倍半萜合成酶基因 麦角固醇 生物合成

此文酶序DDX 动力基序甚至AFU 中得将极文指导教师在搜列搜寻到其它XXD/E 基序和，进行了大量和DXX(S,T)X ，还预测超氧UA_3G14710在得到cover 了40极大颠覆人们对搜寻某些生物合物质中存在同DXX(S,T)XXX 量实验，以期推XXX(E,D)结构氧化物麦角固醇在体外试验中证0%区域，同源对blast的使用和合成酶的过程中源的基因，虽X(E,D)结构域（推翻现在所存在域。

醇合成必须的超证实是双加氧酶源性30%左右的和科学认知，进中创造性的使用虽然这些搜寻到（NSE/DTE 模在的巨量SCI 所超氧化物酶，利酶（2013年体内的两个基因（下进一步证实武汉用blast 搜寻技术到的这些基因缺模体），但利用所总结的共识---利用某个2007年内实验不能证实下图），然后进汉大学所引进院术，如根据某些缺乏倍半萜环化用其所在实验室-倍半萜环化酶年文献报道的霉实），运用bla 进行敲除及体外院士团队的副教仅供参考，些已知的倍半萜化酶所必需的室公共试剂及免酶不需要DDXX 霉菌中ast 方法，在该外实验，若能成教授科研水平。

------个人阅不承担任何责萜环化免费劳XD/E 该霉菌成功，。

阅读感责任。

摘要萜类化合物是植物界广泛存在的一种次生代谢物质，其种类繁多，不仅在植物的生命活动中扮演着重要的作用，而且还广泛应用于工业，食品，医疗卫生，化妆品等方面；近年来，人们对萜类化合物及萜类生物合成途径的研究不断深入，并已经从传统的化学合成转入了分子生物合成的领域;萜类合成酶是萜类次生代谢产物合成的关键酶，萜类合成酶基因的克隆、分离、表达和调控成为了人们研究萜类生物合成的重点；以基因工程手段克隆关键酶基因，研究基因的功能及相关特性，在此基础上选择性地调控其生物合成路径，可望实现更多有用的倍半萜类化合物分离和鉴定，为萜类化合物这一数量最多的天然产物的开发利用展现诱人的前景。

本课题通过链霉菌Streptomyces davawensis JCM 4913 和S. venezuelae ATCC 10712基因组进行分析，发现BN159_1440基因和SVEN_0552基因同已报导的倍半萜类合酶pentalenene synthase的基因有一定的同源性，将其分别进行基因的克隆，在链霉菌中异源表达，通过不同于野生型菌株的异源宿主，使其功能得到表达，探索其可能的生物功能，一方面将其进行体内的基因敲除，同野生型的菌株同批发酵，对比基因敲除后产物的变化；体外进行蛋白的超量表达及分离纯化，加入底物及相关辅酶及辅离子进行体外的反应，探究BN159_1440基因和SVEN_0552基因的萜类合酶的相关功能，检测分离更多的萜类化合物。

同时对于三萜类化合物超氧麦角固醇中氧桥的形成进行了相关的探究，可能是由相关的双加氧酶的作用过程，通过基因序列的比对分析，对于烟曲霉NRRL 1979菌株中AFUA_8G00480和AFUA_3G14710两个基因均有可能具有双加氧酶的功能而完成这一氧桥的形成过程，将这两个基因分别进行克隆构建重组载体，体内采用农杆菌介导转化的基因敲除，同野生型的菌株同批发酵，对比基因敲除后产物的变化；体外将其进行蛋白的超量表达分离纯化，进行体外的反应，探究其双加氧酶的功能。

关键词：萜类化合物 萜类合酶超氧麦角固醇双加氧酶AbstractTerpenoids，a kind of secondary metabolites are widely exist in the plant, the type is various, not only play an important role in plant life activities, but also widely used in industry, food, health care, cosmetics and so on; In recent years, the research of terpenoids and terpenoid biosynthetic pathway have been advanced, and has been transfered from the traditional chemical synthesis into the field of molecular biology synthesis; terpenoids synthetase is the key enzyme of terpenoids secondary metabolites synthesis, the gene cloning, separation, expression and regulation of terpenoids synthetase has become the focus of the study about the biosynthesis of terpenoids. Through gene cloning by genetic engineering, to research the function and related peculiarity, on the basis of selectively regulate its biosynthesis paths, is expected to achieve more useful sesquiterpenoids isolation and identification, as terpenoids as the largest of the development and utilization of the natural products show tempting prospects.Acording to the Streptomyces davawensis JCM 4913 and Streptomyces venezuelae ATCC 10712 genome analysis, this topic found the BN159_1440 and SVEN_0552 genes are homologous of pentalenene synthase to a certain extent，which reported is a kind of terpenoids synthase gene, they were proceeded separately with the gene cloning, the heterologous expression in Streptomyces, the gene deletion in vivo, the excess protein expression and purification in vitro , the reaction in vitro by joining the substrate and the relevant coenzyme and auxiliary ionic, to explore the terpenoids synthase functions of the BN159_1440 and SVEN_0552 genes, to separate and identify more terpenoids .At the same time,we researched the formation of oxygen bridge in the struction of ergosterolperoxide, a compound of the triterpenes,It may be the catalytic process of a kind of dioxygenase; through the analysis of the gene sequence alignment,theAFUA_8G00480 and AFUA_3G14710 genes in the Aspergillus fumigatus NRRL1979 all could have the function of a dioxygenase to complete the formation of the oxygen bridge,they were proceeded separately with the gene cloning to build a restructuring of the carrier, the gene deletion by agrobacterium mediated transformation, the excess protein expression and purification in vitro, the reaction in vitro, to explore their functions of dioxygenase.Keywords: terpenoids sesquiterpenoids terpenoids synthase ergosterolperoxide dioxygenase缩略语（Abbreviations）实验常用缩略语简介表简称全称中文释义aa amino acid 氨基酸aac(3)Ⅳapramycin resistan gene 安普霉素抗性基因attB attachment site of bacterium chromosome 细菌染色体上噬菌体附着位点attP attachment site of phage 噬菌体DNA上的附着位点Amp ampicillin 氨苄青霉素Apr Apramycin 安普霉素（阿泊拉霉素）BSA Bolive serum albumin 牛血清白蛋白Blaβ-lactimase gene Amp 氨苄青霉素抗性基因bp base pair 碱基对cat chloramphenicol resistance gene 氯霉素抗性基因cos cohesive end λ 噬菌体包装位点CCC covalently closed circular DNA 共价闭合环状DNACoA coenzyme A 辅酶ACmL chloramphenicol 氯霉素DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜dATP deoxyadenosine triphosphate 脱氧三磷酸腺嘌呤核苷酸dNTP deoxyNu cleotide triphosphates 脱氧核苷三磷酸D-GAP D-Glyceraldehyde 3-phosphate D-甘油醛3-磷酸DHAP Dihydroxyacetone phosphate 磷酸二羟丙酮DMAPP Dimethylallyl diphosphate 二甲基烯丙基焦磷酸酯DXP 1 -Deoxy-D-xylulose 5-phosphate 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸DXS 1 -Deoxy-D-xylulose 5-phosphate Synthase 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶DXR 1 -Deoxy-D-xylulose 5-phosphate Reductoisomerase 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原酶异构化酶ermE erythromycin resisitance gene 红霉素抗性基因exo exonuclease gene 核酸外切酶基因与bet 共同促进重组EDTA ethylene diaminetetraacetic acidFPLC Fast protein liquid chromatography 快速蛋白液相色谱G－gram-negative 革兰氏染色阴性G＋gram-positive 革兰氏染色阳性G＋C% percentage of G+C content GC 百分含量GC-MS Gas Chromatograph-Mass Spectrometer-computer 气相色谱-质谱联用仪H hour 小时HPLC high performance liquid chromatography 高效液相色谱HMGR 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 三羟基三甲基乙酰辅酶A还原酶HMGS 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase 三羟基三甲基乙酰辅酶A合酶Int gene encoding for integrase of phage 噬菌体整合酶基因IPTG isopropyl-β-D-thiogalaetopyranoside 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPP Isopentenyl diphosphate 3-甲基-3-丁烯基二磷酸酯KDa kilodalton 千道尔顿Kan kanamycin 卡那霉素Kb kilobases(pairs) 千碱基对LC-MS high performance liquid chromatography-mass spectrum 高效液相色谱-质谱联用LC-MSn high performance liquid chromatography-mass spectrumfragmention minute高效液相色谱-多级质谱联用min minute 分钟Mb mega base(pairs) 百万碱基对MS mass spectrum 质谱MVApathwayMevalonate pathway 甲羟戊酸途径MEP pathway 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway 2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸途径neo kanamycin resistance gene 卡那霉素抗性基因NRPS non-ribosomal peptide synthase 非核糖体肽酶OD optical density 光密度值ORF open reading frame 开放阅读框ori odgin of replication 复制起始位点oriT origin of transferPAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应PKS polyketide synthase 聚酮合酶PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液rec gene encoding for recombinase 重组酶基因rep replicon 复制子rpm rotations per minute 转/分Rif rifadine 利福平S sensitivity 敏感性SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠tsr thiostrepton resistance gene 硫链丝菌素抗性基因Thio Thiostrepton 硫链丝菌素TAE Tris-acetatic acid EDTA buffer Tris -乙酸- EDTA 缓冲液TE buffer Tris-EDTA-NaCl buffer Tris-EDTA-NaCl 缓冲液ThPP Thiamine pyrophosphate 硫胺素焦磷酸TIM Triosephosphate Isomerase 磷酸丙糖异构酶目录摘要 (I)Abstract....................................................................................................................... I II 缩略语（Abbreviations） (V)第一章 绪论 (1)1.1萜类化合物的概念及分类 (1)1.1.1单萜 (1)1.1.3 二萜 (5)1.3.4三萜 (6)1.3.5四萜和多萜 (7)1.2 萜类化合物的合成 (7)1.3 萜类化合物的应用 (11)1.3.1抗肿瘤活性 (11)1.3.2抗病毒活性 (11)1.3.3抗炎活性 (12)1.3.4抗菌活性 (12)1.4 S. davawensis JCM4913的简介 (12)1.5 S. venezuelae ATCC 10712的简介 (14)1.6 链霉菌中的异源表达宿主S. albus J1074和S. livindans TK24的简介 .. 141.7 烟曲霉NRRL1979简介 (14)第二章实验材料和方法 (15)2.1 实验所用的菌株 (15)2.2 实验所用的质粒和黏粒 (16)2.3 实验设计的引物 (19)2.4 缓冲液及溶液 (21)2.6 实验常用的抗生素 (26)2.7 试验中所用工具酶及化学试剂 (26)2.8 实验仪器 (27)2.9 实验方法 (28)第三章实验结果与分析 (38)3.1 S. davawensis JCM4913中倍半萜类合酶的基因挖掘 (38)3.1.1 BN159_1440基因的序列比对及功能分析 (38)3.1.2将BN159_1440基因在链霉菌中的异源表达 (38)3.1.3 BN159_1440基因异源表达的发酵与检测 (40)3.1.4 含P ermE*和aac(3)IV 基因的pWHU1647的构建 (41)3.1.5 BN159_1440基因的体内敲除重组质粒pWHU1655的构建 (43)3.1.6 BN159_1440基因敲除突变株的获取以及验证 (44)3.1.7 BN159_1440的蛋白表达与纯化 (46)3.1.8 小结 (47)3.2 S. venezuelae ATCC 10712中倍半萜类合酶的基因挖掘 (48)3.2.1 SVEN_0552基因的序列比对及功能分析 (48)3.2.2将SVEN_0552基因在链霉菌中的异源表达 (48)3.2.3 SVEN_0552基因异源表达的发酵与检测 (50)3.2.4 SVEN_0552基因敲除重组质粒pWHU1656的构建 (51)3.2.5 SVEN_0552基因敲除突变株的获取以及验证 (52)3.2.6 SVEN_0552的蛋白表达与纯化 (53)3.2.7 SVEN_0552蛋白的体外反应 (54)3.2.8 小结 (56)3.3 超氧麦角固醇双氧桥形成的研究 (56)3.3.1 烟曲霉NRRL1979菌株的固体发酵实验及检测结果分析 (56)3.3.2 烟曲霉NRRL1979中双加氧酶的基因挖掘 (58)3.3.3 烟曲霉NRRL1979的抗性筛选实验 (61)3.3.4 构建AFUA_8G00480基因的基因敲除重组质粒 (62)3.3.5 构建AFUA_3G14710基因的基因敲除重组质粒 (63)3.3.7 构建AFUA_8G00480基因的蛋白表达载体 (66)3.3.8 构建AFUA_3G14710基因的蛋白表达载体 (67)3.3.9将AFUA_8G00480基因和AFUA_3G14710基因浓缩纯化的蛋白进行体外反应 (68)3.3.10 小结 (68)第四章总结与展望 (69)4.1 总结 (69)4.2 展望 (71)参考文献 (72)致谢 (75)第一章 绪论1.1萜类化合物的概念及分类萜类化合物是由异戊二烯为结构单元形成的天然产物，是植物代谢过程中重要的此生产物，在自然界中广泛分布，是天然物质中种类繁多，化学结构最多的一类化合物；是由异戊二烯以各种方式连结形成具有（C5H8）n通式的一类天然产物，广泛应用于工业，食品，医疗卫生，化妆品等方面［1］。