waters液相色谱教程

1.目的规范Waters 高效液相色谱系统的使用和维护。

2.范围本规程适用于Waters 高效液相色谱系统的使用和维护。

3.职责质检室仪器分析员负责Waters 高效液相色谱系统的日常使用和维护。

4. 系统组成本系统由Waters 600E 多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters 在线脱气机、Rheodyne 7725i 手动进样阀、Waters 2487 双通道紫外检测器、Millennium32 色谱工作站/ 电脑等组成，另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。

5. 程序5.1. 准备5.1.1.使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用0.45 ym滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。

5.1.2.通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

5.2.开机和泵操作5.2.1.开机5.2.1.1.接通断电保护器的电源，依次打开断电保护器、脱气机、600E 泵、2487 检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。

5.2.1.2.打开Millennium32 软件，按「Login...」，输入用户名和密码，按「OK」注册进入系统主界面。

在Project 档内选择所需的项目，右击『Run Samples 』图标，选择色谱系统“600_2487” 后打开QuickSet 窗口。

5.2.2.更换溶剂5.2.2.1.打开600E 泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN 位置；5.2.2.2.将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；5.2.2.3.按］Direct ］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min （梯度配比阀在0ml/min 时不工作）；5.2.2.4. 选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为100% ，其它为0% ；5.2.2.5.将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；5.2.2.6. 逆时钟转动手柄至DRAW 位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；5.2.2.7.再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；5.2.2.8.转动手柄至RUN 位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。

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Waters高效液相色谱系统操作规程一. 准备1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制）。

2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

3. 接通电源，依次打开1525泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。

4. 打开Breeze软件，进入系统主界面。

二. 操作步骤1.更换流动相。

2.在主界面中点击“Manage Breeze”按钮，选择system选项，出现系统连接示意图，观察各个部件是否连接好。

若未连接好，则需点击“Diagnostics/Reconfigure”进行诊断。

3.回到主界面，选择“Manage Breeze”中的project选项，单击“Make a new project”，“Next”，在“Project Name”中输入名称，单击“Finish”。

单击“Change a project/User”，在“Project”中选择输入的名称，单击“OK”。

4.单击“View Method”按钮，点击“Pump”图标，设置泵的参数。

点击“UV Det”图标，设置紫外检测器的波长。

单击“Save Method”按钮保存设置方法。

5. 打开泵的抽液阀，使用灌注注射器抽取一定量的洗脱剂。

单击Purge图标，出现“Purge Wizard”对话框，选中“Purge Pump”选项，点击“Next”“Next”，调节A、B泵的流量分别为约3ml/min。

打开泵的参考阀，点击“Next”。

Purge结束后关闭参考阀。

6.点击主界面中的“press to equilibrate system/ monitor baseline”按钮，平衡系统0.5－1h，直至基线稳定。

7.点击“press to make a single injection”按钮，进入“Specify Single Inject Parameters”对话框，设置参数，点击“inject”。

紫外-可见光检测器原理基于样品池(S)中的样品对光产生吸收,与参比池(R)有信 号差如是可变波长检测器,还有分光系统(光栅) 流动池灯R S样品入口光电二极管2004 Waters CorporationBeer's Law – 比尔定律光能量: – P0 = 透过溶剂的光能量 – P = 透过样品的光能量光通量(透过率%):T=P/P0A吸光度: A = -log(T)= log(P0/P)B吸光度 = 单位吸光度×流动池长度×溶液浓度 – 即: A = abc** * * ** * *透过率 %吸光度 AU ** 浓度浓度2004 Waters Corporation影响紫外检测器灵敏度的因素信号强度(S) – 从比尔定律可看出 1AU 样品的种类 样品浓度及进样的体积 检测池的长度 – 所使用的波长,检测器的 时间常数噪音 10% 1%.25AU噪音(N) – 流动相 – 所使用的波长,灯的能量 – 检测器的时间常数 – 非检测器因素 电噪音,泵脉动等S/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 252004 Waters Corporation示差折光效应的影响示差折光效应的危害 – 产生假的紫外吸收变化: 定量误差,光谱图不准确 梯度时严重的基线漂移梯形狭缝设计 – 用于2487的最新专利设计 – 消除示差折光效应影响的同时,提高灵 敏度及线性范围梯形池设计 – 最初的专利设计这是示差折 光效应的一个例 子,光从一个介 质到另一个介质 发生折射现象2004 Waters Corporation溶剂对紫外检测器的影响乙 腈 190nm不同种类溶剂有其特定的 止波长溶剂的质量好坏对其截止 长有影响为何溶剂质量不好? – 含紫外吸收的杂质 – 溶解在其中的氧气 – 缓冲液溶质的紫外吸收截止波长 – 又称溶剂吸收波长的上限甲 醇 210nm200 220 240 260或溶剂透过波长的下限2004 Waters Corporation流动相背景吸收的影响理想状态背景吸收会减 小线性范围21实际情形Absorbance1许多溶剂产生 背景吸收0背景吸收0Concentration2004 Waters CorporationWaters 2487 检测器2004 Waters Corporation2487检测器的特点专利的梯形狭缝池设计 –消除示差折光效应的影响其它特点– – – – – –波长范围: 190 - 700 nm 光源: 氘弧灯 双通道,高灵敏度,检测范围:±2AU 仪器内集成比色皿位置,可做光谱扫描 灯开/关定时器: 时间编程 多种功能,胜任更复杂的工作 MaxPlot,RatioPlot,灯优化软件等 注: AU(Absorbance Unit) 吸光度单位2004 Waters Corporation2487检测器的光路filter wheellamp housing window slitspherical mirrorbeam splittergratingcuvettesample diode flow cell photo diodes reference diode2004 Waters Corporation梯形狭缝流动池的比较进口 出口圆柱形池进口 出口梯形池进口 出口梯形狭缝池2004 Waters Corporation光电二极管矩阵检测器原理Shutter Holographic Grating CellD2 LampDiode Array 512 Diodes 190 - 800 nm2004 Waters CorporationPDA检测器的三维(3D)图2AUY1AU吸光度0190波长Z450051015X时间2004 Waters Corporation几种不同的分辨率定义二极管分辨率: 每个二极管的分辨率 – 检测器的波长范围是190 到 800nm 而二极管矩阵中有 512个二极管.因此, 610nm除以512 大约等于 1.2 nm/ 每个二极管光学分辨率: – 狭缝宽度决定光学分辨率,2996的光学分辨率是1.2nm– 光学分辨率影响光谱分辨率光谱分辨率: – 光谱分辨率是指在采集光谱数据时数据点之间的波长间 隔(nm), 2996的光谱分辨率最高是1.2 nm.2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率高分辨率的光学单元应 是:一束光照在一 个 光电二极管上 光学分辨率及数字分辨 率相同 但是带来的问题是:1nm 的二极管及1nm分辨率–光 通 量 下 降 导 致 噪 音光电二极管 加大 –光 学 分 辨 率 和 噪 音 是 一对矛盾狭缝2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率加大光通量– 增加狭缝宽度1nm的二极管及3nm的分辨率牺牲分辨率狭缝光电二极管– 通过狭缝的光要照到彼此 相邻的光电二极管上,三 相邻光电二极管的光谱信 息是一样的 – 如左图所示,虽然数字分 率是1nm,实际的光学分 辨率只有 3nm2004 Waters Corporation"苯"的不同分辨率光谱图1.2 nmAbsorbanceAbsorbance2.4 nm230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.003.6 nmAbsorbance4.8 nmAbsorbance230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.002004 Waters CorporationWaters 2996 PDA 检测器PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵2004 Waters Corporation2996 检测器的光路全新的光路设计– 不用聚光镜及各种消 色差镜以减少光路能 量损失 – 反相梯形光束流动池 用以消除示差折光效 应影响同时提高灵敏度及分 辨率– 分辨率:1.2nm – 噪音:±1.5×10-5AU2004 Waters Corporation专利技术:反相梯形光束检测池2004 Waters Corporation2996 检测器的特点兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 – 在收集色谱图的同时,得到光谱图: 三维(3D) 数据 – 亦可采集单波长色谱图: 二维(2D)数据色谱峰的纯度鉴定,色谱峰的确认任意波长的再处理所有的操作皆通过Empower软件控制完成2004 Waters Corporation。

Waters2695高效液相色谱仪操作规程使用Waters2695高效液相色谱仪前，请认真阅读使用说明，熟悉仪器的使用方法。

一、自检开主机和二极管阵列检测器（PADA）（或荧光检测器FD），仪器进入自检阶段。

约2分钟后PADA两个灯都亮，正常；主机自检所需时间较长，自检完后显示idle。

二、配置系统1．项目管理数据（相当于新建文件夹）名（设定后将出现在运行样品中）。

2．系统三、运行样品在采集数据项目栏中选定项目（即将此次实验数据选择存放位置）→确定出现运行样品表：分为单一与样品组进样。

1．单一进样品瓶，进样体积，运行时间）如没有可直接选用的方法组，可以在左栏通过“创建方法组”来设定使用的仪器方法（即对配置系统一步选定的主机和检测器进行参数设置）：创建方法组→选择仪器方法（新建→编辑仪器方法，包括主机和选定的检测器的参数的设置→设置好选另存为保存此仪器方法→关闭）此时上述编辑的仪器方法出现在列表中→下一步→出现“缺省方法项”对话框，点下一步→出现“命名方法组”，设置方法名（与刚才的仪器方法名相同）对话框→完成。

返回“运行样品”对话框，选方法组和仪器方法。

Notice:主机W2695的参数配置主要是针头深度设置，脱气设置，流量(4000psi)，泵模式（等度和梯度），柱温（划√）。

检测器W2699的参数配置主要是输入开始波长和结束波长（200-700nm）。

检测器W2475的参数配置：设定发射波长（λem）、激发波长（λex），增益（默认值为10太大，改为1即可）。

PADA能看到光谱图和色谱图；但是对于FD没有光谱图，在“运行样品”的右栏只出现一个图谱。

FD回零不好时按面板上的“auto zero”（FD 的其余操作可以通过软件调节）与样品组进样界面相比，多了一个进样按钮（等监视基线平稳后，按中断按钮，再按此按钮即进样分析）。

2．样品组进样左栏可以设置有关样品的信息（每一栏的设置为下拉式菜单），右栏出图，左下栏给出仪器信息，最下栏显示仪器状态。

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法1 仪器组成及开机1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。

2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。

1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。

接通 2695 分离单元后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“ Idle ”时，仪器进入待命状态。

2 溶剂管理系统的准备2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【 Menu/Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕，光标选“ Degasser ”，按【 Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“ Continuous ”，按【 Enter 】。

2.2 启动溶剂管理系统2.2.1 干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“ Status （ 1）”屏幕下，按【 Direct Function 】，光标选“ Dry Prime ”，按【 Enter 】，显示“ Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“ Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。

2.2.2 湿启动在“ Status （ 1 ）”屏幕下，光标选“ Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“ Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“ Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【 OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。

海德氨基酸工业有限公司标准操作规程1 目的规范Waters高效液相色谱仪使用操作。

2 适用范围 Waters高效液相色谱仪的使用操作。

3 责任者质管部QC检验人员。

4 内容4.1 系统进入4.1.1 依次开UPS电源、检测器、泵、打印机、电脑主机电源。

4.1.2 电脑进入自检，自检完成后，进入“Program Manager”窗口。

4.1.3 在“Program Manager”窗口，双击“Millennium”图标，进入相应窗口。

4.1.4 在“Millennium”窗口，双击“Session Manager”图标，进入“Millennium V2.10”窗口，进行内存自检。

4.1.5 内存自检完成后，进入“Millennium Login－Version2.10”窗口，在“User Name”输入“system”，在“Password”输入“manager”，按“Login”进入“Millinniam Version2.10－Session Manager－User System”窗口，双击所选“Project”图标，即进入“Project”窗口。

4.2 进样4.2.1 在“Project”窗口下，按“Tools”图标群中“Quickset”图标进入“System-open”窗口，选择“PCM－410”。

4.2.2 按“OK”加以确认，该窗口自动退出，进入自检。

4.2.3 自检完毕，进入“Quick Set”窗口，按“Mode”选择“Quick Start”进入“Method Set”窗口，选择“Using Exiting Method”自动进入“Quick Set Acquisition”窗口，按“Set Up Instrument”，进入仪器安装状态。

4.2.4 安装完毕，按“Cancel”，退出“Quick Set Acquisition”窗口，在样品登药业有限公司标准操作规程题目Waters高效液相色谱仪操作规程编号版本号共 6 页SOP-EM-319A第 2 页记表上填写样品名、类别、进样体积、运行时间。