Waters 液相色谱教程.ppt

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法1 仪器组成及开机1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。

2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。

1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。

接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。

2 溶剂管理系统的准备2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。

2.2 启动溶剂管理系统2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。

2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。

二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。

Waters高效液相色谱操作说明一．简介本高效液相色谱实验包括：waters1525泵+waters2487双波长检测器+色谱柱+电脑（breeze 图谱处理软件）+流动相二．操作流程0.准备工作确定色谱实验方法，处理好流动相1，换好流动相，确定色谱柱选择无误1.开机打开泵开关，听到两声“嘀”的响声之后，再打开波长检测器。

检测器进入预热阶段（此时检测器面板进入5min倒计时）这期间打开电脑，进入英文windows操作系统2，待检测器自检完毕（整个自检过程约6~7min），打开电脑桌面的（Breeze软件）。

待程序完全启动，整个开机过程结束。

系统默认进入上次使用的方案。

2.建立新方法和新方案2.1新建方案方案主要用来储存你的各个实验方法，数据等内容，你可以把它理解为一个文件夹。

2.1.1创建步骤选择→单击→单击"next"→在"project name"中输入方案名称（如abc），"comments"中可填注释，也可不填。

→单击"finish"2.1.2打开创建的方案在界面下→单击→在"project"中找到你创建的方案（如abc）→点击"OK",即进入到我们自己的方案中了2.2新建方法在新建的方案中，需要建立不同的试验方法。

试验方法主要设定的包括洗脱方式，检测波长等参数。

2.2.1新建方法步骤单击→单击→单击（Flow选项卡）→在programmed flow中设定你的洗脱方式（此步在2.2.2详述）→单击→单击（channel 1选项卡）→在"wavelength"框内设定你的检测波长（如265nm,280nm,215nm等等）→（设定结束，保存）：单击→输入方法名称如（abc 1）→单击"save"32.2.2洗脱方式的设定（重要）在programmed flow中可看到。

色谱柱
液相色谱柱是高效液相 色谱仪的核心部分，是 分析好坏、成败的关键
键合相色谱柱
• 键合相: – 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; 苯基柱 <5%, – 正相: 20%; 硅胶、 -NH2、 -CN、-OH – 其它 (手性柱, 离子交换柱): 10%
• 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 • C18 和 C8 在反相色谱中应用得最为广泛。
LC-5510紫外-可见光检测器
功能特点： • 使用波长范围宽 • 波长精度高 • 噪声低漂移小 • 可用汞灯自动校正波长 • 采用LCD带背光的显示屏来显示波长的设
置参数和运行参数
LC-5510工作站
功能特点： • 具有色谱仪控制系统、数据采集和处理系
统； • 可进行波长程序控制 • 可对两台泵进行程序控制，进行梯度洗脱 • 功能健全，操作便捷
±1.0% ±1.0% ±2.0%
0.5% ±5.0%
0.5%
1.5%
±2.0
±1.0%
%
最高压力
4000 Psi 40 MPa 39.2 MPa 40.0 MPa 40MPa
进样器
• 隔膜进样 • 停留进样 • 阀进样 • 自动进样
进样器
• 对进样器的要求 密封性好 死体积小
重复性好 保证中心进样 进样时对色谱系统的压力、流量影响小
• 在线脱气机主要由真空泵、脱气膜管、传感器、 控制电路、真空腔等组成
• 在线脱气机的主要目的是脱除流动相中的气泡
LC-5510高压输液泵
技术指标 • 工作压力：0～42MPa • 流量范围：0.01～5.0mL/min • 流量准确性：≤1％ • 流量精密度： ≤0.5％ • 压力脉动： ≤1％

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕

Waters液相技术的优势
Waters液相技术以其高效、精确和可靠性而闻名， 被广泛应用于医药、食品和环境分析领域。
2. 液相色谱法基础
液相色谱法的定义和原理
液相色谱法是一种分离和检测 样品成分的化学分析技术，基 于样品在液相中的分配和吸附 行为。
液相色谱法的分类
液相色谱法按分离机理可分为 吸附色谱、离子交换色谱、分 子排阻色谱等多种类型。
Waters HPLC系列液相色谱仪器拥有多个型号，根据用户需求选择最适合的仪器。
Waters HPLC系列液相色谱仪器的常见问题及解决方法
常见问题包括峰形异常、峰分离不良等，我们提供一系列解决方法帮助用户解决实验中的挑 战。
4. Waters液相色谱应用举例
Waters液相色谱应用于生物医药分析的案例分析
《Waters液相》PPT课件
这份PPT课件将带您深入了解Waters液相技术。从Waters公司简介到液相色谱 法的基础知识，再到Waters液相色谱仪器的介绍和应用案例，我们将为您展 示其优势和未来发展趋势。
1. Waters液相介绍
Waters公司简介
Waters是全球领先的科学仪器制造商，专注于液相 色谱技术的研发和创新。
5. 结语
1 Waters液相色谱技术的未来发展趋势
2 推荐阅读和参考资料
展望Waters液相色谱技术的未来，包括更高分辨 率、更高灵敏度和更多应用领域的拓展。
提供了一些相关的书籍、期刊和网站，供感兴趣 的人进一步学习和了解Waters液相色谱技术。
注意
本Pቤተ መጻሕፍቲ ባይዱT仅供学习交流使用，不得用于商业用途。
通过具体案例展示Waters液相色谱在生物医药领域的应用，如药代动力学研究和蛋白质分析 等。

HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
34
Shimadzu Corporation
色谱柱
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
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返回
30
进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
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返回
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手动进样器的原理图
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
( column : ODS type )
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Shimadzu Corporation
梯度洗脱
95%
浓 度
MeOH
30%
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
27
Shimadzu Corporation
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度
Shimadzu Corporation
装填状态
进样状态 返回
32
进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
全量注入 3倍定量管体积
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
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用保留时间定性
用“标样”的保留时间(Rt)确认被测组份
0.40
Ethylparaben
0.35
0.30
0.25
AU
0.20
0.15
Uracil
Propylparaben
0.10
0.05
0.00 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
CH3
样品的官能团
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色谱法的分类
按分离过程的机理分:
– 吸附色谱(Absorption Chromatography)
o 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离
– 分配色谱(Partition Chromatography)
o 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同
o 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…
– 广泛应用于各个领域:
o 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…
– 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间
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HPLC的流程
溶剂 (流动相)
进样器
泵
色谱柱 (固定相)
数据系统
检测器
–理论塔板数N大于规定值(按半峰宽法计算 ) –拖尾因子T应在0.95-1.05之间 –分离度R应大于1.5 –重复性:连续进样5次,峰面积的相对标准偏差不大于2.0%
注:以上数据摘自2005年版中国药典
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第七章 液相色谱(liquid chromatography)
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪

紫外-可见光检测器原理基于样品池(S)中的样品对光产生吸收,与参比池(R)有信 号差如是可变波长检测器,还有分光系统(光栅) 流动池灯R S样品入口光电二极管2004 Waters CorporationBeer's Law – 比尔定律光能量: – P0 = 透过溶剂的光能量 – P = 透过样品的光能量光通量(透过率%):T=P/P0A吸光度: A = -log(T)= log(P0/P)B吸光度 = 单位吸光度×流动池长度×溶液浓度 – 即: A = abc** * * ** * *透过率 %吸光度 AU ** 浓度浓度2004 Waters Corporation影响紫外检测器灵敏度的因素信号强度(S) – 从比尔定律可看出 1AU 样品的种类 样品浓度及进样的体积 检测池的长度 – 所使用的波长,检测器的 时间常数噪音 10% 1%.25AU噪音(N) – 流动相 – 所使用的波长,灯的能量 – 检测器的时间常数 – 非检测器因素 电噪音,泵脉动等S/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 252004 Waters Corporation示差折光效应的影响示差折光效应的危害 – 产生假的紫外吸收变化: 定量误差,光谱图不准确 梯度时严重的基线漂移梯形狭缝设计 – 用于2487的最新专利设计 – 消除示差折光效应影响的同时,提高灵 敏度及线性范围梯形池设计 – 最初的专利设计这是示差折 光效应的一个例 子,光从一个介 质到另一个介质 发生折射现象2004 Waters Corporation溶剂对紫外检测器的影响乙 腈 190nm不同种类溶剂有其特定的 止波长溶剂的质量好坏对其截止 长有影响为何溶剂质量不好? – 含紫外吸收的杂质 – 溶解在其中的氧气 – 缓冲液溶质的紫外吸收截止波长 – 又称溶剂吸收波长的上限甲 醇 210nm200 220 240 260或溶剂透过波长的下限2004 Waters Corporation流动相背景吸收的影响理想状态背景吸收会减 小线性范围21实际情形Absorbance1许多溶剂产生 背景吸收0背景吸收0Concentration2004 Waters CorporationWaters 2487 检测器2004 Waters Corporation2487检测器的特点专利的梯形狭缝池设计 –消除示差折光效应的影响其它特点– – – – – –波长范围: 190 - 700 nm 光源: 氘弧灯 双通道,高灵敏度,检测范围:±2AU 仪器内集成比色皿位置,可做光谱扫描 灯开/关定时器: 时间编程 多种功能,胜任更复杂的工作 MaxPlot,RatioPlot,灯优化软件等 注: AU(Absorbance Unit) 吸光度单位2004 Waters Corporation2487检测器的光路filter wheellamp housing window slitspherical mirrorbeam splittergratingcuvettesample diode flow cell photo diodes reference diode2004 Waters Corporation梯形狭缝流动池的比较进口 出口圆柱形池进口 出口梯形池进口 出口梯形狭缝池2004 Waters Corporation光电二极管矩阵检测器原理Shutter Holographic Grating CellD2 LampDiode Array 512 Diodes 190 - 800 nm2004 Waters CorporationPDA检测器的三维(3D)图2AUY1AU吸光度0190波长Z450051015X时间2004 Waters Corporation几种不同的分辨率定义二极管分辨率: 每个二极管的分辨率 – 检测器的波长范围是190 到 800nm 而二极管矩阵中有 512个二极管.因此, 610nm除以512 大约等于 1.2 nm/ 每个二极管光学分辨率: – 狭缝宽度决定光学分辨率,2996的光学分辨率是1.2nm– 光学分辨率影响光谱分辨率光谱分辨率: – 光谱分辨率是指在采集光谱数据时数据点之间的波长间 隔(nm), 2996的光谱分辨率最高是1.2 nm.2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率高分辨率的光学单元应 是:一束光照在一 个 光电二极管上 光学分辨率及数字分辨 率相同 但是带来的问题是:1nm 的二极管及1nm分辨率–光 通 量 下 降 导 致 噪 音光电二极管 加大 –光 学 分 辨 率 和 噪 音 是 一对矛盾狭缝2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率加大光通量– 增加狭缝宽度1nm的二极管及3nm的分辨率牺牲分辨率狭缝光电二极管– 通过狭缝的光要照到彼此 相邻的光电二极管上,三 相邻光电二极管的光谱信 息是一样的 – 如左图所示,虽然数字分 率是1nm,实际的光学分 辨率只有 3nm2004 Waters Corporation"苯"的不同分辨率光谱图1.2 nmAbsorbanceAbsorbance2.4 nm230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.003.6 nmAbsorbance4.8 nmAbsorbance230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.002004 Waters CorporationWaters 2996 PDA 检测器PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵2004 Waters Corporation2996 检测器的光路全新的光路设计– 不用聚光镜及各种消 色差镜以减少光路能 量损失 – 反相梯形光束流动池 用以消除示差折光效 应影响同时提高灵敏度及分 辨率– 分辨率:1.2nm – 噪音:±1.5×10-5AU2004 Waters Corporation专利技术:反相梯形光束检测池2004 Waters Corporation2996 检测器的特点兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 – 在收集色谱图的同时,得到光谱图: 三维(3D) 数据 – 亦可采集单波长色谱图: 二维(2D)数据色谱峰的纯度鉴定,色谱峰的确认任意波长的再处理所有的操作皆通过Empower软件控制完成2004 Waters Corporation。

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法1 仪器组成及开机1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。

2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。

1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。

接通 2695 分离单元后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“ Idle ”时，仪器进入待命状态。

2 溶剂管理系统的准备2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【 Menu/Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕，光标选“ Degasser ”，按【 Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“ Continuous ”，按【 Enter 】。

2.2 启动溶剂管理系统2.2.1 干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“ Status （ 1）”屏幕下，按【 Direct Function 】，光标选“ Dry Prime ”，按【 Enter 】，显示“ Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“ Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。

2.2.2 湿启动在“ Status （ 1 ）”屏幕下，光标选“ Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“ Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“ Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【 OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。

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主屏幕界面 Status（1）界面
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系统前处理
• 灌注针头清洗泵（Prime Needle Wash）： 在屏幕下按“Diag”,显示“Diagnosties”屏幕， 按“Start”，应见溶剂从废液排放口流出， 运行结束后按“Close”；若想多洗几次时， 按“Start Again”。
HPLC流程原理图
2020/1/21
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开机前的准备工作
• 检查设备电源、电路、信号连接是否完好。 • 连接好需要的色谱柱。 • 流动相：根据待检样品的检测方法配制相应的流动相，必须用
0.45um微孔滤膜抽真空过滤。使用色谱纯的溶剂。水和缓冲液都 需要用超纯水；盛放溶剂和流动相所用的玻璃容器必须用超纯水 清洗。
2020/1/21
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建立项目、编辑仪器方法和方法组
• 编辑仪器方法：点击Empower界面中的“Browse Projects”选择需要 打开的项目点击“OK”，进入到“Run Sample”，选择需要进入的系 统点击“OK”，进入到“Run Sample”界面后，点击“Edit→New Method Set→Yes”进入“New Method Set”界面，点击“Create New”, 此时出现“Instrument Method Editor”界面，按相关要求填写各参 数，编辑完毕后点击“Save”保存，在对话框“Name”中输入此方法 名称保存。
• 湿“M灌en注u/（StaWtuest”P键rim进e入）“：St按atu面s（板1右）下”界方面， 在“Composition”页面中选择将用到的溶 剂通道改为“100%”，按液晶屏幕右下角 “Direct Function”键，移动光标选择“Wet Prime”，点击“OK”。流速及时间可使用 默认值，也可自行设定（如： 5ml/min,3ml/min）,设定完成点击“OK” 即可。将每一个会用到的溶剂通道按照 上述操作一次（也可各通道选25%进行 灌注）。

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法1 仪器组成及开机1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。

2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。

1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。

接通 2695 分离单元后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“ Idle ”时，仪器进入待命状态。

2 溶剂管理系统的准备2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【 Menu/Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕，光标选“ Degasser ”，按【 Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“ Continuous ”，按【 Enter 】。

2.2 启动溶剂管理系统2.2.1 干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“ Status （ 1）”屏幕下，按【 Direct Function 】，光标选“ Dry Prime ”，按【 Enter 】，显示“ Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“ Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。

2.2.2 湿启动在“ Status （ 1 ）”屏幕下，光标选“ Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“ Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“ Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【 OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。

©2004 Waters Corporation
液相色谱检测模式
响应类型
RI 折射率
通用型
UV/VIS FLUOR 紫外/可见 荧光
选择性 选择性
ECD 电化学
选择性
COND ELSD 电导 蒸发光散射
选择性 半通用
灵敏度
µg
ng
pg
pg
pg
ng
线性范围 104
105
103
106
105
103
流速敏感 Yes
– 两个压力传感器感应并 调整柱塞内压力，柱塞 间交换平稳
– 没有出口阀，减少故障 率
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2695溶剂输送系统的特点
独立的柱塞杆驱动马达
– 双压力传感器，监视系统及柱塞腔压力 – 软件根据传感器的反馈，控制所有功能 – 完全没有压力的脉动 – 只有两个进口阀，没有出口阀，可靠性极高
的工作
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2695 样品管理系统:特点
全电子设计,除电源外,
不需其它任何动力
极佳的线性范围及进样
重现性
交差污染极小（全自动
进样针内、外清洗装置）
低维护成本
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2695:样品管理系统
样品瓶数目: 120, 分装于5个样品盘(24瓶/盘) 进样次数: 每瓶可进1 到99次 标准样品瓶: 2 mL 样品室温控: 4 到40℃ ,增量 1℃ 进样体积: 标准配置:0.1 到100 uL 定量环选件: 0.1到2000 uL 最小样品量: 10 uL, 用低体积的内插式小瓶 (Insert) 最小进样量: 0.1 uL

4 3 2 1 2 3
Conventional C18
T
Modern C18 Ideal
4
5 Buffer pH
6
7
8
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色谱图常见问题分析(二)
色谱图多峰少峰问题: –色谱图中未出峰: 进样问题:未进样或样品分解 流动相问题:泵未输液或流动相不正确 检测器设置不正确,或检测器有问题
色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题: –双峰或肩峰 进样量或样品浓度过大 保护柱或色谱柱进口堵塞 保护柱或色谱柱污染或失效 –前伸峰 进样量或样品浓度过大 溶样的溶剂相对于流动相太强 保护柱或色谱柱污染或失效
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色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题: –平头峰 检测器设置不正确 进样体积太大或样品浓度太高 –拖尾峰 保护柱或色谱柱问题:污染或失效 进样问题 检测器时间常数不正确
色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题:
– 所有的峰均为负峰: 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒 光学装置尚未达到平衡 – 一个或几个峰是负峰 流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相
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HPLC常见问题分析
• 流路基线噪音问题
–基线漂移 系统不稳或未化学平衡 温度波动 流动相未正确脱气 流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化 检测器流动池漏;系统中有渗漏 色谱柱污染;固定相渗漏 选用不正确的检测波长(相对于溶剂) 有迟流出的组分

❀ 硅胶的杂质含量
✎ 重金属含量低 硅羟基活性小 拖尾减小 ✎ 是色谱柱质量好坏的重要标志
对HPLC柱的了解 七
❀ 填料的稳定性
✎ 硅胶填料 ✎ pH 2-8
❀ 聚合物填料
✎ pH 2-12 ✎ pH值小于2时
键合相水解
硅胶的溶解曲线
123456789 pH
Waters各种硅胶基质的色谱柱
C1 C4 C6 C8 C18 Phenyl CN NH2
Symmetry C8
12
Resolve C-18
12
Ultrasphere ODS 11
Partisil ODS-3
11
µBondpak C-18 10
Nova-Pak C-18
7
k‘苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
对HPLC柱的了解(五)
✎ 调节流动相的极性 pH 离子强度等
✎ 梯度淋洗
选择性系数 α
❀ 定义
α = tR2 − t0 = k 2 tR1 − t0 k 1
✎ α =1 时两组分分不开
❀ 改变α的途径
✎ 改变固定相
✎ 改变流动相
✎ 改变温度
✎ 改变样品的本身性质
R ∝ α −1 α
α k' N 如何控制分辨率?
液相色谱的检测模式
✎ 掌握分离机理 自己开发方法
❀ 充分了解您自己的样品
或有否类似
分析时要了解哪方面的情况
❀ 灵敏度的要求有多高? ❀ 样品的本底是否很复杂? ❀ 有多少组份要分析? ❀ 对分析的精确度 准确度等有多高要求? ❀ 是否因是日常检验 而要求方法容易使用?

分離是一個物理過程
洗脫
色譜法的分類

按流動相的物態分
氣相色譜(gas chromatography,GC) 用氣體作為流動相(又叫載氣) 液相色譜(liquid chromatography,LC) 用液體作為流動相(又叫洗脫劑)
色譜法的分類

按分離過程的機理分
吸附色譜 根據樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現分離 分配色譜 分離基于樣品組分在固定相和流動相中溶解度(分配系數)不同 離子交換色譜 根據樣品組份離子交換親和力的差異分離 體積排除色譜 GPC(Gel Permeation Chromatography) 固定相是疏水性凝膠,流動相是有機溶劑 GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是親水性凝膠,流動相是水溶劑
流動相的溶劑組成
流動相的黏度是產生反壓的主要原因
溫度 流速
流速對反壓的影響是線性關系
檢測器


檢測器的啟動操作 開啟電源后,需待檢測器通過自檢后,才能被軟件 控制(需5-10分鐘) 通流動相平衡至少需要三十分鐘后才能正常工作
WATERS 2487檢測器

2487檢測器的顯示屏幕
WATERS 2487檢測器

流動相的脫氣的目的
使色譜泵的輸液准確
輸液量均勻准確,并且脈動減小,保留時間及色譜峰面積的重現性提高
提高檢測的性能
防止氣泡引起的尖峰,基線穩定,溶劑的紫外吸收本底降低 保護色譜柱 減少死體積,防止填料的氧化

流動相的脫氣的方法
加熱, 抽真空, 超聲波震蕩, 通惰性氣體, 在線脫氣機
流動相的保存

有機溶劑流動相
標樣濃度C(Xi) 標樣響應值R(Xi)