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实验二 细胞核与线粒体的分离与观察

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06实验六--细胞器的分离与观察nj

06实验六--细胞器的分离与观察nj

四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
实验六细胞器的分离与观察一细胞核的分离与观察二线粒体的分离与观察一实验目的了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术二实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官为了研究各种细胞器的功能首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来

细胞生物学实验指导

细胞生物学实验指导

细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。

生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。

细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。

在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。

在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。

实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。

我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。

由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。

编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。

1-细胞生物学实验

1-细胞生物学实验

如镜台测微尺1mm处(全长)与目镜测微尺75 刻度(150小格)重合，则:
目镜测微尺每小格的实际长度=
1 150
mm
=0.0067mm=6.7μm
④同样的方法标定高倍镜下目镜测微尺 每小格的实际长度
计算公式如下:
目镜测微尺每小格的实际长度
镜台测微尺长度 ＝
目镜测微尺格数
＝ 30×10μm 200
(4)测量细胞并计算核质比
五、实验操作
1. 取猪肝1g，放入小烧杯中，加4ml 0.25M蔗糖缓冲液， 将组织剪成约1mm立方的小块。
2. 将剪碎的组织移入匀浆器的外管中，再将内管（带柄 的活塞）插入外管中，缓慢而均匀地施力，上下旋转拉 动，匀浆7-10分钟，然后用六层纱布过滤回洗净的原烧 杯中。（这两步操作略）
3. 每组取1个5ml离心管，加入匀浆液2ml，2000rpm离 心10分钟。（每组1管）
许多酸性染料不易穿过活细胞的质 膜进入细胞内，却能渗入死亡的细胞 内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
2.方法 取酵母悬液一滴于洁净玻片上，滴一滴0.2％亚甲基
蓝染液，加盖片，2分钟后于显微镜下观察细胞。
3.结果 死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。
实验作业
画图记录细胞吞噬实验所见结果
实验三
细胞核与线粒体的 分级分离
实验内容
实验一、细胞的形态结构与显微测量 实验二、细胞生理活动的实验观察 实验三、细胞核与线粒体的分级分离 实验四、细胞分裂的形态观察 实验五、细胞原代培养 实验六、细胞计数及死活细胞的鉴定 实验七、综合设计性实验
实验一
细胞的形态结构与显微测量
实验目的
(一) 观察并了解细胞的基本形态。 (二)掌握临时制片和显微绘图的方法。 (三)了解显微测微尺的原理及使用方法

细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离

细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离

实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。

细胞核的分离和鉴定

细胞核的分离和鉴定

染色（在①②涂片上滴加甲苯胺蓝染液）
染色5—7min 洗涤 镜检
四、注意事项
• （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离 • • • •
过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入， 同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响 后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色 洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞 对食盐的影响。
其沉降速度也不同，所以，常用不同介质和不同离心力离 心，将细胞内各细胞器和组分分级分离出来。细胞器沉降 先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体 和大分子。 细胞核的比重和大小与细胞内其他组分不同。分离细胞核 最常用的方法是将组织制成均浆，在均匀的悬浮介质中进 行用特定的离心力进行离心、分离。 匀浆是指在低温下，将组织块放入匀浆器，加入等渗浆介 质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物 的匀浆液。 分析分离得到的组分，可用细胞化学法进行形态和功能鉴 定。
细胞器核的分离与鉴定
罗林 陈世玉 周刚 万鹏 许在远 邓朋 临床K—10班 1420151040 临床K—10班 1420151033 临床K—10班 1420151028 临床K—10班 1420151039 临床K—10班 1420151034 临床K—10班 1420151038
一、原理
• 细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内
• • •
二、实验用品
• ⑴材料：小白鼠肝脏 • ⑵试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖-
0.003mol/L氯化钙溶液、1%甲苯胺蓝染 液。 • ⑶仪器设备：显微镜、普通离心机、天平、 离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、25毫升 烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、玻 璃匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。

线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心

线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度 上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚 集，有利于分离。
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十
盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
分离细胞核
鸡肝2克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液
↓
将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
1200rபைடு நூலகம்min 离心10min
↓
↓ 沉淀（涂片①自然干燥）
↓ 上清液1
（细胞核及碎片）
↓
洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min）
上清液
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。

细胞生物学实验指导标准

细胞生物学实验指导标准

实验一叶绿体的分离与荧光观察1．实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

2．实验原理叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。

利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。

将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min 离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。

在室温下进行分离要迅速。

某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。

若停止供能，荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。

3．实验材料、用品⑴实验材料：菠菜叶片⑵实验药品：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。

⑶实验仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。

4．实验步骤⑴选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。

⑵利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min，或研磨成匀浆。

⑶用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

⑷取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

⑸将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

线粒体的分离与鉴定

线粒体的分离与鉴定

三、实验用品
1. 材料 昆明种小白鼠 若干只 2. 器材
冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、200 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 菌锅等。
3. 试剂 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)： ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ⑤ ⑦ 固定液：甲醇：冰醋酸(9:1)
一、实验目的
初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的
能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。
七、作
业
线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细 胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高 活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中 需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项 及改进方法。
分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层 有什么作用?
心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。

细胞核与线粒体的分离

细胞核与线粒体的分离
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。

实验一：线粒体和细胞核的制备与观察

实验一：线粒体和细胞核的制备与观察

染色
01
使用适当的染色剂（如甲基绿）对线粒体和细胞核进行染色，
以便在显微镜下观察。
显微观察
02
在显微镜下观察染色后的线粒体和细胞核，记录其形态、大小、
分布等信息。
图像分析
03
使用图像分析软件对显微镜下的图像进行处理和分析，提取有
关线粒体和细胞核的特征参数。
04
结果分析
线粒体和细胞核的形态特征分析
酶
用于消化细胞膜，使线粒体和 细胞核更容易分离。
所需仪器
显微镜
用于观察分离的线粒体和细胞核。
移液器
用于精确移取试剂和细胞样品。
离心机
用于高速离心，分离细胞的不同组分。
恒温培养箱
用于保持细胞培养的温度恒定。
实验对象（细胞来源）
小鼠胚胎成纤维细胞
这些细胞易于培养，并且含有丰富的线粒体和细胞核，适合 用于实验观察。
实验分析
通过实验结果分析，得出线粒体和细胞核在形态、大小、分布等方面 的特征与它们的功能密切相关。
对实验的理解与思考
实验意义
本实验对于理解细胞结构和功能 具有重要意义，特别是对于理解 线粒体和细胞核在能量代谢、基 因表达等方面的作用。
实验局限性
实验过程中可能存在一些误差和 干扰因素，例如组织匀浆不充分、 密度梯度离心条件不理想等。
实验一线粒体和细胞 核的制备与观察
contents
目录
• 实验目的 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论
01
实验目的
理解线粒体和细胞核的功能
线粒体功能
线粒体是细胞内的能量工厂，负责氧 化磷酸化，产生ATP，为细胞提供能 量。
细胞核功能
细胞核是遗传信息的储存和调控中心， 负责DNA的复制、转录和翻译，控制 细胞的生命活动。

1-细胞生物学实验

1-细胞生物学实验



五、实验操作



1. 取猪肝1g，放入小烧杯中，加4ml 0.25M蔗糖缓冲液， 将组织剪成约1mm立方的小块。 2. 将剪碎的组织移入匀浆器的外管中，再将内管（带柄 的活塞）插入外管中，缓慢而均匀地施力，上下旋转拉 动，匀浆7-10分钟，然后用六层纱布过滤回洗净的原烧 杯中。（这两步操作略） 3. 每组取1个5ml离心管，加入匀浆液 2ml，2000rpm离 心10分钟。（每组1管） 接下去的操作见下面的流程图。 健那绿染色：各取10μlD4悬浮液和健那绿染液在载玻片 上混合，10分钟后加盖玻片，观察线粒体。 改良苯酚品红染色：取10μlD6涂片，滴10μl改良苯酚品 红染液，5分钟后加盖玻片，观察细胞核。
2.细胞核的分离提取
3.高速离心分离提取线粒体
操作步骤 装有上清液的高速离心管→ 17000rpm 离心 20 分 钟 → 弃 上 清 ， 留 取 沉 淀 物 → 加 入 0．25mol／L蔗糖－0.003 mol／L氯化钙液1ml， 用吸管吹打成悬液→17000rpm离心20分钟→将 上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入 0.1ml 0． 25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液混匀成悬液→取上清液和沉淀物悬液，分 别滴于载玻片上，各滴一滴 0.02 ％詹纳斯绿 B 染液盖上盖片染20分钟→油镜下观察，颗粒状 的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
(2) 镜台测微尺


1.外形是一载玻片，上有一带精细刻度的标尺。
2 . 总长度为 1mm，分为 100 等份，每一个格的长度为 0.01mm(10μm)。
(3)标定方法

①将镜台测微尺置镜台上。 ②低倍下找到镜台测微尺，使之与目镜测微尺平行且 左端对齐(0刻度重合)。

实验二细胞器的形态观察

实验二细胞器的形态观察
• 观察兔脊神经节切片标本，低倍镜下观察，可见到许多大 小不等、被染成黄色的圆形神经节细胞，该细胞中央有一 不着色呈空泡状的圆形细胞核可作为该细胞的标志。
• 选择神经节细胞较多的部位，转换高倍镜或油镜仔细观察， 可清晰看到细胞中央圆形、空泡状细胞核，有的核内可见 1-2个发亮的呈淡黄色的核仁。细胞质中散在许多棕黑色 颗粒状或短线状的结构，就是高尔基复合体。高尔基复合 体在细胞内的位置一般集中于细胞核外的某一区域，但在 镜下所见的神经节细胞中高尔基复合体却多半围绕在整个 细胞的周围。在视野中也可以看到没有经过核的切面，该 细胞内高尔基复合体就好象散在整体（200×）
• 2、线粒体
• 将小鼠肾脏切片置于低倍镜下观察，视野中可见到许多圆 形或椭圆形的中肾小管横切面，每一种肾小管的中央为管 腔，管壁由紧密排列的单层上皮细胞组成，管壁细胞之间 界限不甚清楚，但可根据核的位置大致确定细胞的范围。 转换高倍镜或油镜观察，可见细胞核呈圆形，浅蓝色，内 有一深染的核仁，核周围的细胞质中有许多蓝黑色颗粒或 线状的结构，即为线粒体。
实验二 细胞器的形态观察
一、实验目的
• 1、掌握光镜下线粒体、高尔基体、中心体 等细胞器的形态特征；
• 2、了解细胞器的超活染色技术（示教）。
二、实验器材与试剂
• 显微镜
• 小鼠肝（肾）切片、兔脊神经节切片、马 蛔虫子宫切片
三、实验步骤
• 1、高尔基复合体
• 电镜下所见的高尔基复合体是由小囊泡、扁平囊泡、大囊 泡三部分组成，但在光镜下所见的却与之截然不同，呈点 状或螺旋状。
• 在小鼠肝脏组织的玻片标本上，横切面呈三角形和深蓝色。 首先在低倍镜下找到小鼠的肝脏组织的横切面，调清视野， 然后转换到高倍镜或油镜观察。可以看到细胞的界限不太 清楚，细胞中央不着色的部位或浅染区是细胞核，内有1 个或多个核仁。在细胞核周围的细胞质中有许多染成深蓝 色的线状、短棒状或颗粒状的结构，这就是线粒体。

细胞实验教案1.

细胞实验教案1.

细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。

二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。

先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。

由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。

分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

三、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

高中生物 实验二线粒体和细胞核的制备与观察

高中生物 实验二线粒体和细胞核的制备与观察

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沉淀（线粒体） 上清液（制一张涂片③后弃去）
生物科学与工程系细胞生物学实验 教学研究室
Байду номын сангаас
涂片方法示意图
4.4 分离物鉴定
▪ 细胞核：将干燥后的三张涂片加入Carnoy固定 液15min，晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏 水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40×） 检查。
▪ 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。 滴加 1%詹纳斯绿溶液染色，10分钟后用光学 显微镜观察。
实验二 线粒体和细胞核 的制备与观察
1.实验目的
▪ 掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核 及线粒体的方法。
▪ 掌握细胞核及线粒体的活体鉴定方法。
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2.实验原理
1）分级差速离心 ▪ 在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度
取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离 心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不 同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使 这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。 ▪ 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核 糖体和大分子。 ▪ 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。
▪ 细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色 碎片。
▪ 线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
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口腔上皮生物细科学胞与教工的学程研系线究细室胞粒生物体学实分验 布
6.注意事项
▪ 分离全过程要在0～4℃进行，如果使用非 冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和 线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可 能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分 离过程不宜过长。

细胞组分分级分离实验报告

细胞组分分级分离实验报告

细胞组分分级分离实验目的分级分离细胞核和线粒体实验原理1.相关概念细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。

常用分离方法：差速离⼼法——不同转速；密度梯度离⼼法——不同浓度的介质2.分离方法（1）差速离⼼法特点：介质密度均⼀；离⼼⼒由低向⾼；逐级离⼼（差速）。

⽤途：初步分离；分离⼤⼩相差悬殊的细胞组分。

细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、⾼尔基体→核糖体（2）密度梯度离⼼法特点：介质密度不均⼀；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速）⽤途：纯化分离细胞器等颗粒组分待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围常⽤介质及要求：蔗糖、⽢油、氯化銫；能产⽣密度梯度，且密度⾼时，粘度不⾼；PH中性或易调为中性；浓度⼤时渗透压不⼤；对细胞⽆毒3.染色方法甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。

詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。

实验设计思路实验结果分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。

如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。

注意事项1.过滤前要先将纱布湿润2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃)3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。

4.离心机温度应设为4℃5.整个分离过程不宜过长,要尽快。

6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。

实验二 鼠肝细胞核及线粒体提取和显微观察

实验二 鼠肝细胞核及线粒体提取和显微观察

实验二线粒体差速离心法分离技术细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心方法，可将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

匀浆(Homogenization)是在低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。

正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取。

[实验要求]1．了解并掌握差速离心法分离技术及原理。

2．熟悉线粒体的Janus green B染色方法，并做出分析。

[实验原理]差速分离由低速到高速离心使细胞内各种组分逐渐沉降。

先用低速离心使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。

由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心才能不断纯化。

詹纳斯绿(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜。

詹纳斯绿解离后带有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上。

内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色。

詹纳斯绿B也可对活细胞进行染色，在显微镜下可观察到细胞内的线粒体因具有细胞色素氧化酶系统，它可使染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在细胞质中的染料被还原呈无色。

细胞核的制备实验原理及步骤

细胞核的制备实验原理及步骤

实验3 细胞核的制备、鉴定原理为研究细胞核及其组成成分，如：染色质、DNA及核内小分子RNA等，需分离制备细胞核。

对于所分离的细胞核，要求保持形态上的完整性，核内成分不渗漏，不污染细胞质等其他细胞器，并且能有较高的得率。

根据实验的需要可以选择不同的分离细胞核的方法，通常用来分离细胞核的方法主要有二大类：第一大类有机溶剂的方法，经Allfrey改进的方法，主要包括如下操作过程：（1）将组织冷冻干燥；（2）研碎细胞；（3）利用不同比重有机溶剂使细胞核与细胞质其他成分分开。

这类方法可以防止细胞核内水溶性的成分丢失，同时也能阻止细胞质的某些成分渗入细胞核内。

虽然有这些优点，但这种方法不能保持细胞核的正常形态，某些酶活力可能因变性而丧失。

所以一般采用非水溶剂分离细胞核，常用于定量分析细胞核的生化成分及其他一些特殊的研究目的。

第二大类，1956年由Chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。

由于细胞核的比重较大，在高密度介质中，在高速离心条件下被沉降下来，从而达到细胞核与细胞质其他成分分开的目的。

Chauveau的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/L蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀在底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作好可分离得到细胞核。

其后又有不少研究工作者对此方法作了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等，改变分离介质的渗透压；选择介质的pH以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。

这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的pH，就能保持细胞核的精细结构。

虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但是实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，另外此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。

目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显蓍地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。

由于柠檬酸降低了溶液pH，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子量的核酸，可能是由于核糖核酸酶（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸络合所致。

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实验二细胞核与线粒体的分离与观察
一、实验目的
1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。

2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。

二、实验原理
细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。

线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。

细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。

对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。

差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。

在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。

在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。

依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。

细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。

缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。

整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。

线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。

从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。

分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。

介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。

EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。

牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
竞争性底物削弱蛋白酶的作用。

三、实验仪器、材料和试剂
1．材料
大白鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）。

2．试剂
动物细胞
（1）0.9 % 生理盐水
（2）0.02 % 詹纳斯绿B染液（用生理盐水配制）
（3）0.25 mol/L 蔗糖+0.01 mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）：0.1 mol/L 三羟甲基氨甲烷10 ml，0.1 mol/L 盐酸8.4 ml，加双蒸水到100 ml，加蔗糖到0.25 mol/L。

蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖
（4）0.34 mol/L 蔗糖+0.01 mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）
（5）固定液：甲醇︰冰醋酸（9︰1）
（6）姬姆萨染液：Giemsa 粉0.5 g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。

先往Giemsa 粉中加入少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2 h 令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。

用时吸出秒量用0.067 mol/L 磷酸盐缓冲液作10～20倍稀释。

0.067 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）：
0.067 mol/L KH2PO450ml
0.067 mol/L Na2HPO450ml
（7）1 % 甲苯胺蓝溶液
植物细胞
（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH 7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。

50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）配法：50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

（2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH 7.4）
（3）20%次氯酸钠（NaClO）溶液。

（4）1%詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。

3．器材。