间态：酶催化过程涉及多种反应中间态和过渡态。

酶与反应物的相互作用形成的酶底物复合物能够稳定反应物之间的化学结合能，从而降低反应能垒。

酶催化反应过程中产生的反应中间态和过渡态对反应的速率和选择性起重要作用。

有些酶能够诱导形成反应中间态，促进反应的进行。

有些酶则能够降低反应的自由能，并引导反应进入能量最低的通道。

2. 酶催化反应的研究进展在过去几十年中，酶催化反应的研究取得了巨大的进展。

随着生物化学和分子生物学技术的不断提高，研究者们能够更深入地了解酶催化反应的机制，并探索酶催化反应对于生命体系的重要性。

其中，一个重要的突破是对酶底物动力学的理解。

通过对酶底物复合物的结构和动力学特征的研究，研究者们能够更好地了解酶如何选择不同的反应底物，并探究反应底物与酶结合的方式和动态特征。

另一个重要的进展是对酶催化机理的理解。

研究者们通过结构生物学和分子动力学模拟等多种手段，探索酶催化过程中的关键反应中间态和过渡态，并发现酶在这些关键中间态和过渡态方面具有非常高的活性和特异性。

DNA-蛋白质交联的研究进展作者：黄康敏来源：《安徽农业科学》2019年第20期摘要;DNA-蛋白质交联（DNA;protein crosslinks，DPCs）是一种高毒性的DNA损伤，由紫外线、电离辐射以及甲醛等化合物诱导形成。

DPCs会阻碍DNA复制，造成DNA双链缺口，影响基因组的稳定性。

目前，研究发现酵母的蛋白酶Wss1和后生动物的蛋白酶SPRTN通过蛋白水解作用参与了DPCs的修复途径，为阐明DPCs的修复机制奠定了基础。

对DPCs 的影响因素及修复途径进行总结，为DPCs的深入研究提供了一些思路。

关键词;DNA-蛋白质交联;DNA修复;Wss1;SPRTN中图分类号;R114文献标识码;A文章编号;0517-6611（2019）20-0018-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.005开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Research Progress of DNA;Protein CrosslinksHUANG Kang;min;（Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang，Guizhou 550000）Abstract;DNA;protein crosslinks（DPCs） are highly toxic DNA lesions，DPCs arise by UV;light，ionizing irradiation，are particularly caused by reactive compounds such as formaldehyde.DPCs interfere with DNA replication and transcription，which could result in double strain break （DSB），and affect the stability of genome.It was found that the metalloproteinase Wss1 of yeast and the protease SPRTN of metazoan participated in the DPCs repair through proteolysis，laying a foundation for elucidation of the mechanism of DPCs repair.This review summarized the influencing factors and pathway of DPCs repair，and provided some ideas for further research on DPCs.Key words;DNA;protein crosslinks;DNA repair;Wss1;SPRTN在細胞的生命活动中，各种外源性和内源性因子（如紫外线、活性氧等）会造成DNA损伤，从而导致突变、癌变，甚至死亡[1]。

合成生物学研究报告01合成生物学的概念合成生物学是以工程学理论为指导，设计和合成各种复杂生物功能模块、系统甚至人工生命体,并应用于特定化学物生产、生物材料制造、基因治疗、组织工程等的一门综合学科。

合成生物学包含工程学的理念，而任何一个生命体系可以看作是具有不同功能的生物零件的有序组合。

合成生物学的目的在于设计和创造新的生物组件和体系，对现有的生物体系进行重新设计。

从基本的生物组件构建复杂的人工生命体系，对整个生命过程进行重新设计、改造、构建。

合成生物学的研究应用主要包括两个方面：一是“自上而下”的方法，通过对现有的、天然存在的生物系统进行重新设计和改造，修改已存在的生物系统，使之增添新的功能（从基因组中剔除非必要基因组）；二是“自下而上”的方法，通过设计和构建新的生物元件、组件和系统，创造自然界中尚不存在的人工生命系统（从核苷酸合成新的生命体）。

图：合成生物学的内涵资料来源：中国发展门户网02合成生物学的里程碑事件2000年，美国科学家JamesJ.Collins开发出了遗传开关，这通常被认为合成生物学的开端。

2010年，Craig Venter创造出了第一个人造生命。

之后合成生物学快速发展，出现了非天然核酸、蛋白质从头设计、单条染色体酵母和大肠杆菌基因组全合成等一系列里程碑式的工作。

合成生物学的发展大体经历了3个阶段：第一阶段，创建时期（2000—2003年）：产生了许多具备领域特征的研究手段和理论，特别是基因线路工程的建立及其在代谢工程中的成功运用。

第二阶段，扩张和发展期（2004—2007年）：这一阶段的特征是领域有扩大趋势，但工程技术进步比较缓慢。

第三阶段，快速创新和应用转化期（2008—2013年）：这一阶段涌现出的新技术和工程手段使合成生物学研究与应用领域大为拓展，特别是人工合成基因组的能力提升到了接近染色体长度的水平，基因组编辑技术出现前所未有的突破。

图：2000—2018年合成生物学研究的代表性进展资料来源：中国发展门户网图：以“synthetic biology”为关键词的文章增量资料来源：pubmed03合成生物学的基本模块与传统生物工程相比，合成生物学最大的进步在于对工程设计原理的系统性应用：依据工程设计原理对天然存在的各种酶、调控分子等进行简单化、模块化处理，设计出具有各种基本功能的元件。

１．分子酶的研究进展分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展更优良的新酶或新功能酶。

１．１酶分子的定向改造和进化分子酶工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。

体外定向进化是近几年新兴的一种蛋白质改造策略，可以在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。

此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并已在短短几年内取得了令人瞩目的成就，易错ＰＣＲ和ＤＮＡ改组就是其中２种方法。

１．２融合蛋白与融合酶蛋白质的结构常常可以允许某个结构域的插入与融合。

ＤＮＡ重组技术的发展与应用使不同基因或基因片段的融合可以方便地进行，融合蛋白经合适的表达系统表达后，即可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白。

目前，融合蛋白技术已被广泛应用于多功能工程酶的构建与研究中，并已显现出较高的理论及应用价值。

随着基因组、后基因组时代的到来和重组酶生产技术的开发，必将会有大量的、新的酶蛋白被人类发现。

１．３酶的人工模拟模拟酶是根据酶作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。

它们一般都具高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶简单；由于不含氨基酸，其热稳定性与ｐＨ稳定性都大大优于天然酶。

目前用于构建模拟酶的模型有环糊精、冠醚、卟啉抗体酶和分子印迹等。

２．酶工程的应用进展２．１活性多肽的开发研究近年来，人们利用酶工程技术来开发功能性活性肽取得了很大的进展。

生物活性肽是蛋白质中２０种天然氨基酸以不同排列组合方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。

dna探针的合成方法一、DNA探针的重要性。

1.1 DNA探针就像是一把神奇的钥匙。

在基因检测、疾病诊断等众多生物科学领域，它起着至关重要的作用。

它能够特异性地识别目标DNA序列，就像一把钥匙开一把锁一样精准。

这对于我们了解生物的基因组成、探寻疾病的根源等，那可是不可或缺的。

1.2 打个比方，如果把基因世界看作是一个巨大而复杂的迷宫，DNA探针就是那指引方向的小箭头。

它能帮助我们在这个迷宫中找到我们想要研究的特定基因片段，这意义可太大了。

二、化学合成法。

2.1 化学合成法是合成DNA探针比较常用的一种方法。

这种方法就像是搭积木一样。

我们通过化学反应，一个一个地把核苷酸连接起来。

化学家们就像技艺精湛的工匠，按照预定的顺序，精心地构建着DNA探针的序列。

2.2 不过呢，这种方法也有它的局限性。

它合成的长度通常较短，如果要合成较长的DNA探针，就像要搭一个超级长的积木塔，难度可就大大增加了，很容易出现错误。

而且成本也会随着长度的增加而迅速上升，就像物价飞涨一样，让人有点吃不消。

三、酶促合成法。

3.1 酶促合成法那可就有点像借助生物自身的力量来办事了。

这里面最常用的酶就是DNA聚合酶。

这个酶就像是一个勤劳的小助手，以一段已知的DNA为模板，按照碱基互补配对的原则，把游离的核苷酸添加到新合成的DNA链上。

这就好比照着图纸盖房子，只要图纸准确，盖出来的房子（也就是合成的DNA探针）就错不了。

3.2 但是呢，这个方法也不是十全十美的。

它对模板DNA的要求比较高，如果模板DNA有一点小问题，就像盖房子的图纸有点瑕疵，那合成出来的DNA探针可能就会有偏差。

而且酶促反应的条件比较苛刻，就像伺候一个娇贵的小宠物，温度、pH值等环境因素稍微有点不对，反应就可能进行得不顺利。

四、从mRNA合成法。

4.1 从mRNA合成法也是一种不错的途径。

我们都知道mRNA是DNA转录的产物，就像DNA的一个信使。

我们可以利用逆转录酶，把mRNA这个信使的信息反转录成DNA，然后再经过一些后续的处理，就得到了我们想要的DNA探针。

DNA的滚环扩增合成研究刘淑贞;张志庆;王芳;周亭;王秀凤;张国栋;刘婷婷;张洪芝【摘要】滚环扩增(RCA)反应作为一种简单高效的等温酶促反应,现已发展为核酸扩增领域的新技术,其产物在组装体搭建和多功能材料的制备方面有着广泛的应用.本文采用琼脂糖凝胶、紫外和透射电镜(TEM)等手段,探究了时间、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTPs)、酶以及引物的浓度等因素对脱氧核糖核酸(DNA)滚环扩增产物的影响.结果表明:在反应开始的前30 min,RCA产物的长度受时间的影响比较明显;随着dNTPs浓度的提高,RCA产物的链长增长,浓度也不断提高;酶和引物的浓度对滚环扩增产物的长度没有明显影响,但对RCA产物浓度的影响较大,过量的酶致使RCA产物的含量显著下降.%Rolling circle amplification (RCA) is a simple and efficient isothermal enzymatic reaction,which has developed as a novel technology in the field of nucleic acid amplification.Its product has a wide range of applications in the assembly and preparation of multi-functional materials.Here,we report the effects of reaction time and the concentrations of deoxyribonucleoside triphosphates(dNTPs),polymerase,and primer on the product of RCA.The RCA product was characterized by methods including agarose gel electrophoresis,ultraviolet spectroscopy,and transmission electron microscopy (TEM).The results showed that the length of the RCA product was significantly affected by the reaction time,especially when the reaction time was less than 30 min.With an increase of dNTPs concentrations,the concentration and chain length of the RCA productincreased.However,while the concentrations of enzyme and primer hadlittle effect on the length of the RCA product,they had a large effect on its concentration.It is worth noting that the content of the RCA product decreased significantly in the presence of excess enzyme concentration.【期刊名称】《物理化学学报》【年(卷),期】2017(033)010【总页数】6页(P2052-2057)【关键词】滚环扩增技术;核酸;dNTPs;聚合酶;引物【作者】刘淑贞;张志庆;王芳;周亭;王秀凤;张国栋;刘婷婷;张洪芝【作者单位】中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580;中国石油大学(华东)理学院,山东青岛266580【正文语种】中文【中图分类】O648近年来，分子生物学和生物化学发展迅速，新的核酸扩增技术不断涌现，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)反应作为一种简单高效的等温酶促反应发展迅速，现已成为核酸扩增技术的新宠1。

酶工程的研究进展黎海彬,郭宝江(华南师范大学生命科学学院,广东广州510631)摘要:酶工程是现代生物技术的重要组成部分,它作为一项高新技术将为工业的发展起重要推动作用。

介绍了自然酶的开发、酶的化学和遗传修饰、酶的固定化、人工合成酶、酶基因的克隆和表达、酶的遗传设计等方面的理论和技术研究的最新进展。

关键词:酶工程;人工合成酶;酶基因的克隆和表达;固定化;遗传修饰中图分类号:Q814　文献标识码:A 文章编号:0253-4320(2006)S1-0040-04Advance in research on enzyme engineeringLI Hai 2bin ,G UO Bao 2jiang(C ollege of Life Science ,S outh China N ormal University ,G uangzhou 510631,China )Abstract :Enzyme engineering is an important part of m odern bio 2technology ,it will give an impetus to the industries as a new hi 2technology.The new advance in enzyme engineering research such as development of natural enzymes ,chemical and genetic m odification of enzymes ,imm obilization of enzymes ,synzymes ,cloning and expression of enzyme genes and genetic design of enzymes are introduced.K ey w ords :enzyme engineering ;synzymes ;cloning and expression of enzyme genes ;imm obilization ;genetic m odification　收稿日期:2006-03-30;修回日期:2006-06-03　作者简介:黎海彬(1964-),男,博士后,副教授,主要从事生物工程及生物物质分离纯化的研究,013005152637,haibinli2000@s 。