WATERS液相色谱教程三四七(最全)

Waters高效液相色谱系统操作规程1. 目的规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

2. 范围本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

3. 职责质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。

4. 系统组成本系统由Waters 600E多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters在线脱气机、Rheodyne 7725i 手动进样阀、Waters 2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。

5. 程序5.1. 准备5.1.1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用0.45μm滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。

5.1.2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

5.2. 开机和泵操作5.2.1. 开机5.2.1.1. 接通断电保护器的电源，依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。

5.2.1.2. 打开Millennium32软件，按「Login...」，输入用户名和密码，按「OK」注册进入系统主界面。

在Project档内选择所需的项目，右击『Run Samples』图标，选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。

5.2.2. 更换溶剂5.2.2.1. 打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN位置；5.2.2.2. 将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；5.2.2.3. 按［Direct］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min（梯度配比阀在0ml/min时不工作）；5.2.2.4. 选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为100%，其它为0%；5.2.2.5. 将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；5.2.2.6. 逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；5.2.2.7. 再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；5.2.2.8. 转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。

Waters高效液相色谱操作说明一．简介本高效液相色谱实验包括：waters1525泵+waters2487双波长检测器+色谱柱+电脑（breeze 图谱处理软件）+流动相二．操作流程0.准备工作确定色谱实验方法，处理好流动相1，换好流动相，确定色谱柱选择无误1.开机打开泵开关，听到两声“嘀”的响声之后，再打开波长检测器。

检测器进入预热阶段（此时检测器面板进入5min倒计时）这期间打开电脑，进入英文windows操作系统2，待检测器自检完毕（整个自检过程约6~7min），打开电脑桌面的（Breeze软件）。

待程序完全启动，整个开机过程结束。

系统默认进入上次使用的方案。

2.建立新方法和新方案2.1新建方案方案主要用来储存你的各个实验方法，数据等内容，你可以把它理解为一个文件夹。

2.1.1创建步骤选择→单击→单击"next"→在"project name"中输入方案名称（如abc），"comments"中可填注释，也可不填。

→单击"finish"2.1.2打开创建的方案在界面下→单击→在"project"中找到你创建的方案（如abc）→点击"OK",即进入到我们自己的方案中了2.2新建方法在新建的方案中，需要建立不同的试验方法。

试验方法主要设定的包括洗脱方式，检测波长等参数。

2.2.1新建方法步骤单击→单击→单击（Flow选项卡）→在programmed flow中设定你的洗脱方式（此步在2.2.2详述）→单击→单击（channel 1选项卡）→在"wavelength"框内设定你的检测波长（如265nm,280nm,215nm等等）→（设定结束，保存）：单击→输入方法名称如（abc 1）→单击"save"32.2.2洗脱方式的设定（重要）在programmed flow中可看到。

Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)操作指南1.适用范围：本使用规范适用于有机室所备有的Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)。

2.仪器设备的主要技术指标：1) 梯度性能：保留时间标准偏差（SD）≤0.047min。

2) ESI正离子灵敏度和精密度：测试样品：磺胺二甲基哒嗪(Sulfadimethoxine)，浓度：0.1pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥3000:1；平均峰面积≥60000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:4500psi；峰面积：120000；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.5%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。

3) ESI负离子灵敏度和精密度：测试样品：氯霉素(chloramphenicol)，浓度：0.05pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥400:1；平均峰面积≥1000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:520psi；峰面积：1500；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.8%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。

4) 系统精密度（TUV/PDA）：峰面积相对标准偏差（%RSD）≤0.5%；峰高相对标准偏差（%RSD）≤0.9%。

5) NanoFlow正离子灵敏度指标要求：峰强（m/z =785.8）≥1×107，测试样品：Glu-Fibrinopeptide B，浓度：100fmol/μl测试结果：峰强度（m/z =785.8）：1.48×107；符合指标要求。

6) T RIZAIC正离子模式MS说明：测试样品：ADH T19, PHO T33, ENL T4, BSA T59, ENL T43, ADH T17, BSAT10, PHO T88指标要求：保留时间标准偏差：≤0.25%测试结果：ADH T19：标准偏差为0.02% (23.77min)；PHO T33：标准偏差为0.03% (25.12min)；ENL T4：标准偏差为0.02% (21.83min)；BSA T59：标准偏差为0.01% (21.58min)；ENL T43：标准偏差为0.04% (22.33min)；ADH T17：标准偏差为0.03% (23.31min)；BSA T10：标准偏差为0.02% (24.41min)；PHO T88：标准偏差为0.03% (24.81min)7) 系统性能测试一维系统精密度测试：测试样品17α-OHP。

WatersHPLC System Basic Teaching Material For Empower Software沃特斯高效能液相層析系統－資料處理軟體基礎操作指引美商沃特斯公司-台灣分公司Version Issue Date Author Comments1.0 Aug / 2003 Waters Taiwan Initial VersionContent一、電腦/層析軟體開機/開始操作畫面說明 (3)二、資料處理系統操作介面/畫面說明 (3)三、Project 之建立 (4)四、層析系統(Chromatographic system)之建立 (8)五、使用者(User)之建立 (11)六、實驗開始/ 儀器方法( Instrument Method )之建立 (13)七、數據處理方法( Processing Method )之建立 (16)八、報表列印說明 (24)一、電腦/層析軟體開機/開始操作畫面說明a.打開電腦電源開關，進入作業系統，連續按兩下”EMPOWER LOGING” 圖像。

b.輸入UserName(例如:System)、Password(例如:Manager)，按OK。

c.進入EMPOWER畫面( Pro 或Quick Start介面，可依使用者設定而不同)。

二、資料處理系統操作介面/畫面說明圖像功能描述Run Samples 開始樣品分析。

Browse Project Project 瀏覽、數據處理與列印。

Configure System 層析系統設定。

Process Data 數據處理。

Review Data 數據瀏覽、處理。

Print Data 報表列印。

三、PROJECT 之建立a.打開電腦電源開關，進入作業系統，連續按兩下”EMPOWER LOGING” 圖像。

b.輸入UserName以及Password，按OK。

c.進入EMPOWER Pro畫面，點選”Configure System”。

液相色谱仪操作规程仪器名称：液相色谱仪Waters2695型（带光电二极管阵列PDA 2998、蒸发光散射ELS 2424检测器）光电二极管阵列一般可用5mg/L来试条件。

第一步：准备工作（1）把水和有机相分别加入各瓶中。

(纯水一周一换，换溶剂时需小心，不要用手触摸管道)。

有机相必须为进口色谱级纯度。

（2）开机顺序：电脑→泵→检测器→工作站1）泵的开启，在2695主机界面上直接操作。

待仪器自检完毕，显示Idle后，选择Menu status进行各项操作：a.仪器长久不用，管路干了，应使用Dry prime功能。

b.每次开机，都要用Wet prime功能，将要用的各个通道冲洗一遍（A为甲醇，C为乙腈，D为纯水），排除气泡。

此过程流动相不通过柱子。

具体操作为：用方向键选择一个通道，比例调成100%，其余通道为0%，在direct function 中选择wet prime，按默认值进行。

冲洗完成后，进行下一个通道的冲洗，直到完成。

仪器使用过程中，如果哪个通道更换或增加了溶剂，都要用Wet prime将此通道冲洗一遍。

c.温度设置：直接将柱温设置成所需温度，一般为30℃。

d.Purge injection：在direct function中选择Purge injection，按默认值进行。

e.Equilibrium：将流量从0调至1mL/min，如果长久不用，不能直接调，而应逐渐将流速调至1mL/min。

将通道比例调成所需比例，注意此过程流动相通过柱子，所以切记不能出现纯水通道100%的情况，纯水比例最大为95%。

在direct function中选择Equilibrium，按默认值进行。

注意：每一步操作都应在仪器显示Idle状态后再进行。

2）检测器的开启绿灯状态为自检；灯为黄色、不闪并听见提示音，为启动完成。

3）工作站的开启Empower登陆：用户名为system，密码为manager窗口左边选择项目，窗口右边选择系统（检测器）。

Waters高效液相色谱系统操作规程一. 准备1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制）。

2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

3. 接通电源，依次打开1525泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。

4. 打开Breeze软件，进入系统主界面。

二. 操作步骤1.更换流动相。

2.在主界面中点击“Manage Breeze”按钮，选择system选项，出现系统连接示意图，观察各个部件是否连接好。

若未连接好，则需点击“Diagnostics/Reconfigure”进行诊断。

3.回到主界面，选择“Manage Breeze”中的project选项，单击“Make a new project”，“Next”，在“Project Name”中输入名称，单击“Finish”。

单击“Change a project/User”，在“Project”中选择输入的名称，单击“OK”。

4.单击“View Method”按钮，点击“Pump”图标，设置泵的参数。

点击“UV Det”图标，设置紫外检测器的波长。

单击“Save Method”按钮保存设置方法。

5. 打开泵的抽液阀，使用灌注注射器抽取一定量的洗脱剂。

单击Purge图标，出现“Purge Wizard”对话框，选中“Purge Pump”选项，点击“Next”“Next”，调节A、B泵的流量分别为约3ml/min。

打开泵的参考阀，点击“Next”。

Purge结束后关闭参考阀。

6.点击主界面中的“press to equilibrate system/ monitor baseline”按钮，平衡系统0.5－1h，直至基线稳定。

7.点击“press to make a single injection”按钮，进入“Specify Single Inject Parameters”对话框，设置参数，点击“inject”。

Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)操作指南1.适用范围：本使用规范适用于有机室所备有的Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)。

2.仪器设备的主要技术指标：1) 梯度性能：保留时间标准偏差（SD）≤0.047min。

2) ESI正离子灵敏度和精密度：测试样品：磺胺二甲基哒嗪(Sulfadimethoxine)，浓度：0.1pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥3000:1；平均峰面积≥60000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:4500psi；峰面积：；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.5%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。

3) ESI负离子灵敏度和精密度：测试样品：氯霉素(chloramphenicol)，浓度：0.05pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥400:1；平均峰面积≥1000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:520psi；峰面积：1500；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.8%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。

4) 系统精密度（TUV/PDA）：峰面积相对标准偏差（%RSD）≤0.5%；峰高相对标准偏差（%RSD）≤0.9%。

5) NanoFlow正离子灵敏度指标要求：峰强（m/z =785.8）≥1×107，测试样品：Glu-Fibrinopeptide B，浓度：100fmol/μl测试结果：峰强度（m/z =785.8）：1.48×107；符合指标要求。

6) T RIZAIC正离子模式MS说明：测试样品：ADH T19, PHO T33, ENL T4, BSA T59, ENL T43, ADH T17, BSA T10, PHO T88指标要求：保留时间标准偏差：≤0.25%测试结果：ADH T19：标准偏差为0.02% (23.77min)；PHO T33：标准偏差为0.03% (25.12min)；ENL T4：标准偏差为0.02% (21.83min)；BSA T59：标准偏差为0.01% (21.58min)；ENL T43：标准偏差为0.04% (22.33min)；ADH T17：标准偏差为0.03% (23.31min)；BSA T10：标准偏差为0.02% (24.41min)；PHO T88：标准偏差为0.03% (24.81min)7) 系统性能测试一维系统精密度测试：测试样品17α-OHP。

紫外-可见光检测器原理基于样品池(S)中的样品对光产生吸收,与参比池(R)有信 号差如是可变波长检测器,还有分光系统(光栅) 流动池灯R S样品入口光电二极管2004 Waters CorporationBeer's Law – 比尔定律光能量: – P0 = 透过溶剂的光能量 – P = 透过样品的光能量光通量(透过率%):T=P/P0A吸光度: A = -log(T)= log(P0/P)B吸光度 = 单位吸光度×流动池长度×溶液浓度 – 即: A = abc** * * ** * *透过率 %吸光度 AU ** 浓度浓度2004 Waters Corporation影响紫外检测器灵敏度的因素信号强度(S) – 从比尔定律可看出 1AU 样品的种类 样品浓度及进样的体积 检测池的长度 – 所使用的波长,检测器的 时间常数噪音 10% 1%.25AU噪音(N) – 流动相 – 所使用的波长,灯的能量 – 检测器的时间常数 – 非检测器因素 电噪音,泵脉动等S/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 252004 Waters Corporation示差折光效应的影响示差折光效应的危害 – 产生假的紫外吸收变化: 定量误差,光谱图不准确 梯度时严重的基线漂移梯形狭缝设计 – 用于2487的最新专利设计 – 消除示差折光效应影响的同时,提高灵 敏度及线性范围梯形池设计 – 最初的专利设计这是示差折 光效应的一个例 子,光从一个介 质到另一个介质 发生折射现象2004 Waters Corporation溶剂对紫外检测器的影响乙 腈 190nm不同种类溶剂有其特定的 止波长溶剂的质量好坏对其截止 长有影响为何溶剂质量不好? – 含紫外吸收的杂质 – 溶解在其中的氧气 – 缓冲液溶质的紫外吸收截止波长 – 又称溶剂吸收波长的上限甲 醇 210nm200 220 240 260或溶剂透过波长的下限2004 Waters Corporation流动相背景吸收的影响理想状态背景吸收会减 小线性范围21实际情形Absorbance1许多溶剂产生 背景吸收0背景吸收0Concentration2004 Waters CorporationWaters 2487 检测器2004 Waters Corporation2487检测器的特点专利的梯形狭缝池设计 –消除示差折光效应的影响其它特点– – – – – –波长范围: 190 - 700 nm 光源: 氘弧灯 双通道,高灵敏度,检测范围:±2AU 仪器内集成比色皿位置,可做光谱扫描 灯开/关定时器: 时间编程 多种功能,胜任更复杂的工作 MaxPlot,RatioPlot,灯优化软件等 注: AU(Absorbance Unit) 吸光度单位2004 Waters Corporation2487检测器的光路filter wheellamp housing window slitspherical mirrorbeam splittergratingcuvettesample diode flow cell photo diodes reference diode2004 Waters Corporation梯形狭缝流动池的比较进口 出口圆柱形池进口 出口梯形池进口 出口梯形狭缝池2004 Waters Corporation光电二极管矩阵检测器原理Shutter Holographic Grating CellD2 LampDiode Array 512 Diodes 190 - 800 nm2004 Waters CorporationPDA检测器的三维(3D)图2AUY1AU吸光度0190波长Z450051015X时间2004 Waters Corporation几种不同的分辨率定义二极管分辨率: 每个二极管的分辨率 – 检测器的波长范围是190 到 800nm 而二极管矩阵中有 512个二极管.因此, 610nm除以512 大约等于 1.2 nm/ 每个二极管光学分辨率: – 狭缝宽度决定光学分辨率,2996的光学分辨率是1.2nm– 光学分辨率影响光谱分辨率光谱分辨率: – 光谱分辨率是指在采集光谱数据时数据点之间的波长间 隔(nm), 2996的光谱分辨率最高是1.2 nm.2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率高分辨率的光学单元应 是:一束光照在一 个 光电二极管上 光学分辨率及数字分辨 率相同 但是带来的问题是:1nm 的二极管及1nm分辨率–光 通 量 下 降 导 致 噪 音光电二极管 加大 –光 学 分 辨 率 和 噪 音 是 一对矛盾狭缝2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率加大光通量– 增加狭缝宽度1nm的二极管及3nm的分辨率牺牲分辨率狭缝光电二极管– 通过狭缝的光要照到彼此 相邻的光电二极管上,三 相邻光电二极管的光谱信 息是一样的 – 如左图所示,虽然数字分 率是1nm,实际的光学分 辨率只有 3nm2004 Waters Corporation"苯"的不同分辨率光谱图1.2 nmAbsorbanceAbsorbance2.4 nm230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.003.6 nmAbsorbance4.8 nmAbsorbance230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.002004 Waters CorporationWaters 2996 PDA 检测器PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵2004 Waters Corporation2996 检测器的光路全新的光路设计– 不用聚光镜及各种消 色差镜以减少光路能 量损失 – 反相梯形光束流动池 用以消除示差折光效 应影响同时提高灵敏度及分 辨率– 分辨率:1.2nm – 噪音:±1.5×10-5AU2004 Waters Corporation专利技术:反相梯形光束检测池2004 Waters Corporation2996 检测器的特点兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 – 在收集色谱图的同时,得到光谱图: 三维(3D) 数据 – 亦可采集单波长色谱图: 二维(2D)数据色谱峰的纯度鉴定,色谱峰的确认任意波长的再处理所有的操作皆通过Empower软件控制完成2004 Waters Corporation。