下载文档原格式
线粒体呼吸功能测试方法摘要：一、引言二、线粒体呼吸功能测试方法概述1.线粒体呼吸功能的概念2.线粒体呼吸功能测试的重要性三、线粒体呼吸功能测试方法的分类1.细胞外液方法2.细胞内液方法四、常见线粒体呼吸功能测试实验1.氧消耗实验2.电子传递链活性测定3.丙酮酸脱氢酶活性测定五、实验操作注意事项1.实验环境的控制2.实验材料的准备3.实验过程中的监测六、线粒体呼吸功能测试在疾病研究中的应用1.线粒体呼吸功能与疾病的关系2.线粒体呼吸功能测试在疾病诊断和治疗中的作用七、未来发展趋势与展望1.线粒体呼吸功能测试技术的创新2.跨学科研究与应用八、结论正文：一、引言线粒体是细胞内能量供应的主要场所，线粒体呼吸功能是细胞生存和发展的基础。
线粒体呼吸功能测试是研究细胞能量代谢的重要手段，通过对线粒体呼吸功能的检测，可以深入了解细胞的生理状态和病理变化。
本文将对线粒体呼吸功能测试方法进行综述，以期为相关领域的研究提供参考。
二、线粒体呼吸功能测试方法概述1.线粒体呼吸功能的概念线粒体呼吸功能是指线粒体在氧化磷酸化过程中，通过电子传递链将电子传递给氧，产生能量的过程。
这个过程包括三个阶段：糖酵解、柠檬酸循环和氧化磷酸化。
2.线粒体呼吸功能测试的重要性线粒体呼吸功能测试是评估细胞能量代谢状况的重要指标，对于研究细胞生理、病理生理以及疾病诊断具有重要的意义。
三、线粒体呼吸功能测试方法的分类1.细胞外液方法细胞外液方法主要通过测定细胞培养液中的氧气消耗量、二氧化碳产生量等参数来评估线粒体呼吸功能。
2.细胞内液方法细胞内液方法主要通过测定细胞内氧化还原状态、ATP产量等指标来评估线粒体呼吸功能。
四、常见线粒体呼吸功能测试实验1.氧消耗实验氧消耗实验是通过监测细胞在一定时间内消耗氧气的量来反映线粒体呼吸功能的状况。
2.电子传递链活性测定电子传递链活性测定是通过检测线粒体内膜上电子传递酶的活性来评估线粒体呼吸功能。
3.丙酮酸脱氢酶活性测定丙酮酸脱氢酶是柠檬酸循环的关键酶，其活性可以反映线粒体呼吸功能的状况。
ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２１．０４．１２·生殖检验·精子线粒体功能检测与男性不育相关性的研究进展作者简介：李红林，１９８０年生，男，副主任技师，硕士，主要从事生殖检验研究，Ｅ ｍａｉｌ：ｈａｙｙｌｈｌ＠１６３．ｃｏｍ。
李红林，傅广波，吕述彦（南京医科大学附属淮安第一医院生殖医学中心，江苏淮安２２３３００）摘要：精子线粒体是唯一含有独立基因组的细胞器，通过氧化磷酸化产生的适量活性氧（ＲＯＳ）和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）维持精子活力、获能、顶体反应和ＤＮＡ完整性。
精子线粒体膜电位（ＭＭＰ）水平的变化、ｍｔＤＮＡ突变或缺失均可引起精子能量合成障碍，是临床评估特发性男性不育的重要指标。
该文综述精子线粒体功能检测与男性不育相关性的研究进展。
关键词：精子线粒体；不育；活性氧；线粒体膜电位；线粒体ＤＮＡ中图分类号：Ｒ４４６ 文献标志码：Ａ 不孕不育症指育龄夫妇未采取任何避孕措施，有规律性生活１２个月内女方未获得临床妊娠［１］。
据ＷＨＯ估计全球约有１．９亿人患有不孕不育症［２］，其中约５０％是由男方因素导致的不育症［３］。
临床工作中，男性不育症的筛查和诊断主要是依据精液量、精子浓度、精子活力和精子形态等指标的检验结果［４ ５］，但大约３０％～５０％的特发性男性不育症患者的精液常规检验指标却完全正常［６］。
线粒体是唯一含有独立基因组的细胞器，通过氧化磷酸化产生的适量活性氧（ＲＯＳ）和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）维持精子活力、获能、顶体反应和ＤＮＡ完整性［７］。
精子线粒体损伤会引发能量合成障碍，导致精子质量和功能下降、甚至消失。
现对近年来应用精子线粒体分子结构和功能检验指标评估男性生育力的研究进展作一综述，为男性不育症发病机制的研究以及精子线粒体功能检测指标的临床应用提供参考。
１ 精子线粒体功能与ＲＯＳ精子细胞中线粒体数超过１０３个／细胞。
精子发育成熟过程中，随着其他细胞器和细胞质的消失，线粒体的数量和结构也发生显著变化，当精卵结合形成受精卵时，精子线粒体会通过自噬途径被完全降解清除［８］。
差速离心法分离线粒体课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)6．转移上清液至新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
细胞质内线粒体dna测量方法
细胞质内线粒体DNA的测量方法主要包括以下步骤：
1. 细胞中线粒体DNA的分离：采用适当的细胞分离技术将线粒体从细胞质中分离出来。
2. DNA扩增：采用聚合酶链式反应（PCR）技术对线粒体DNA进行扩增，以获得足够的DNA进行后续分析。
3. DNA序列分析：对扩增后的线粒体DNA进行序列分析，以确定基因序
列和突变的存在性及其相对频率。
4. 参考序列比对：将测得的线粒体DNA序列与已知的参考序列进行比对，以确定两者之间的差异。
5. 突变位点确定：通过比对结果，确定线粒体基因组中基因序列和突变的存在性及其相对频率，以及位点突变。
通过以上步骤，可以对细胞质内线粒体DNA进行测量和分析，以了解其在生物学和医学研究中的意义和应用。
组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）：
Components Final concentration
Tris-HCl 50mM pH7.4
NaCl 150mM
EDTA 2mM
EGTA 2mM
Triton X-100 0.2%
NP-40 0.3%
PMSF 100uM
NaVO3 1mM
NaF 250mM
Leupeptin 10ug/ml
Aprotinin 2ug/ml
DTT 1mM
组织线粒体的分离
1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓
冲液中，
2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分，
3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎，
4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次，
5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中，
6) 重复上面步骤一次，
7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体，
8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次，
9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours），
10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。
分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法)
低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration
Hepes(KOH) 20mM pH7.2
Sucrose 210mM
Mannitol 70mM
EDTA 1mM
EGTA 1mM
MgCl2 1.5mM
KCl 10mM
DTT 1mM
（注：用前加入蛋白抑制剂混合物，包括100uM PMSF 等）
收获细胞，PBS 洗一次，转入 1.5ml 管中，加入适量低渗缓冲液，冰上浸
泡约1hour, 并不时混匀。
然后用Dounce 匀浆器手工匀浆，其间用台盼蓝检查细胞活性状况，至细胞破碎50%左右停止匀浆。
3000 rpm（约1000g）4℃离心10min,转移上清至新管中，继续12,000 rpm 离心15min，沉淀即为细胞线粒体。
用提取缓冲液清洗一次，80℃冻存备用或直接裂解
线粒体体外功能分析
（1）线粒体耗氧测定：
a) 测定介质（Measuring buffer）：225mM 甘露醇，70mM 蔗糖，1mM EDTA，
0.1% BSA，10mM 磷酸钾缓冲液，pH7.4 。
b) 测定步骤：
1) 预热生物测氧仪并调节氧电极至需体积（2ml），测定温度为25℃。
2) 在反应槽中加入2ml 纯水，使仪器稳定8～10mins，调节仪器最大相对氧浓
度，然后加入少许保险粉，耗尽水溶液中的氧，调节仪器氧零值。
3) 清洗反应槽，然后加入反应介质，开始测定。
介质体积＝反应总体积（2ml）－组织线粒体悬浮液体积。
4) 加入提取的线粒体悬液（一般组织线粒体约60ul，终浓度1mg/ml），记录一段
时间基线后加入外源底物琥珀酸（2.5mM），出现IV 态呼吸，记录约两分钟后，加入ADP（100mM）3ul，出现III 态呼吸，待ADP 完全消耗后线粒体
又恢复到IV态呼吸。
5) 线粒体呼吸控制率（Respiratory Control Rate, RCR），即加入ADP 时（III 态）
的呼吸速率与ADP 耗竭后（IV 态）的呼吸速率之比，RCR 反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。
线粒体膜电位和ROS产生的测定：
a) 测定介质（PT-1 buffer）：250 mM 蔗糖，10 mM Hepes pH7.4，0.5mM KH2PO4，
2uM 鱼藤酮和4.2mM 琥珀酸钾。
b) 测定方法：在石英杯中加入3ml 反应介质，加入线粒体悬液（终浓度
0.5mg/ml），然后加入罗丹明123（终浓度30nM），混匀后，于25℃孵育5min 后，
开始实时监测荧光强度变化（激发波长520nm,发射波长527nm）。
最后在反应体
系中加入mCCCP (终浓度1uM)，以达到完全解偶联，使线粒体膜电位完全丧失，
记录荧光强度的变化。
该荧光强度变化反应线粒体膜电位的高低。
测定线粒体ROS 产生与测定膜电位的体系基本一致，不同是加入的荧光探针是CM-H2DCF （终浓度500nM），混匀后，同样孵育5min，开始实时检测荧光强度变化（激发
波长500nm，发射波长520nm）。
最后在反应体系中加入antimycin A(终浓度50uM)
作为最大量ROS产生的对照。
曲线的斜率即代表线粒体ROS产生的速率。
组织ATP 水平的测定
按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：
1) 取小块组织（约50～100mg）放入玻璃匀浆器中，加入适当比例的裂解液（lysis buffer），冰浴充分匀浆以确保组织完全裂解；
2) 裂解后，12,000 rpm 4℃离心10min，取上清，考蓝定量蛋白浓度，用于后续
测定；
3) 取适当量的ATP 检测试剂，按照1：100 的比例用ATP 检测稀释液稀释ATP
检测试剂，配成ATP 检测工作液，冰浴暂时保存；
4) 加100ul ATP检测工作液到检测孔中（96 孔板），室温放置3～5min，以使本
底的ATP 全部被消耗掉；
5) 在检测孔中加上10～100ul 样品或标准品，迅速用移液器混匀，至少间隔2s
后，立即用luminometer 测定；
6) 根据标准曲线计算出样品中的ATP浓度，并换算成nmol/mg蛋白的形式。
7) 标注曲线用已知浓度的ATP标准溶液按同样方法进行测定和建立。
