炭疽实验室检测技术63页PPT

炭疽防治技术规范
丰台区动物卫生监督所 吴长福
2021/6/10
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炭疽 Anthrax
2001.9.11事件后， 恐怖分子利用炭疽杆菌 进行恐怖主义活动。
2021/6F/1B0 I调查佛州发生的炭疽热事件
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2005年7月，我国贵州、宁夏、辽宁、 吉林发生人炭疽，1人死亡. 2012年8月，江苏、辽宁发生人炭疽。
冻皮，应分开取样，不得混掺。
4.取样完毕的皮张，在未收到检疫结果通知单前，应保持原 状，不得重新分类、包装、加工和移动。
5. 取样人员，应进行炭疽预防注射和具有一定的防疫知识 。 在工作前，应穿好防护服，工作后，应充分消毒洗手，工 作服须进行103.41kPa高压蒸汽灭菌，要严格遵守防疫卫 生制度。
• 在濒死后可见鼻流出血样泡沫，肛门及阴门流 出不易凝固的血液。
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临床症状
➢ 急性型：常发生于牛、马
• 体 温 升 高 （ 40-42℃ ） ， 精 神 沉郁，食欲减退，瞳孔散大， 恶寒战栗，呼吸困难，脉博加 快。
• 粘膜发紫，病初便秘，腹泻带 血，尿暗红色，泌乳停止，孕 畜流产，濒死期体温急速下降 ，一般经1-2天死亡。
外毒素
水肿因子 保护性抗原 致死因子
抗吞噬，局部水肿 细胞坏死
单独存在不发挥其活性，三者协同发挥毒素效应。
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流行病学
➢传染源：
• 主要传染源是病畜，其次是带菌动物。
• 病畜处于菌血症时，细菌可随分泌物、排 泄物、破溃的肿胀部渗出液及天然孔的溢 血排出。
• 尸体中含有大量的炭疽杆菌，如处理不当 ，污染环境，可成为持久的疫源地。
咽喉部红肿

③分析速度快； ④可以快速灭活标本中的病原菌，用于核酸分析。 目前针对炭疽芽孢杆菌及其芽孢的核酸检测多 数都依赖于PCR ,有定性和定量PCR 的应用报道,
PCR检测引物的设计
炭疽芽孢杆菌的PCR 检测中引物的设计非常关键。 炭疽芽孢杆菌有两个毒力相关质粒pX01 和pX02。
pX01 分子量为110 MDa (185kb) ，携带cya 、 lef 和pag 基因，分别编码水肿因子( EF) 、致死 因子(L F) 和保护性抗原( PA) ； pX02 分子量为60 MDa(95kb)，携带capABC 和dep 基因，分别编码荚膜与参与其生物合成的 酶。
PCR检测引物序列
pagA F: 5' ATT TGC GGT AAC ACT TCA CT 3' pagA R: 5' AGA CCG TGA CAA TGA TGG AA 3' cap外F：5' CCT GGT TGT TCT TTT CGT TGC 3' cap外R：5' CGG ATT GTA TAT GGA GTG GG 3' cap内F：5' TTT CAC CAG CAC CCA CAT AG 3' cap内R：5' GGG ACA GGA ATG TTT GGA TC 3' rpoB 2F：5' CCA ACA GTA GAA ATG CC 3' rpoB 2R：5' AAT TTC ACC AGT TTC TGG ATC T 3'
一些进化研究学者推论,这几种细菌来源于同一个 祖先,为了适应不同的环境而产生分化,炭疽芽孢 杆菌成为温血动物的病原菌,蕈状芽孢杆菌是环境 中的正常菌,对人和动物没有致病能力;而蜡样芽 孢杆菌和苏云金芽孢杆菌处于以上两种菌之间,蜡 样芽孢杆菌是环境中的常见菌,偶尔也会使温血动 物感染;苏云金芽孢杆菌则成为昆虫的致病菌。

• 从现场标本中直接进行细菌分离培养、初 步鉴定、药物敏感性试验、生化鉴定、免 疫学试验、PCR核酸提取、涂片、显微镜检 查等检测活动可在生物安全二级实验室中 进行。
• 大量活菌操作和动物感染实验应在生物安 全三级实验室中进行。
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• 基层实验室一般仅做细菌检验分离，要求 具有实验室、无菌室和生物安全柜，一般 不做强毒菌动物感染和解剖，应有能用的 高压灭菌设备和安全的污水消毒设施。
双份血清。急性期和恢复期采集时间间隔应在7 天以上
➢ 急性期血清：发病7天内的血清（放宽条件14天内） ➢ 恢复期血清：发病14天后的血清
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具体采集方法 —— 病患标本
1、采样人员到现场后，首先拿出一次性中单 铺在一处平整的桌面等地方，然后穿戴一次 性衣服、口罩、帽子、双层手套、防护眼镜 、鞋套等。 2、观察病灶部位。 3、打开出诊箱，拿出采样器材，按下述方法 采样。
➢水疱较小时：用注射器先抽取无菌生理盐水，注射进 水疱，再把水疱内生理盐水抽出来，放无菌离心管， 再用无菌拭子沾取水疱处可能剩余液体，然后用碘酒 消毒处理以免细菌扩散。
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采集方法 —— 病患标本
（2人一起合作采样）
疑似皮肤炭疽
✓ 水疱期已破损
➢用无菌拭子沾取渗出液，每2个拭子放在一个15ml无 菌离心管中，手持部分折去，盖盖，在管上标记编号 等信息。最后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。
炭疽采样与检测
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了解炭疽病原
• 生物危害程度
➢国际：生物危险分类属于III类
➢中国：危害程度分类属于第二类

临床表现
皮肤炭疽的典型表现为迅速坏死的无 痛性痈，伴局部化脓性淋巴结炎；吸 入性炭疽表现为急性起病，出现寒战 、高热、呼吸困难、胸痛及咳嗽，可 迅速出现昏迷和死亡；肠炭疽可表现 为急性肠炎型或急腹症型，前者症状 较轻，后者病情凶险，常并发败血症 和感染性休克。
实验室检查
皮肤损害的分泌物、呕吐物、粪便、 脑脊液等标本中可检出炭疽杆菌。
炭疽患者及其家属可能因病情严重而产生恐惧、焦虑等心理问
题。
社会经济影响及防控策略
社会经济影响
炭疽疫情爆发可能导致社会恐慌，影响社会稳定和经济发展。同时，炭疽患者 的治疗和康复需要耗费大量医疗资源和费用。
防控策略
加强炭疽疫情的监测和报告，及时发现和控制传染源；加强宣传教育，提高公 众对炭疽的认识和防范意识；加强动物检疫和监管，防止动物炭疽传播给人类 ；加强医疗救治能力建设，提高炭疽患者的救治成功率。
发病机制
炭疽杆菌通过皮肤接触、吸入或食入等方式进入人体后，在 局部繁殖并产生毒素，引起组织坏死和全身毒血症。炭疽杆 菌还可进入血液循环，引起败血症和炭疽性脑膜炎等严重并 发症。
流行病学特点
传染源
易感人群
患病的草食动物，如牛、羊、马等， 是炭疽的主要传染源。
人群对炭疽普遍易感，但职业人群如 牧民、农民、屠宰工人等由于接触患 病动物的机会较多，因此感染风险更 高。
提高应急处理能力
加强应急处理能力，确保在疫情爆发 时能够迅速、有效地采取应对措施， 保障公众健康和安全。
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REPORTING
2023 WORK SUMMARY
THANKS
感谢观看
PART 05
国内外研究现状及展望
国内外研究进展概述
病原学研究

肠炭疽与急性菌痢、出血性肠炎等鉴别
肠炭疽的临床症状与这些肠道疾病相似，但治疗方法不同，需通过实验室检测和临床表现 进行鉴别。
03
治疗与预防措施
治疗方案及原则
早期治疗
抗生素治疗
炭疽感染后应尽早开始治疗，以降低死亡 率。
首选青霉素类抗生素，如阿莫西林、氨苄 西林等。若对青霉素过敏，可选用其他抗 生素，如四环素、氯霉素等。
炭疽
汇报人：XXX 2024-01-19
目录
• 炭疽概述 • 诊断与鉴别诊断 • 治疗与预防措施 • 并发症与危害程度评估 • 患者教育与心理支持 • 总结与展望
01
炭疽概述
定义与病原学
定义
炭疽是由炭疽杆菌引起的一种急 性、热性、败血性人兽共患病。
病原学
炭疽杆菌为革兰氏阳性粗大杆菌 ，两端平齐，排列如竹节状，无 鞭毛，不能运动，在人体内有荚 膜形成并具较强致病性。
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加强炭疽疫苗研发与应用
随着生物技术的不断发展，未来有望研发出更加 安全、有效的炭疽疫苗，提高人群的免疫保护水 平。
推动炭疽治疗手段创新
针对炭疽治疗手段有限的问题，未来将加大研发 力度，探索新的药物和治疗方法，提高患者治愈 率。
完善炭疽疫情监测与报告体系
借助大数据、人工智能等先进技术，完善炭疽疫 情的监测和报告体系，实现疫情的及时发现和快 速处置。
05 患者教育与心理支持
患者教育内容
炭疽的基本知识
01
向患者解释炭疽的病因、传播途径、症状、治疗及预防等相关
知识。
治疗方案和药物使用
02
详细介绍炭疽的治疗方案，包括使用的药物、剂量、用法及可
能产生的副作用等。
自我护理和预防措施

二、炭疽病原检验程序 图1示。
皮肤渗出物、血液、 粪便或呕吐物、土 壤或动物标本
直接涂片 （革兰氏染色）
细菌培养
必要时做PCR
见到革兰氏阳性大 杆菌，可定为临床 诊断病例
未见到革兰氏阳性 大杆菌，继续别的 试验
直接划平板
直接划平板后的标 本可增菌培养
培养12~24h，选可疑 菌落做青霉素敏感和 噬菌体裂解试验

2.注意事项：ELISA实验的结果受操作影响 很大，每个步骤包括加样、温育、洗涤、显色、 酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA 的高灵敏、强特异的优点。因此，应建立实验 项目的标准操作程序(SOP)。报告方式以定量 分析结果的滴度单位表示；检测时应以接种疫 苗前或初报告病例地方的人或动物的血清作为 阴性血清，如有可能也可设阳性血清对照。阴 性血清每次都要和待测标本同时做。





五、实验方法 （一）标本采集 1.采集标本时应遵循的原则:尽可能在抗生素治疗 开始前采集标本，除必要时并在具备操作病毒细菌条 件的实验室内，不得用解剖的方式获得标本。所需的 血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。所有标本均 置无菌容器中 2.血液标本：所有疑似病例，采取血液标本510ml（不加抗凝剂）。 3.皮肤损害处标本：玻片直接在皮肤破损处压蘸； 再用棉签采皮肤损害处渗出物，（不加增菌肉汤）。 4. 粪便与呕吐物标本：有消化道症状的采粪便或 呕吐物标本，注意选取其中混有血液的部分。 5. 痰与咽拭子标本：有呼吸道症状的收集痰液及 咽拭子标本。



（三）具体程序 1.包被抗原：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.3 μg／ml，每孔加0.1 ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶 液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。 洗涤缓冲液配方为：Tris 2.42克，1mol/L HCI 13mL,吐温-20（0.05%）0.5mL, 加蒸馏水至1000mL。 2.待检血清反应：加1:8稀释(稀释液为生理盐水) 的待检样品0.1 ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育60分钟，洗涤3次，每次3分钟。(同时做空白、阴 性及阳性孔对照)

病原学特性
抵抗力： – 炭疽杆菌对外界理化因素抵抗力不强，但芽孢 的 抵抗力很强。在干燥的状态下可存活50年以 上，干热150℃60分钟内杀死，鬃毛上芽孢 121℃高压需15分钟。
流行病学特征
易感动物：
–本病多种家畜、野生动物易感，草食兽（如 黄牛、水牛、骆驼、象等）易感性最高，猪 次之，家禽一般不感染，犬猫最低。
扑灭措施： – 隔离和封锁：确诊后，早上报疫情，划定 疫区（点），进行封锁，隔离病畜，治疗 – 紧急接种：假定健康畜群紧急免疫接种 – 治疗：青霉素、磺胺嘧啶等或抗血清 – 消毒：焚烧死亡动物尸体或深埋；地面
公共卫生
皮肤炭疽： – 主要兽医人员，屠宰厂工人，经皮肤伤口感 染。临床表现主要为感染处皮肤先瘙痒红肿， 后为无痛性麻木丘疹，再变成浆液性或血性 水疱，以后变成暗红色痂皮，附近淋巴结肿 大，疼痛。并伴有头痛，发热，关节痛、呕 吐、乏力等症状。
肺炭疽
– 多羊毛、鬃毛和皮革厂工人，病程急剧，早期 恶寒、发热、咳嗽、咳血、呼吸困难等
肠炭疽
– 常因吃病畜肉类所致，发病急、发热、呕吐腹 泻、血样便、腹痛、腹膜炎等
临诊症状
潜伏期： – 很短，一般为1～3天。
病型：发病经过因动物种类不同而有差异，据病 程经过，可分为 – 最急性型 – 急性型 – 亚急性型
临诊症状
最急性型：
– 多发动物：羊（绵羊、山羊)多发，牛、马 也发生。
– 症状：常突然发病，动物站立不稳倒地，呼 吸困难，体表可视粘膜呈蓝紫色，全身颤抖， 天然孔（口、鼻、肛门、阴门等）流出带泡 沫血样液体，不凝固，多发病后半小时到1 小时死亡。有时病畜在放牧或使役中突然倒 地死亡；
临诊症状
亚急性型： – 多发动物：马、猪 – 症状：病情较缓和，常在体表（如喉部、颈部、 胸前、肩胛和乳房）各部皮肤、直肠、口腔粘膜 发生炭疽痈 • 初期其硬固，有热痛，后变冷而无痛，中央部 可发生坏死，有时可形成溃疡。 – 转归： 可经数周痊愈或转为急性 – 病程：数日至一周以上

病变多见于面、颈、肩、手和脚等裸 露部位皮肤。初为斑疹或丘疹，次日出 现水疱，内含淡黄色液体，周围组织硬 而肿胀。第3～4日中心呈现出血性坏死 稍下陷，四周有成群小水泡，水肿区继 续扩大。
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皮肤炭疽
第5～7日坏死区溃破成浅溃疡，血样 渗出物结成硬而黑似炭块状焦痂，痂下 有肉芽组织生成(即炭疽痈)。焦痂坏死 区直径大小不等，其周围皮肤浸润及水 肿范围较大。由于局部末梢神经受压而 疼痛不显著，稍有痒感，无脓肿形成， 这是炭疽的特点。以后随水肿消退，黑 痂在1～2周内脱落，逐渐愈合成疤。

肺炭疽 因暴露于芽胞或吸入污染芽胞尘埃所 致。急性起病。多在暴露后2～5天出现 低热、疲劳和心前区压迫等，持续2～3 天后，症状突然加重，轻者表现为胸闷、 胸痛、发热、咳嗽、咯带血黏液痰。
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肺炭疽 重者寒战、高热、由于纵膈淋巴结肿 大、出血并压迫支气管造成呼吸窘迫、 气急喘鸣、咳嗽、紫绀、血样痰等，并 可伴有胸腔积液。肺部体征与病情常不 相符。听诊肺部仅可闻及散在的细小湿 罗音或有摩擦音、呼吸音降低等胸膜炎 体征。
断和鉴别诊断有重要的参考价值。
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皮肤炭疽 1、皮肤感染及蜂窝织炎：痈、疖和蜂窝织炎均为局
部皮肤感染而有局部红肿热痛，重者亦伴有全身中 毒症状，血白细胞亦可明显增高。鉴别点：①局部 疼痛明显，皮损处无焦痂及周围水肿；而皮肤炭疽 局部形成焦痂，周围明显水肿，病灶处呈坏死出血 而非化脓性炎症特点，但局部无明显疼痛，此为重 要鉴别点。②引起病变之致病菌不同，局部取材做 涂片及培养可得不同细菌。
炭疽的临床表现、诊断与治疗
自治区CDC疾病预防控制与应急处理办公室
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条件下亦可产生，为炭疽毒素的组成成分之一， 具有免疫原性，能使机体产生抗炭疽杆菌的保 护力。
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抗原结构
庄汗澜、牟兆钦等探讨了保护性抗原（PA） 的免疫机制，发现： 1、PA免疫后，动物产生抗PA抗体、血中吞噬 细胞被激活，抗PA抗体除中和作用外，在体 内能直接杀灭炭疽芽孢杆菌； 2、PA免疫动物抑制入侵的炭疽芽孢出芽，在 炭疽强毒芽孢攻击后1-3天内，PA免疫兔的肝、 脾、淋巴结切片中只见少量芽孢而无繁殖体， 而对照兔组织内细菌以繁殖体为主；
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培养特性与生化反应
在某些培养基上，炭疽杆菌在培养6h 开始产生紫红色色素，在碱性条件下为 红色，24h达高峰，色素的生物学功能 不详，据认为与培养基的硫酸亚铁含量 有关。
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抗原结构
炭疽芽孢杆菌的抗原组成主要包 括荚膜抗原、菌体抗原、芽孢抗原及 保护性抗原等四种成分。
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抗原结构
荚膜多肽抗原：
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病原学
形态与染色 炭疽杆菌在机体内或含血清或碳酸氢钠特殊培
养基中可形成荚膜。荚膜抗腐败能力大于菌体，因 此在腐尸检片中可见到称为菌影的无内容物的荚膜。 荚膜是由质粒DNA编码，无毒菌株不产生荚膜。
荚膜成分为D-多聚谷氨酸，由荚膜质粒控制，与 炭疽杆菌治病力有关，在体内能抑制白细胞的吞噬 和消化，在体外能阻断菌体胞壁上的噬菌体受体， 有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染。
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抗原结构
芽孢抗原： 由芽孢的外膜、芽孢壳等组成的芽孢特异
性抗原，具有免疫原性和血清学诊断价值。最 新研究发现炭疽芽孢抗原在炭疽芽孢感染、致 病和免疫上也起作用。芽孢外膜的胶原样糖蛋 白是免疫显性抗原，能刺激机体产生强烈免疫 应答。
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内容引入 观看幻灯片，请同学们判断是什然 孔 流 血 ， 肛 门 突 出 ， 流
急性：脾不肿大，被膜散在出血点
脾肿大，质软，呈紫黑色
脾切面紫黑，脾髓软化呈糊状，似煤焦油
皮下结缔组织呈出血性胶样水肿
以肿大、出血和坏死的淋巴小结为中心， 形成局灶性、出血性、坏死性病变
归纳总结
能力
①能通过临诊检疫法诊断炭疽病 ②能够通过显微镜检查法诊断炭疽病 ③能够通过环状沉淀法诊断炭疽病 ④能够对患病动物、病死动物及污染的
环境进行妥善处理。
知识
①炭疽病的临诊检疫 ②实验室检疫 ③炭疽病检疫后处理
训练巩固 拓展检验
某乡动物防疫人员在做疫情监测过程中， 发现该乡有2村共有4头牲畜疑似炭疽病， 请问如果你作为防疫人员，应怎样确诊及 处理？
深化
临诊检疫 初步检疫
实验室检疫 准确检疫
镜检法 环状沉淀法
学生分组操作
炭疽病病料采集、镜检 环状沉淀法操作技术
炭疽病病料采集、镜检
疑为炭疽动物，除慢性者外，其他不论是最急性者或急性者均予生前将耳部消 毒后取血液，病变部取水肿液或渗出液等直接涂于载玻片上，自然干燥后，将玻片 涂面相对叠好，中间用火柴杯隔开，以线捆扎，外用塑料纸包好。或用灭菌脱脂棉 滤纸、布片吸取血液等放于小试管中，待检。
染疫动物的处理
一、染疫动物的扑杀：烈性传染病或烈性人畜共患病的染疫动物立即扑杀；新 发生的某种传染病，将最初疫点内的患病与可疑患病动物全部扑杀；疫区解除 封锁前，为了尽快拔除疫点，可将带病原的或检疫阳性的动物扑杀；某些慢性 传染病，如结核、布病等每年检疫，阳性动物扑杀。
二、畜禽尸体无害化处理 工作人员做好自身防护工作。运送尸体应用特制的运尸车。装车前将尸体各天 然孔用蘸有消毒液的湿纱布、棉花严密填塞，小动物和禽类可用塑料袋盛装， 以免流出粪便、分泌物、血液等污染周围环境。尸体污染的环境彻底消毒。 1、掩埋法：选择远离住宅、农牧场、水源、草原及道路的僻静之处，土质干 而多孔、地势高，水位低处，尸体上、下都应铺石灰。 2、焚烧法：毁灭尸体最彻底的方法，可在焚尸炉中进行。如无焚尸炉，则可 挖掘焚尸坑。 3、化制法：不仅对尸体做到无害化处理，并保留了有价值的畜产品，如工业 用油脂及骨肉粉。需在有一定设备的化制站进行，恶性传染病高压灭菌、普通 传染病切块后煮沸。 4、发酵法：利用生物热发酵进行。