细胞培养试剂及操作流程

SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。

二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。

悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。

细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。

下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。

1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。

-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。

-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。

2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。

-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。

-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。

3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。

-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。

- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。

-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。

-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。

4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。

- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。

- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。

细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。

它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。

下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。

2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。

可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。

分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。

3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。

根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。

4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。

确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。

定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。

5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。

传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。

将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。

6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。

根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。

7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。

选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。

8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。

例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。

收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。

9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。

细胞培养液配制操作规程
试剂和器材准备：
1. 用三角瓶装1L 超纯水，放入搅拌子，盖上铝箔纸，121摄氏度高压灭菌30分钟，冷却过夜。

2. 过滤器装好滤膜后用报纸包装好，121摄氏度高压灭菌30分钟。

3. 装培养液的试剂瓶瓶口用铝箔纸包好，140摄氏度烘烤3小时。

配制过程：
1. 将盛有灭菌超纯水的三角瓶放到磁力搅拌器上，搅拌速度以液面恰能产生漩涡为宜。

2. 打开干粉培养液的包装，将干粉慢慢加入容器，边加边搅拌
3. 往包装袋内加入适量的超纯水使残留的培养液粉末溶解并倾倒入三角瓶内，如此清洗数遍
4. 添加NaHCO3。

RPMI1640添加2.0g NaHCO3，DMEM添加3.7g NaHCO3。

5.搅拌约2小时待干粉完全溶解。

6. 用1N NaOH 和1N HCl调节培养液pH在
7.1～7.2，调节好pH后盖紧容器。

7. 加入5 mL 200×的PS双抗，搅拌均匀。

8. 0.22um微孔滤膜过虑除菌，分装到试剂瓶中，盖好瓶盖密封，4摄氏度保存。

使用前添加血清，使血清含量为10％。

未加血清的培养液可在4摄氏度保存8个月，加血清后应在1个月内用完。

9. 检验。

取过滤后的培养液3～5mL，置于无菌的35mm培养皿中，放入培养箱中培养两天，检查是否有长细菌。

注：
1. 过滤完毕后应及时把过滤器和试剂瓶清洗干净。

清洗过程：自来水冲洗，蒸馏水洗3遍，超纯水洗一遍，沥干，烘干
2. 本操作规程以配制1L为例，配制量多时各组分应等比例增加。

1。

实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS 1640培养液。

2、10%FBS DMEF/12培养液。

3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。

4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。

5、胰酶6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为16407、真核抗生素：G418: 50mg/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/mlT47D 400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/mlMDA-MB-231 5ug/ml潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。

（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。

（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。

（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。

2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管实验流程：（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。

cck8具体操作流程
以下是使用CCK8试剂盒进行细胞活力检测的步骤：
1. 准备细胞：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液。

如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，
如果是悬浮细胞，不需要预培养。

2. 制备培养基：在无酚红DMEM高糖培养基中加入双抗、谷氨酰胺和血清。

3. 准备96孔板：根据实验需求，准备适当数量的96孔板。

每孔加入
100ul细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞
毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul。

如果是贴壁细胞，可以直接在96
孔板中进行实验，如果是悬浮细胞，需要离心后取沉淀进行实验。

4. 加药处理：根据实验需求，在各组细胞中加入不同浓度的药物或对照组不加药。

5. 孵育：将96孔板放入37℃培养箱中孵育一定时间，通常为24小时。

6. 检测：在检测前，将CCK8试剂加入96孔板中，轻轻混匀后继续孵育1-4小时。

然后使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，记录数据并计算
细胞活力。

以上步骤仅供参考，具体操作请根据实验需求和实际情况进行调整。

细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。

（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。

(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。

(4)调节pH值至7.2~7.4。

(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。

此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。

(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。

（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。

配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。

3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。

细胞培养标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事细胞培养的实验技术人员和研究生。

二、操作规程
1、所需试剂细胞培养液、血清、胰酶、PBS或Hank`s液
2、规程：
2.1 细胞株的培养
2.1.1 获取所需细胞株（一般细胞株的运送是把细胞放在培养瓶中，干冰保存运输的）
2.1.2 得到所需细胞株后弃掉多余的培养液，放到5%的CO2培养箱中培养
2.1.3 每天至少观察一次，待细胞长满整个培养瓶的80%时传代
2.1.4 倒掉培养液，用1mlPBS 漂洗细胞一次，加入500ul胰酶消化，消化时间视细胞种类、胰酶浓度和消化温度而定，一般3-5min
2.1.5 终止消化，向上一步消化液中加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.1.6 吹打，用吸管轻轻吹打至细胞全部脱落，注意尽量减少气泡产生
2.1.7 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.1.8 将细胞接种到另外的培养瓶中
2.1.9 换液，根据细胞生长情况，间隔一定时间半量换液。

2.2 原代细胞培养
2.2.1 原代细胞的获取无菌条件下取动物组织剪碎
2.2.2 向剪碎的动物组织加入适宜浓度的胰酶，消化，时间因细胞种类和胰酶浓度而定
2.2.3 终止消化，向上一步消化叶重加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.2.4 吹打将终止消化后的组织转入一培养皿中，加入一定量的培养液轻轻吹打数次，静置5-10分钟
2.2.5 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.2.6 将细胞接种到培养瓶或培养板中，放入5%的CO2培养箱中培养。

细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。

1、2设施检查:确认空调、传递窗工作状态完好。

1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。

并运行30分钟后开始生产操作。

1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。

检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。

合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。

复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。

1、5复苏用水准备:(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。

(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。

1、6操作人员进入层流罩:穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。

1、7溶液使用前处理:辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。

2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。

复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。

辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。

操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。

3、种子支领依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。

本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。