利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南

一、脂肪干细胞‎（ASCs）的提取及鉴‎定1、实验技术及‎原理：运用细胞培‎养技术、流式细胞术‎（体外扩增后‎A C Ss的‎表型会发生‎改变，主要体现在‎细胞表面蛋‎白和细胞因‎子表达的变‎化），差异离心术‎（可将基质血‎管细胞沉淀‎与悬浮的成‎熟脂肪细胞‎分离，沉淀中除A‎S Cs，还包括血细‎胞、成纤维细胞‎和内皮细胞‎，基质血管细‎胞沉淀可以‎接种到孰料‎培养瓶中，基质细胞可‎贴壁，造血和其他‎杂质细胞不‎贴壁，在随后的传‎代过程中被‎出去，最终得到的‎ASCs可‎再很长时间‎内保持摸分‎化状态）。

取C57B‎L／6 WT小鼠2‎只，常规麻醉消‎毒，取腹股沟脂‎肪组织剪碎‎至糊状，PBS液冲‎洗去麻药及‎血液，0.075%II型胶原‎酶消化（37℃，30分钟）以去除外基‎质，生理盐水终‎止胶原酶的‎消化，离心（1200g‎,10分钟），去上清液及‎未消化的脂‎肪，10%FBS的D‎M EM重悬‎细胞沉淀，0.16mol‎/L氯化氨溶‎解剩余红细‎胞，离心洗涤，过200目‎铜网，得到单个核‎细胞。

镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在‎培养瓶中，37℃5%CO2孵箱‎培养，24小时后‎第一次换液‎，以后3天换‎液一次，80%融合后0.25% Tryps‎i n,0.02%EDTA消‎化传代。

细胞镜下作‎形态学观察‎及取第三代‎细胞用流式‎细胞仪作细‎胞周期及细‎胞免疫表型‎（C D29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：2.1 材料：C57BL‎／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原‎酶消化，10%FBS，低糖DME‎M2.3 仪器设备：超净工作台‎、恒温培养箱‎、普通显微镜‎、倒置显微镜‎、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟‎镊）、小烧杯，200目铜‎网过滤器，低糖DME‎M、血球计数板‎、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的‎方法与步骤‎：3.1无菌操作‎的要领和要‎求。

干细胞论坛脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20 mL. 在1 h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800 r/min×10 min. 反复冲洗3次后加入等量15 g/L I型胶原酶. 37℃水浴中充分振荡30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心10 min后弃去上清. 将下层细胞用PBS悬浮后加入16 mmol/L NH4Cl 37℃水浴中10 min以裂解红细胞. 低速离心10 min后再用PBS冲洗3次. 最后将细胞用含100 mL/L FBS+10 g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每3 d换液，1 wk后传代. 将第3代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第3代时将其以2×107/L 的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养2 wk后，对成脂诱导组进行油红Ｏ脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC等。

但表达阳性不代表具有特异性，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。

按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。

你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。

干细胞传代吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。

人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定[摘要]目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。

方法: 将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化, 离心。

大鼠脂肪干细胞的分离培养1.试剂配制1.1双抗培养基的配制用100万单位链霉素溶解在10ml去离子水中，抽出0.8ml以及用80万单位的青霉素溶解在8ml的去离子水中，抽出0.5ml，分别加入DM EM培养基中，即配成100U/m1青霉素，100U/m1链霉素双抗培养基。

1.2成骨诱导剂的配制地塞米松259溶解于100ml去离子水中，抽出10ul;10gβ一甘油磷酸钠溶解于6ml去离子水中，抽出lml;25g抗坏血酸溶解于100ml去离子水中，抽出100ul，分别加入100ml的培养基中，既配成了含1nmol/L 地塞米松，50ug/m1抗坏血酸，10mmol/Lβ一甘油磷酸钠的成骨诱导剂。

1.3 DMEM培养基的配制取一瓶DM EM溶解于1000ml去离子水中，搅拌均匀后，用7%NAHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.4含10%胎牛血清的DM EM完全培养基的配制取10ml胎牛血清溶解于90mLDM EM培养基中，即可配成含10%胎牛血清的DM EM培养基，装在100ml的生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.5 0.25%胰蛋白酶的配制用精确的天平称250mg胰蛋白酶，并溶解于100ml培养基中，即浓度为0.25%。

用7%NaHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤后，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.6 Ⅰ型胶原多克隆抗体配制I型胶原多克隆抗体用去离子水配成1:100工作浓度，置4℃冰箱中备用。

1.7 二氮联苯胺(diminob ℃nzidin ℃DAB)显色剂的配制分别取lml试剂A，50ul试剂B，50ul试剂按A到C加入，即配成lmLDAB显色剂。

在配制成30min内用于免疫细胞化学染色。

1.8 地塞米松(DXM)液的配制地塞米松25g溶解于100ml去离子水中，抽出10ul。

既配成了含1nmol/L地塞米松，使用时根据需要配制成不同浓度。

人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的，供大家阅读查看。

大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。

近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。

研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。

本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。

1材料与方法1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。

低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司).1.2方法1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。

加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬，以5×104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。

小鼠皮下脂肪细胞小鼠皮下脂肪细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠皮下脂肪细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的小鼠皮下脂肪细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

小鼠皮下脂肪细胞注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。

培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠皮下脂肪细胞产品简介：1、产品名称：小鼠皮下脂肪细胞2、组织来源：小鼠脂肪组织3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠皮下脂肪细胞简介：小鼠皮下脂肪细胞来源于小鼠脂肪组织，皮下脂肪细胞主要功能：（1）脂肪细胞能储存能量并参与身体代谢。

（2）脂肪细胞分化是一个发展的过程，它对代谢稳态和营养信号很重要。

（3）前脂肪细胞存在于小鼠脂肪组织中，能根据能量的平衡增殖和分化成熟的脂肪细胞。

前体细胞的增殖和分化能够增加脂肪组织的体积。

（4）前脂肪细胞与脂肪分化以及许多生理病理过程密切相关，如脂肪代谢、能量平衡、肥胖、糖尿病、高血脂和乳癌，所以小鼠皮下脂肪细胞对这些疾病的研究提供素材。

脂肪细胞培养方法
脂肪细胞培养方法是脂肪生物学研究中常用的一种技术，其目的是在体外培养脂肪细胞，用于研究脂肪细胞的生理功能、疾病发生机制以及药物筛选等方面。

以下是脂肪细胞培养方法的一般步骤：
1. 预处理：将脂肪组织从体内取出，经过清洗、离心等处理，制成脂肪组织细胞悬浮液。

2. 细胞分离：使用酶消化法或机械剪切法将脂肪组织细胞从脂肪组织中分离出来。

3. 细胞培养：将分离出的脂肪细胞接种到培养皿中，加入含有生长因子、抗生素等营养成分的培养基，进行细胞培养。

4. 细胞鉴定：使用显微镜观察细胞形态，使用细胞计数法、流式细胞术等方法对细胞进行鉴定。

5. 细胞功能研究：对培养的脂肪细胞进行功能实验，如脂质代谢、细胞增殖、细胞分化等。

6. 细胞保存：将培养好的脂肪细胞冻存于液氮中，以备后续实验使用。

需要注意的是，脂肪细胞培养过程中可能会出现细胞死亡、细胞污染等问题，因此需要严格控制实验条件和操作步骤，以保证细胞培养的效率和质量。

脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。

脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。

一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。

2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。

脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。

二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。

2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。

三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。

2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。

通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。

在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。

脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。

希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。

《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言人脂肪干细胞（ADSCs）作为一种重要的细胞资源，近年来在医学和生物学领域中引起了广泛关注。

这种细胞类型不仅在临床医学上被广泛应用于治疗各种疾病，同时在科学研究领域，它的多向分化潜能及生物机制也是备受瞩目的研究方向。

本文就人脂肪干细胞的分离培养方法和多向分化潜能的研究进行了系统性的探讨。

二、人脂肪干细胞的分离培养1. 分离方法人脂肪干细胞的分离主要依赖于酶解法。

首先，从供体脂肪组织中获取足够的细胞，通过使用含有特定酶的溶液（如胶原酶）来分解脂肪组织，使ADSCs得以释放。

随后，通过离心和筛选过程，获取纯度较高的ADSCs。

2. 培养方法ADSCs的体外培养通常使用含有生长因子和营养物质的特殊培养基。

这些培养基提供了细胞生长所需的营养和环境条件。

在培养过程中，应定期更换培养基，以确保细胞持续得到所需的营养供给。

同时，也需要关注细胞的生长状况和活力。

三、多向分化潜能研究1. 分化为成骨细胞ADSCs具有分化为成骨细胞的能力，这一过程可以通过添加适当的诱导剂和调节生长因子来实现。

在分化过程中，可以通过观察细胞的形态变化和特定基因的表达情况来评估其分化的程度和效果。

2. 分化为成脂细胞ADSCs还可以分化为成脂细胞，这一过程可以通过调整培养基中的营养成分和生长因子来实现。

成脂细胞的分化可以通过观察细胞的脂滴形成和特定基因的表达情况来评估。

3. 分化为神经细胞除了成骨细胞和成脂细胞外，ADSCs还具有向神经细胞分化的潜能。

这一过程可以通过特定的诱导剂和培养条件来实现。

对分化后的神经细胞进行功能测试和基因表达分析，可以评估其分化的效果和潜能。

四、结论通过对人脂肪干细胞的分离培养和多向分化潜能的研究，我们可以更好地了解这种细胞的特性和功能。

ADSCs的分离培养方法已经相对成熟，使得我们可以获取大量的细胞进行后续研究。

同时，ADSCs的多向分化潜能也为临床治疗提供了新的可能性和思路。

脂肪前体细胞原代培养具体实验步骤如下：①处死，取60至80gSD大鼠，脱髓处死后放入75%的酒精中消毒3min；②取材，沿腹中线做一切口并暴露大鼠双侧睾丸，选取睾丸组织附近纯净的脂肪组织，放入盛有含10WU双抗溶液的PBS缓冲液的青霉素小瓶中备用；③剪碎，组织块移入超净台内，去除肉眼可的血丝，用含10WU双抗溶液的PBS缓冲液冲洗3遍，最后一次浸泡10min，然后不含双抗的PBS溶液进行冲洗3次，将小瓶内PBS溶液移除，在青霉素小瓶内，使用眼科剪进行剪碎，剪碎至约为1mm3的小块；④消化，向小瓶内加入Ⅰ型胶原酶溶液，溶液的量约为脂肪组织体积的4倍左右，放入水浴锅中37℃消化90min；⑤离心，消化得到的液体使用毛细吸管进行吹打，得到的细胞悬液移入离心管中，800转5min进行离心；⑥培养，去除离心管内上层漂浮物及中间的液体，将离心后底部沉淀移入培养瓶中，加入4mlDMEM/F12培养基，将培养瓶放入37℃，CO2培养箱中进行培养。

脂肪前体细胞的传代培养1、将培养瓶中的培养及全部倒掉，用pbs缓冲液2ml冲洗2次2、加入1ml胰酶消化，在电镜下观察3、放入co2培养箱3~4分钟4、取出加入胰酶的培养瓶，并用手用力在培养瓶侧壁拍打，使贴壁的细胞完全脱落5、加入3ml完全工作液并冲洗细胞贴壁面，并在含胰酶的培养液中充分吹打，使团簇的细胞分离6、取1个新的培养瓶，分别往里打入2ml完全工作液，然后从含有胰酶和细胞的培养液中抽取2ml打入新瓶中，新瓶内有含有胰酶和细胞的培养液4ml，再在原始培养瓶中加入2ml完全工作液7、完全混匀后放入co2培养箱中，做好标记，第二天完全换液，将含有胰酶的培养液全部换掉，加入新的完全工作液4ml。

６期吉红等：草鱼前体脂肪细胞的原代培养１２２７天）、第９天（诱导第６天）的细胞，ＰＢＳ洗３次，１０％甲醛同定３０ｒａｉｎ后，ＰＢＳ漂洗２次，油红０染色８ｒａｉｎ，６０％异丙醇分色１０—２０ｓ，自来水冲洗，甘油明胶封片。

１．２．３总ＲＮＡ的提取分别收集培养至第３天与第９天的细胞各３皿，用ＴＲｌｚｏｌ进行总ＲＮＡ的提取，核酸定量仪（ＮＡＮＯＤＲＯＰ１０００。

Ｔｈｅｒｍｏ公司）测定ＲＮＡ纯度。

提纯的ＲＮＡ，通过琼脂糖电泳鉴定后，贮存于一７０℃冰箱备用。

１．２．４引物设计与合成分别根据ＧｅｎＢａｕｋ中登录的草鱼讹（ＦＪ６１２５９６）、ＪＰ雕Ｒ’，（ＥＵ８４７４２１）和口·ａｃｔｉｎ（ＤＱ２１１０９６）基因序列设计上下游引物，应用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计驴￡与ＰＰＡＲｙ两对引物。

用于检测细胞培养过程中脂肪细胞分化标志基因的表达情况，并以持家基因（口．ａｃｔｉｎ）为内参。

引物由上海生Ｔ生物工程有限公司合成。

引物（表１）。

１．２．５ＲＴ－ＰＣＲ分析ｅＤＮＡ第一链的合成（即逆转录ＲＴ）按照ＦｅｒｍｅｎｔａｓＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｅＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ＃Ｋ１６２１试剂盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司），以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）．８为反转录引物，按照说明书进行操作。

取获得的ｅＤＮＡ第一链为模板进行ＰＣＲ扩增。

扩增时每一个样品测３次。

ＰＣＲ反应体系为：灭菌的双蒸水１８．６ＩＬＬ、１０ｍｍｏＬ／ＬｄＮＴＰＭｉｘ０．５“Ｌ、ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（ＮＨ）２Ｓ０４２．５肛Ｌ、２５ｍｍｏＬ／ＬＭｇＣｌ２１．５ＩｚＬ、ｃＤＮＡ１．２５斗Ｌ、２０ｌＬＬｍｏｌ／ＬＰｒｉｍｅｒ１０．２５ｐＬ、２０ｐ．ｍｏＬ／ＬＰｒｉｍｅｒ１１０．２５肛Ｌ、５ｕ／¨ＬＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．１５ＩｘＬ。

ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性４ｍｉｎ。

９５０Ｃ４５ｓ，５５℃４５ｓ（ＬＰＬ）、５０．５℃４５ｓ（ＪＰＰＡ尺ｙ）／５３．５。