新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定

中文摘要第一部分 MDA对原代培养大鼠皮层神经元的损伤作用目的：丙二醛（MDA）是多不饱和脂肪酸脂质过氧化的副产物，以往被用作氧化应激水平的评估指标，在许多神经系统疾病如脑缺血再灌注损伤、AD、PD等中MDA 含量均有升高。

肌肽是一种生理性二肽，作为内源性抗氧化剂，在脊椎动物脑内浓度可高达20 mM，最新研究发现肌肽有清除醛类的能力，可逆转这些有毒醛类对细胞的损伤，并有利于神经系统疾病的转归。

因此，本实验通过比较MDA与H2O2对培养大鼠神经元损伤作用的差别，以及肌肽对MDA诱导培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用，探讨MDA诱导神经元损伤作用的机制。

方法：采用MDA（100 µM）或H2O2（50 µM）处理细胞24 h建立细胞氧化损伤模型，应用细胞增殖抑制实验（MTT法）评价细胞存活率；Annexin V/PI染色法流式细胞仪检测细胞坏死和凋亡；LDH assay 和Hoechst 33258染色分别检测神经元坏死和凋亡；用DCF-DA染色方法检测细胞内ROS生成及MitoTrack-Red染色辅助线粒体定位；JC-1染色标记线粒体膜电位改变；用SDS-PAGE电泳检测细胞内高分子量聚集物的形成；用Western Blotting方法检测MAPK信号通路及相关凋亡蛋白Bax与Bcl-2的表达。

结果：MDA时间和剂量依赖性地降低培养大鼠皮层神经元的存活率，细胞凋亡和坏死均参与其中；MDA使细胞⊿）的下降；内ROS大量生成，同时伴随线粒体功能失常，表现为线粒体膜电位（ψm细胞内JNK激活而ERK失活。

与普通抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）相比，肌肽⊿的下降、ROS生成和MAPK 对MDA细胞损伤的保护作用更好，它不仅能逆转ψm表达改变，而且还能抑制MDA导致的蛋白质交联。

结论：MDA以蛋白交联/线粒体功能失调/ROS大量生成/MAPK通路损伤神经元，肌肽能够完全阻断此通路从而发挥神经元保护作用而NAC则仅可抑制Bcl-2家族相关MAPK的活性，故其保护作用不及肌肽。

大鼠视网膜神经细胞的原代培养摘要目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。

方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。

结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。

免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。

结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。

关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶引言一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。

【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。

在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。

这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。

在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。

【2-3】材料与方法动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。

所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。

方法：预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。

·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜　茜,姜玉武■,王静敏,秦　炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京　100034)[摘　要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。

方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。

细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。

用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。

结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。

结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。

[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。

新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定【摘要】［目的］探讨新生（spraguedaley,SD）大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况及培养分离，以获得纯化的少突胶质前体细胞，为今后细胞移植治疗研究提供良好的种子细胞。

［方法］出生48hSD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养，原代培养第9～10d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，继续用定向培养基传代培养。

相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况，免疫细胞化学技术进行细胞鉴定。

［结果］混合胶质细胞原代培养第9～10d时出现明显的细胞分层，少突胶质前体细胞散布于单层的星形胶质细胞表面，胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数呈三极突起。

经振荡分离后少突胶质前体细胞纯度达95％，少突胶质细胞特异性标记lig2反应阳性，胶质纤维酸性蛋白抗体反应阴性。

［结论］新生SD大鼠大脑皮层原代培养中少突胶质前体细胞能够维持在未成熟阶段，细胞分层后通过振荡法及差速贴壁法可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞。

【关键词】少突胶质前体细胞;细胞培养；脱髓鞘化；脊髓损伤Keyrds：ligdendrytepreursrell;ellulture;deyelinatin;spinalrdinjury脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可以造成患者严重的神经功能损害。

目前，临床上尚无有效办法治疗脊髓损伤。

随着研究深入，人们对于脊髓损伤的病理过程有了更进一步的认识。

脊髓损伤不仅导致神经元丢失，同时还造成大量少突胶质细胞的死亡，从而引起残留神经轴突的脱髓鞘改变，进一步影响了脊髓神经功能的恢复。

近来不少研究显示通过髓鞘形成细胞移植治疗脊髓损伤，有利于脱髓鞘轴突的再髓鞘化，促进损伤脊髓的神经功能恢复［1,2］。

研究表明，少突胶质细胞不仅形成髓鞘包绕轴突，同时它还起着为其他神经细胞提供营养因子、促进轴突生长等作用［3］。

此外，少突胶质前体细胞是处于分化早期阶段的未成熟细胞，既能够定向分化为成熟少突胶质细胞，同时又具有一定的增殖与迁移能力［4］，更加适合于细胞移植治疗。

新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。

2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。

（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。

3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。

在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。

可一次配好，-20°C保存，每次取用。

4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。

现用现配，37°C保存备用。

5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。

5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。

现用现配，37°C保存备用。

4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。

新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【摘要】目的建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法,以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 24h内新生鼠,用含B27的Neurobasal无血清培养基培养,显微镜下观察神经元的生长状态,MTS法测定不同时间神经元细胞的活力,并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度.结果(①接种24h后,细胞完全贴壁,可见双突起和多个突起的神经元;72h后,海马神经元胞体饱满,立体感较强,突起之间相互形成突触联系,神经元极性完全建立;5～6d的神经元,突起形成密集的神经纤维网络.②MTS法测定结果显示,在培养1～8d时间内,海马神经元随着培养时间的延长,活力增加,第8d细胞活性到达高峰,继续培养时,活力开始下降.③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元,海马神经元纯度达到(85.5±5.4)％.结论本实验方法简单易行,神经元纯度高、细胞活性好,且体外存活时间长,是神经疾病体外研究的良好细胞模型.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(030)004【总页数】6页(P284-287,290,封3)【关键词】海马神经元;无血清原代培养;方法;优化与鉴定【作者】郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【作者单位】广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436【正文语种】中文【中图分类】R329在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。

原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。

注册消防工程师考试题库（1-100题）8月17日1)《建筑设计防火规范》规定，建筑物的耐火极限分为_________级。

(D)A.甲B.乙C.三D.四2)高架仓库是指货架高度超过_________m的机械化操作或自动化控制的货架库房。

(A)A.7B.10C.12D.243)房间地坪面低于室外地坪面的高度超过该房间净高_________，且不超过_________者称为半地下室。

(B)A.1/3，1/4B.1/3，1/2C.1/2，1/4D.1/3，2/54)房间地坪面低于室外地坪面的高度超过该房间净高_________者称为地下室。

(A)A.1/2B.1/3C.1/4D.2/55)《建筑设计防火规范》规定二级耐火等级民用建筑防火墙的耐火极限不低于_________h。

(D)A.1B.2C.4D.36)除规范另有规定外，甲类工业建筑的耐火等级不应低于_________。

(C)A.甲级B.一级C.二级D.三级7)戊类工业建筑的耐火等级不应低于_________。

(D)A.一级B.二级C.三级D.四级8)二级耐火等级的高层民用建筑，其吊顶的耐火极限不应低于h。

(B)A.0.1B.0.25C.0.15D.0.29)高层民用建筑的耐火等级分为_________。

(C)A.三级B.二级C.一、二级D.五级10)除规范另有规定外，一级耐火等级建筑物的楼板耐火极限不应低于_________h。

(C)A.0.8B.1C.1.5D.1.21guomu注册消防工程师考试题库（1-100题）_第2页8月17日11)含水率在_________的原油、渣油、重油等为沸溢性油品。

(C)A.0.1%～2.0%B.0.2%～3.0%C.0.3%～4.0%D.4.0%～6.0%12)甲级防火门的耐火极限不低于_________h。

(D)A.0.6B.0.9C.1.0D.1.213)乙级防火门的耐火极限不低于_________h。

(D)A.0.7B.0.6C.0.8D.0.914)防烟楼梯间及其前室的门均应为_________。

胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。

海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。

海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。

1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。

不同发育阶段大鼠视神经的观察-发育生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——视神经是视觉传导的通路，属中枢神经，由视网膜节细胞发出的神经纤维及神经胶质细胞组成，不含神经元胞体，因此常用作中枢神经损伤再生研究较理想的实验材料[1、2],但有关不同发育阶段大鼠视神经的变化目前还未见系统报道。

本研究从组织形态学的角度，采用常规HE及免疫组织化学染色，结合电镜技术，通过对不同发育阶段大鼠视神经的观察，以期揭示其变化规律，为进一步进行有关视神经的研究提供实验资料。

1 材料和方法1.1 动物及主要试剂来源实验动物由第三军医大学动物实验中心提供成年Wistar品系大鼠，种鼠按雄：雌1∶2笼养交配，次晨检查出现阴栓为妊娠零天。

实验试剂为抗CNPase单抗（23-cyclic nucleotide 3-phosphohydrolase,CNPase,Promega公司）用于标记整个发育阶段的少突胶质细胞，抗GalC（Galactocere-broside GalC,Sigma公司）多抗用于标记成熟的少突胶质细胞。

抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid-ic protein,GFAP,重庆医科大学）单抗用于标记星形胶质细胞。

SP免疫组化试剂盒为中山公司产品。

1.2 分组与检测方法1.2.1动物分组及取材按产后（postnatal）0、3、5、8、15、20、90天平均分成7组，分别命名为P0d、P3d、P5d、P8d、P15d、P20d及P90d,每组4只。

其中HE染色、抗CNPase、GalC和GFAP免疫组化染色2只，电镜2只。

动物断头后1分钟内用显微手术器械于视交叉向前一直达眼球完整取出视神经。

电镜标本放入3%的戊二醛中固定，HE及免疫组化染色标本放入4%的多聚甲醛/PB中固定，常规石蜡包埋切片。

1.2.2免疫组化染色观察操作步骤按说明书进行，只作少许修改，即石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2/甲醇10min,PBS 洗3min3次，7%山羊血清/PBS室温孵育30min,CNPase（1∶1000）单抗，GalC多抗（1∶100）及GFAP单抗（1∶100）4∶过夜，PBS洗5min3次，生物素化IgG（1∶200）37∶6h,PBS 5min3次，HRP标记的链霉卵白素（1∶200）37∶2h,PBS5min3次后，DAB显色光镜观察。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。

2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。

3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。

使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。

4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。

然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。

5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。

6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。

7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。

8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。

9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。

10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。

每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。

11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。

12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。

当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。

小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。