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实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
细胞核和线粒体的分离实验报告实验五细胞核和线粒体的分离一、实验目的1、了解用差速离心的方法分级分离细胞组分的原理和过程。
2、熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验原理1、分离纯化的方法为了研究某种细胞器的结构、功能或制备某种生物大分子，常需要大量采集细胞的某些亚组分，因此，有必要分离细胞器。
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。
主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。
差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。
被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
密度梯度离心：预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同梯度层内。
匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖溶液（0.25mol/L）。
它比较接近细胞质的分散相，具有足够的渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、细胞器的鉴定细胞核——姬姆萨染液线粒体——詹纳斯绿 B詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
三、实验用品1、试剂:生理盐水、0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、1%詹纳斯绿B 染液、姬姆萨染液2、材料: 兔子肝脏3、器材：解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器4、设备：高速离心机四、实验步骤1、制备兔肝细胞匀浆：向兔血管注射空气针处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
细胞线粒体分离在进行细胞线粒体分离实验时，确保实验步骤的准确性和实验环境的无菌性是至关重要的。
以下是一个基本的线粒体分离流程，以及一些重要的注意事项。
实验材料：1. 新鲜的组织或细胞样品2. 预冷的线粒体缓冲液（MB）3. 预冷的分离介质（例如Percoll或Nycodenz）4. 离心管和离心机5. 显微镜和细胞计数器实验步骤：1. 收集新鲜的组织或细胞样品，并用预冷的MB缓冲液冲洗以去除任何残留物。
2. 将组织或细胞样品放入离心管中，并加入足够的预冷MB缓冲液以覆盖样品。
3. 用锋利的刀片将组织或细胞样品切成小块，然后使用研磨器将其研磨成匀浆。
4. 将匀浆通过纱布或棉签过滤，以去除大的颗粒和细胞残骸。
5. 将过滤后的匀浆转移到离心管中，并加入足够的预冷分离介质。
6. 以适当的离心速度离心样品，以分离出线粒体。
7. 使用显微镜和细胞计数器对离心后的样品进行观察和计数，以确保获得了足够的线粒体数量。
8. 将分离出的线粒体用于后续的实验或保存以备后用。
注意事项：1. 在整个实验过程中，要确保使用的所有溶液都是预冷的，以避免线粒体的热损伤。
2. 在切割、研磨和过滤组织样品时，要尽量减少对线粒体的机械损伤。
3. 离心速度和时间要根据实验条件进行调整，以确保最佳的线粒体分离效果。
4. 在使用显微镜和细胞计数器进行观察和计数时，要确保样品的代表性，并避免误差的产生。
5. 实验过程中要避免污染，包括对溶液、器具和操作者的污染。
所有使用的器具都应经过消毒处理，并在无菌环境下操作。
6. 线粒体是细胞内的亚细胞结构，其功能与细胞的能量代谢密切相关。
因此，线粒体分离实验的结果可以反映细胞的生理状态，对于研究细胞的能量代谢、疾病机制等方面具有重要的意义。
7. 线粒体分离实验的难度较大，需要操作者具备较高的实验技能和经验。
因此，在进行实验前，应充分了解实验原理、熟悉操作流程，并严格按照实验步骤进行操作。
8. 在实验过程中，应注意安全问题。
细胞器线粒体的分离与观察
高熹1120152430（李安一）
（北京理工大学生命学院16121501班）
摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
Giemsa染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。
染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。
姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
2 实验器材及材料
2.1 实验材料
大鼠肝脏。
2.2 实验仪器
高速离心机，解剖刀剪，小烧杯，冰浴盘，漏斗，尼龙织物，玻璃均浆器。
图1 玻璃匀浆器
玻璃匀浆器的作用：让玻璃管与柱塞之间微小的缝隙和细微的凹凸咬合,将其柱塞转动时,产生碾切作用,使生物细胞和其他较硬的细胞组织被轻易的碾碎。
（1）洗干净，烘干，太脏用酸泡洗。
（2）选择合适的匀浆缓冲液,配置好。
（3）在冰上匀浆,匀的次数依实验样品和目的而定。
（4）匀浆完毕,倒出样品。
2.3 实验试剂
（1）生理盐水。
（2）1％詹纳斯绿B染液，生理盐水配制。
（3）蔗糖－Tris盐酸缓冲液（pH7.4）:0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）,0.1mol/L Tris10ml,0.1mol/L盐酸8.4m,加重蒸水到100ml,加蔗糖到0.25mol/L。
蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖,0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）配制如上，加蔗糖到0.34mol/L。
（4）固定液：甲醇－冰醋酸（9：1）。
（5）Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml。
先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内，研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56左右保温2h，令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶中。
用时吸出少量用1/15mol/L磷酸缓冲液作10～20倍稀释。
1/15mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）：
1/15mol/L KH
2PO
4
50ml,1/15mol/L Na
2
HPO
4
50ml。
3实验步骤
（1）制备大鼠肝脏细胞匀浆
实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0～4°C的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0~4°C条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆，蔗糖溶液分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
（2）先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心的加入9ml肝匀浆使其覆盖在上层。
用冷冻控温高速离心机按照图2顺序进行差速离心。
图2差速离心顺序图
（3）分离物鉴定
细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，在甲醇－冰醋酸溶液中固定15min，充分吹干，滴Giemsa染液（原液10～20倍稀释）染色10分钟。
自来水冲洗，吹干，镜检。
观察结果。
线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即滴加1％詹纳斯绿B 染液染色20min，盖上盖玻片镜检。
观察结果。
4实验结果
图3 细胞核染色观察图
图4 细胞核染色局部放大图
图5 线粒体染色观察图
图6 线粒体染色局部放大图
图7 借鉴线粒体染色图
5结果分析
图3和图4中我们可以清楚的看到分离成单个的被染成紫颜色的细胞核，易于辨认。
而在线粒体染色图5和图6中，线粒体染色可能出现了实验失败，无明显可辨的染色后的线粒体。
在图7借鉴的照片中，我们可以看见成单颗装椭圆形的线粒体。
6实验反思
本次实验成败关键在于推片，即制作临时涂片时，可取一片载玻片作推片，将推片自液滴左侧向右侧移动，使液滴均匀地附着在两片之间。
细胞核的推片和染色较为成功，可以观察到较好的结果。
而线粒体组观察较为模糊不清，分析原因为，染色时候，滴加染液后只计时，没有时刻保持观察样品，室内温度较高，导致染色液干结，干结后影响了观察。
后来又用清水冲洗玻片，未有明显改善。
综上，由线粒体染色中较为失败的玻片得出反思，以后实验耗时较长又无需操作的步骤不能放任不管，要时刻观察，避免出现该次试验中染色液变干这种情况的发生。
7参考文献
[1]李万杰, 胡康棣. 实验室常用离心技术与应用[J]. 生物学通报, 2015, 50(4):10-12.
[2]辛华. 细胞生物学实验[M]. 科学出版社, 2001.
[3]王崇英, 高清祥. 细胞生物学实验[M]. 高等教育出版社, 2011.。
