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第八章 蛋白质和氨基酸的测定

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蛋白质与氨基酸测定

蛋白质与氨基酸测定
非必需氨基酸
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。

食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定

食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定

反应原理
电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。 在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变 化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过 消耗滴定剂的量来计算。
反应原理
因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定 突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试 样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定， 氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。
食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总 量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮即氨基酸态氮的百分率来表示。
氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指 标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。
与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸 的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。
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营养学分类
（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸 人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足 正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需 氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。 （3）非必需氨基酸 指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨 基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
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化学结构分类
仪器及试剂
仪器及试剂
1.仪器 分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等； 2.试剂 （1）20g/L茚三酮溶液 称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使 其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色 瓶中冷暗处过夜，加水至58.04 磷酸盐缓冲溶液 准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为 pH8.04磷酸盐缓冲溶液。

《食品分析》课程教学大纲

《食品分析》课程教学大纲

《食品分析》课程教学大纲（Food Analysis）适用专业:食品科学与工程课程学时:32课程学分:2课程代码:先修课程：无机化学，有机化学，分析化学，食品化学，仪器分析一、课程的性质与任务食品分析是食品科学与工程等专业的一门专业限定选修课程，是根据食品的特点，利用分析仪器和分析方法，对食品的品质和卫生进行分析检验的一门专业性很强的课程。

食品分析是研究和评定食品品质及其变化和食品安全的一门科学，任务是依据物理、化学、生物化学的一些基本理论和运用各种科学技术，按照制订的技术标准，对食品工业生产中的物料(原料、辅助材料、半成品以及成品、副产品等)主要成分及其含量和有关工艺参数及污染与残留物及掺假等指标进行检测。

研究方法主要是理论解析和在理论指导下的实验研究。

培养学生运用辩证唯物主义观点和科学方法考察、分析和处理工程实际问题；培养学生的工程观点以及实验技能和设计能力。

二、课程的内容与基本要求本课程以食品中一般成分分析为主，兼顾食品添加剂和有害物质分析。

本课程教学内容如下:第一章绪论教学目标与要求：1.了解食品分析检验的历史与发展方向。

2.理解食品分析检验在食品工业与人们生活中的重要地位。

3.掌握食品分析检验的内容。

4.熟练掌握怎样选择一种食品分析检验的方法。

主要内容：第一节食品分析检验的性质、性质第二节食品分析检验的内容第三节食品分析检验的方法及其发展方向第二章食品分析检验的基本知识教学目标与要求：1.了解食品分析检验的国内外标准与法规及其发展。

2.理解食品分析检验方法选择的重要性。

3.掌握样品的采集、制备和预处理方法，会处理实验数据。

4.熟练掌握样品的概念，样品预处理的原理。

主要内容：1 样品的采集、制备和预处理2 分析方法的选择3 国内外食品分析标准简介4 实验结果及数据分析第三章水分的测定教学目标与要求：1.了解水分测定的新方法及其发展。

2.理解食品中水分测定的重要性。

3.掌握重量法的原理及操作。

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)
苋菜红 胭脂红 柠檬黄 日落黄 靛蓝 亮蓝
2．合成色素的提取
聚酰胺吸附色素
3．定性分析 14． 定量分析 5 ．薄层层析法、高效液相色谱法测定的基本要 求
三、甜味剂的测定
糖精钠的测定：糖精是应用较为广泛的人工甜味 剂 其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：
1．HPLC法 2．酚磺酞比色法 [原理] 样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提 取分离后，与酚和硫酸在175 ℃作用，生成酚 磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标 准系列比较定量。 [说明] ①本法受温度影响较大，要使糖精充分与 酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在 175士2℃温度下反应 2小时。②苯甲酸等有机 物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱 以排除干扰。 3． 紫外分光光度法
二、蛋白质和氨基酸的分类
三、蛋白质的一般性质
1． 物理性质
2 ．化学性质
第二节 蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质 的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质 含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、 酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含 量 。 具体测定方法：凯氏定氮法是最常用的，国内 外应用普遍；双缩脲反应、染料结合反应、酚 试剂法； 国外：红外分析仪
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大 量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时 应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛 醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制 热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继 续加热消化。 ⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克 试样5 m1的比例增加硫酸用量。
[步骤] 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与 滴 定 1.消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4= （NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O

生物药物分析与检验 氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验

生物药物分析与检验 氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验
为热原的含量。 • 中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。 • 采用家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体
内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定 供试品中所含热原的限度是否符合规定。
第一节 氨基酸类药品检验
三、氨基酸含量测定 1、茚三酮法 • 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。 • 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧
4、旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性，且每种 氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨基 酸药物的鉴别指标。
第一节 氨基酸类药品检验
二、氨基酸特殊杂质及安全性检查 1、特殊杂质检查 • 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类
的氨基酸。 • 用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的
COOH
OH
+ H-C-NH2
OH
O
R
O
OH
O
+ NH3 + CO2 + R C
H
O
O
O
OH
HO
+ NH3 +
H
HO
O
O
O
O
NC
H
O
O
+ H2O
第一节 氨基酸类药品检验
2、光谱鉴别法 （1）紫外吸收光谱法 在20
种天然氨基酸中，只有酪 氨酸、色氨酸和苯丙氨酸 在紫外区有最大吸收。
• 酪氨酸的max＝275nm • 苯丙氨酸的max＝257nm • 色氨酸的max＝280nm
第一节 氨基酸类药品检验
• 这三种氨基酸可以通过紫外 吸收光谱加以鉴别。
• 精密称取酪氨酸、色氨酸、 苯丙氢酸各适量。

食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定

食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定

食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定在食品分析与检验领域中具有重要意义。

蛋白质是食品中重要的营养组分，而氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对于评价食品的品质和安全性具有重要意义。

本文将介绍蛋白质与氨基酸的测定方法及其在食品分析与检验中的应用。

蛋白质的测定方法主要有几种：生物测定法、光谱法和色谱法。

其中，生物测定法主要是通过测定食品中的氮元素含量来间接测定蛋白质含量。

常用的方法有凯氏氮法、造浆法和改良Kjeldahl法等。

光谱法主要是通过根据蛋白质的特征光吸收谱测定其含量。

常用的方法有紫外-可见光谱法、荧光光谱法和红外光谱法等。

色谱法是通过分离和检测蛋白质的各种成分来测定其含量。

常用的方法有凝胶过滤层析法、液相色谱法和气相色谱法等。

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对于评价蛋白质的营养价值和品质具有重要作用。

氨基酸的测定方法主要有色谱法和生物传感器方法。

其中，色谱法是目前最主要的氨基酸定量方法，其主要包括高效液相色谱法和气相色谱法。

高效液相色谱法常用于氨基酸的定性和定量分析，具有灵敏度高、选择性好和分析速度快的特点；气相色谱法通常用于氨基酸的定性分析，具有高分离能力和分析速度快的优势。

生物传感器方法是一种新兴的氨基酸测定方法，通过利用生物传感器对氨基酸的选择性响应来测定其含量。

生物传感器方法具有灵敏度高、反应快和操作简便等特点。

在食品分析与检验中，蛋白质与氨基酸的测定具有广泛的应用。

首先，蛋白质含量是评价食品营养价值的重要指标之一、通过测定食品中蛋白质的含量，可以评估其蛋白质营养价值和食品质量。

其次，氨基酸是判定食品蛋白质种类和品质的重要指标。

通过测定食品中各种氨基酸的含量，可以评价蛋白质的品质和营养价值。

此外，蛋白质与氨基酸的测定还可以用于食品的伪标问题的检验，如检验食品中是否含有非法添加的蛋白质或氨基酸衍生物。

综上所述，蛋白质与氨基酸的测定在食品分析与检验中具有重要意义。

通过选择合适的测定方法，可以准确、快速地测定食品中的蛋白质含量和氨基酸组成，从而评价食品的品质、安全性和营养价值。

蛋白质氨基酸测定


三聚氰胺(melamine)
是一种有机含氮杂环化合物，学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺， 或称为2,4,6-三氨基－1,3,5-三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿 酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生 成三聚氰胺-甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐 水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘 性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电 器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部 分亚洲国家，也被用来制造化肥。
①样品消化 : 准确称取一定量的样品至干燥洁净的 500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g（1g）、硫酸钾10g （3g)和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→轻轻摇匀，以45º斜 支于石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电 炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加 大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至 液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉， 取下烧瓶、冷却→转移至100mL容量瓶中，加水定容。
❖ 加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。
消化完全指示：蓝绿色；
三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66 ％），加之其生产工艺简单、成本很低， 给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人 估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加 一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实 蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观 蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因， 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什 么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成 了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。

食品中氨基酸及蛋白质的测定(实验报告)

测定食品中的蛋白质---2013.3.25组员：***实验目的：（1）会测定食品中粗蛋白的含量。

（2）明确常见的食品蛋白质含量，以及测定原理。

实验原理：将被检样品加入浓硫酸，以硫酸铜，硫酸钾为催化剂共同加热消化食品中蛋白质分解为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，通过碱化蒸馏，使氨分离出来，用硼酸吸收形成硼酸按后，再用盐酸标准溶液滴定，根据消耗的标准盐酸的体积，通过换算系数，可测定食品中蛋白质的含量。

实验仪器：凯氏烧瓶、可调式电炉、定氮蒸馏装置试剂：①硫酸铜CuSO4.5H2O ②硫酸钾③硫酸（密度为1.8149g/L）④40g/L 硼酸溶液⑤混合试剂；1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L亚甲基蓝乙醇溶液，用时按2：1的比例混合。

实验步骤:数据处理：标定0.1000mol /L 盐酸标准溶液微量蒸馏按下式计算：X=⨯⨯⨯⨯-10010m c0.014)(0V V F 100⨯式中 X 食品中蛋白质质量分数，%;V 滴定试样时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL;V 0 空白试验时消耗盐酸标准滴定溶液的体积mL ；C 盐酸标准滴定溶液的浓度； 0.014 氮的毫摩尔质量，g/mmol; m 试样的质量，g;F 氮换算蛋白质的系数。

注意事项：①本实验对蛋白质含量进行测定，因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。

②为减少实验误差，所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配置。

③消化过程要不断转动凯氏烧瓶，以利于附着在烧瓶上的固体残渣被洗下，促进其消化；同时为防止造成氮损失，不要用强火，应保持缓和沸腾。

④样品中含脂肪或糖较多，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫外溢，在消化开始时用小火加热，并时时摇动，并可以加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并控制热源强度。

⑤一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，呈较深绿色。

蛋白质和氨基酸的测定


缬氨酸
丝氨酸
Pro的基本组成单位是氨基酸 几种常见的氨基酸
那什么是 氨基酸呢？
几种常见的氨基酸
这些氨基酸 结构上有什 么共同点？
羧基和氨基 连接在同一 个碳原子上
蛋白质的基石物质：α-氨基酸
氨基酸的缩合
二肽、多肽等
肽键
三、什蛋问么：白样蛋质的白性质的质具性呢有？质
1. 盐析 2. 变性
1. 误食重金属盐,可 以喝大量牛奶进 行紧急处理 ,WHY?
a) 凯氏烧瓶500 mL或250 mL b) 龙科A—凯氏定氮仪 c) 扭力天平 d) 分析天平 e) 5mL移液管 f) 温度可以控制的电炉 g) 小漏斗 h) 滴定管 i) 250 mL锥形瓶 j) 玻璃珠
②仪器
③ 试剂
〔GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法〕
a) 硫酸铜 <CuSO4·5H2O> b) 硫酸钾 c) 硫酸 <密度为1.8419g/L> d) 硼酸溶液 <20g/L> e) 氢氧化钠溶液 <400g/L> f) 盐酸标准滴定溶液[c<HCl>=0.0500 mol/L] 或硫酸标准滴定溶 液[c<1/2H2SO4>=0.0500 mol/L] g) 混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 <1g/L> 与5份溴甲酚绿乙醇 溶液<1g/L> ,临用时混合.<也可用2份甲基红乙醇溶液<1g/L>与1 份次甲基蓝乙醇溶液<1g/L>临用时混合>.
36.2
切达干酪
24.9
酸奶(普通的、低脂) 5.3
水果和蔬菜
苹果(生、带皮)
0.2

食品理化分析蛋白质的测定


蛋白质分子中含有肽键 —CO— NH— 与双缩脲结构相似。在同样条件 与双缩脲结构相似。 下也有呈色反应， 在一定条件下， 下也有呈色反应 ， 在一定条件下 ， 其 颜色深浅与蛋白质含量成正比， 颜色深浅与蛋白质含量成正比 ， 可用 分光光度计来测其吸光度， 确定含量。 分光光度计来测其吸光度 ， 确定含量 。 （560nm） ）
般消化至呈透明后，继续消化30 30分钟 （4） —般消化至呈透明后，继续消化30分钟 即可，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 即可，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。 呈较深绿色。 （5） 蒸馏装置不能漏气。 蒸馏装置不能漏气。 （6）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面 蒸馏完毕后， 清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源． 清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造 成吸收液倒吸。 成吸收液倒吸。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式 不同， 不同种类食品的蛋白质系数有所不同， 不同 ， 不同种类食品的蛋白质系数有所不同 ， 如玉米，荞麦， 青豆，鸡蛋等为6 25， 如玉米 ， 荞麦 ， 青豆 ， 鸡蛋等为 6 . 25 ， 花生 46，大米为5 95，大豆及其制品为5 71， 为 5 . 46， 大米为 5. 95 ， 大豆及其制品为5 . 71 ， 小麦粉为5 70，牛乳及其制品为6 38。 小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。
（2） 蒸馏
40%氢氧化钠 氢氧化钠加热蒸 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸 放出氨气。 馏，放出氨气。 观察：若所加碱量不足， （观察：若所加碱量不足，分解 液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀， 液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再 增加氢氧化钠用量） 增加氢氧化钠用量）
2NaOH＋ 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↑ ＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
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• 不同种类食品的蛋白质中，芳香族氨基酸的含 量明显不同。 • 样品溶液必须纯净无色。 • 此法适用于相对纯净的体系。
Bicinchoninic Acid(BCA)法
• 原理 • Smith等人提出,在碱性条件下蛋白质 将铜离子还原成亚铜离子，亚铜离子-蛋白 质复合物和苹果绿的BCA试剂反应形成浅紫 色。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成 正比。
一、凯氏定氮法（常量）
凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以 相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样 品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的 结果称为粗蛋白含量。
此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等 也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速， 故多用于生产单位质量控制分析。
原理
• 样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化 剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白 质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O， 有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。 加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后， 再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。
K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4 2KHSO4 → K2SO4 + H2O↑+ SO2
• 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系 温度过高，又会引起引起生成的铵盐发 生热分解放出氨ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ造成损失。
• 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化 钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸 钾。
（2） （催化剂、指示剂）硫酸铜
1．非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50~100倍。 B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。 2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。 3．特异性要高于其他大多数方法。 4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。
缺点
四、紫外吸收法
原理
• 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由于 蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基 存在。由于存在于每一种食品的蛋白质中 色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可 用比色法，即在280nm处比色测定蛋白质的 浓度。
适用范围
应用 • 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许 多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没 有广泛应用于食品体系。 • 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但 此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱 液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管 蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫外吸收比 在280nm更强，但在低紫外区域的测定更困难。
• 比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色 偏离。 • 几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。 • 不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。
缺点：
• 不如福林酚法灵敏，分析时至少需要2~4mg蛋 白质。 • 如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。 • 高浓度的胺盐会干扰反应。 • 不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，例如 明胶的双缩脲反应产生红紫色。 • 如果有高浓度的脂（用醚抽出）或碳水化合物 存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。 • 此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已 知浓度的蛋白质（如 BSA）或经凯氏定氮法校 正。
蒸馏
吸取5mL稀释后的消化液→加入凯氏定 氮仪内→加10mL40%的氢氧化钠→夹好漏斗 夹→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预 先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) → 加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分 钟) →将冷凝管下端提离液面→用蒸馏水 冲洗管口→继续蒸馏1分钟→加热。
滴定
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶 液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基 红－溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同 时作一试剂空白。
Bicinchoninic Acid(BCA)法
• 方法 • 1 ． 蛋 白 质 溶 液 和 含 有 BCA 钠 盐 、 Na2CO3 、 NaOH、CuSO4、pH11.25的BCA试剂一步混合。 • 2．在37℃保温30min或室温下放置2hr,或60℃保温 30min 。温度的选择取决于灵敏度的要求。较高 的温度导致较深的颜色反应。 • 3．在562nm处比色读数，并做空白比较。 • 4.用BSA作标准曲线。
起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧 化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机 物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。 指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二 氧化钛等也可用的催化剂。
装置
操作步骤
消化 准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g， 液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细 的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→ 安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角 斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热 至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持 瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热 微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
• 硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对 氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置 于冷水浴中使用。
• 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面， 清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可 能造成吸收液倒吸。
二、自动凯氏定氮法
将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的 一套装置，原理与试剂同前。 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏 装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示 装置。
蛋白质的快速测定－双缩脲法
• 原理
方法特点及应用范围
• 灵敏度较低，但操作简单快速，在生物化 学领域中测定蛋白质含量时常用此法。
• 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉 类等样品的测定。也可定量测定分离纯化 后的蛋白质。
步骤
• 标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白 质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含 量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、 100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四 氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确 稀释至 50ml ，振摇 10 分钟，静置 1 小时，取上 层清夜离心 5 分钟，取离心分离后的透明液于 比色皿中，在 560nm 波长下以蒸馏水作参比液 调节仪器零点并测定各溶液的吸光度 A ，以蛋 白质的含量为横坐标，吸光度 A 为纵坐标绘制 标准曲线。
大 豆
大 米
18.12
19.34
5.52
5.17
在消化反应中,为了加速蛋白质的分解, 缩短消化时间,常加入下列物质
1）硫酸钾:
提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生 成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在 340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以 上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解, 水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反 应式如下：
二、复合蛋白质的显色反应
（一）糖蛋白的显色（3种方法）
（二）脂蛋白的显色（2种方法）
蛋白质的测定方法
• 1 凯氏定氮法（ 1833 年 Kieldahl, 常量法、微量法、自动 定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法） • 2双缩脲法 • 3福林酚（Lowry）法 • 4 Bicinchoninic Acid 法 • 5 280nm紫外吸收法 • 6染色法 • 6.1阴离子染色法 • 6.2布兰德福特（Bradford）法 • 7茚三酮法 • 8比浊法 • 9杜马斯法（燃烧法） • 10 红外光谱法
计算
• Page 158 公式
• 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶 冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。 • 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品， 如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨 酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解 完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。 • 蒸馏装置不能漏气。 • 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢 氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
• 生物活性测定
• 功能性质调查 • 营养标签 总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
5、蛋白质的测定方法
凯氏定氮法
利用蛋白质共性的方法
杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并
变色。书中列举了 5 种染料。
Bicinchoninic Acid(BCA)法
• 优点 • BCA 法已经应用于蛋白质的分离和纯化中。此法
•
• • • • 对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。 1 ． 灵 敏 度 与 福 林 酚 法 相 似 。 微 量 BCA 法 的 灵 敏 度 （0.5~10ug）稍高于福林酚法。 2．一步混合的操作比福林酚法更简单。 3．所用试剂比福林酚法简单。 4．非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。 5．中等浓度的变性剂（4M盐酸胍或3M尿素）不对反 应产生干扰。
消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红
外线加热装置组合而成的消化炉。
方法特点及应用范围
• • • • 灵敏 准确 快速 样品用量少
三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏 定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常 量法 • Page 160
• 样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋 白质含量在40～110mg之间）于50mL纳氏比 色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色 后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的 A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进 而由此求得蛋白质含量。
优点：
• 该方法比凯氏定氮法费用低，速度快（可在不到 30min 的时间内完成），是分析蛋白质最简单的 方法。