抗肿瘤化合物E7在不同种属肝微粒体酶中的体外代谢研究

一、实验目的本实验旨在通过体外代谢实验，研究某种化合物在特定酶系作用下的代谢过程，鉴定其代谢产物，并分析其代谢动力学特性。

通过此实验，可以为该化合物的体内代谢研究提供实验依据，并为后续的药物研发和毒理学评价提供参考。

二、实验材料1. 实验化合物：待研究化合物A（纯度≥98%）2. 实验试剂：肝微粒体酶、NADPH、辅酶A、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠等3. 实验仪器：低温离心机、紫外-可见分光光度计、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱仪（MS）等4. 实验动物：比格犬（体重2-3kg）三、实验方法1. 肝微粒体酶的制备：取比格犬肝脏，剪碎后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制成匀浆，低温离心（10000g，4℃，10min）分离肝微粒体。

用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）调整肝微粒体蛋白浓度为10mg/mL。

2. 代谢反应：取肝微粒体酶溶液、NADPH、辅酶A和待研究化合物A，按一定比例混合，在37℃、pH 7.4的条件下进行代谢反应。

3. 代谢产物分析：代谢反应结束后，用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析代谢产物，鉴定其结构。

4. 代谢动力学分析：通过计算酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），分析酶的代谢动力学特性。

四、实验结果1. 代谢产物分析：实验结果显示，待研究化合物A在肝微粒体酶的作用下，产生了多个代谢产物，其中主要产物为B和C。

2. 代谢动力学分析：酶的米氏常数（Km）为0.5μM，最大反应速率（Vmax）为0.2μM/min。

五、讨论1. 本实验成功鉴定了待研究化合物A的代谢产物，为后续的体内代谢研究提供了实验依据。

2. 代谢动力学分析结果显示，该酶对化合物A的代谢动力学特性符合米氏方程，说明该酶对化合物A的代谢具有可逆性。

3. 通过比较不同酶系的代谢动力学参数，可以为药物研发和毒理学评价提供参考。

六、结论本实验通过体外代谢实验，研究了待研究化合物A的代谢过程，鉴定了其代谢产物，并分析了其代谢动力学特性。

药物体外肝代谢研究方法摘要：对近几年的文献资料进行分析、综合、归纳。

介绍肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流及器官组织切片法。

其中，肝细胞体外温孵法是当今药物体外肝代谢研究的热点，对新药研究与开发及正确指导临床合并用药有着巨大的推动作用，将对其进行重点论述。

关键词：体外肝代谢；肝微粒体；肝细胞；离体肝灌流；组织切片广义的药物代谢指药物在体内吸收、分布、代谢、排泄等一系列过程［1］。

狭义的药物代谢是指药物的生物转化。

生物转化后，药物的理化性质发生变化，从而引起其药理和毒理活性的改变。

因此，研究药物的生物转化，明确其代谢途径［2］，对制定合理的临床用药方案，剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。

当前，国内外对药物代谢的研究主要集中在代谢产物生成和确定代谢途径。

在分子生物学技术推动下，药物代谢酶［3］领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极的推动意义，已得到广泛的重视。

肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统［4］，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。

以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。

1 肝微粒体体外温孵法肝微粒体法［5］是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶［6］，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，制备肝微粒体一般用差速离心法。

肝微粒体体外温孵法和其它的体外肝代谢方法相比较，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。

但肝微粒体体外温孵法同其它体外肝代谢方法相比，在体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。

2 肝细胞体外温孵法肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时，该方法得到广泛的应用。

图 1 DHP，DHＲ，DHH，野百合碱的结构
收稿日期： 2013-06-15 基金项目： 上海市国际科技合作基金项目 （ 12430700200） 作者简介： 刘 倩 （ 1978—） ，女，博士，研究方向： 中药化学和代谢。Tel： 13917735267，E-mail： liuqian01101@ 163． com * 通信作者： 谢天培 （ 1962—） ，男，博士，研究方向： 中药物质基础。Tel： （ 021） 51320033，E-mail： tam@ nature-standard． com
rolizine］。结论 野百合碱在地塞米松诱导的 F344 大鼠、F344 大鼠、SD 大鼠、人及 ICＲ 小鼠肝微粒体均可发生代谢，
但代谢率有一定差异。
关键词： 野百合碱； 体外代谢； 液相色谱 / 串联质谱； 野百合碱-N-氧化物； DHP
中图分类号： Ｒ969. 1
文献标志码： B
文章编号： 1001-1528（ 2014） 08-1764-04
2014 年 e Traditional Patent Medicine
August 2014 Vol． 36 No． 8
野百合碱在 5 种肝微粒体中的体外代谢研究
刘 倩1 ， 陈龙龙2 ， 马双成3 ， 张祖艳1 ， 李云华1 ， 钱 勇2 ， 谢天培2* （ 1. 上海沪丰生物科技有限公司，上海 200433； 2. 上海诗丹德生物技术有限公司，上海 201203； 3. 中国 食品药品检定研究院，北京 100050）
内的代谢产物［4］。代谢产物具有很强的亲电性，能与组织 中亲核性 的 酶、蛋 白 质、DNA，ＲNA 结 合，引 起 各 种 损 伤［5］。其 中 （ + / -） -6，7-二 氢-7- 羟 基-1-羟 甲 基-5H-吡 咯 里嗪 （ DHP，包括 DHＲ、DHH，结构见图 1） 形成的 DNA 加合物，是导致肿瘤发生的原因［6］。

药物代谢研究的技术与方法药物代谢是指药物在人体中的分解、转化和排泄过程。

药物代谢过程涉及到许多酶系统和代谢通路，不同的药物会通过不同的代谢途径进行代谢。

药物代谢研究对于药物开发和临床应用具有重要意义。

下面介绍几种常用的药物代谢研究技术与方法。

1. 体内代谢试验体内代谢试验是研究药物在整个机体内的代谢过程，常用的方法有体外实验动物试验和人体试验。

体外试验通常使用小鼠、大鼠、兔子和犬等实验动物，人体试验则需要遵循严格的伦理审查和安全措施。

通过体内代谢试验，可以了解药物的药代动力学、药效学和通过药物代谢酶系统的代谢途径。

2. 体外代谢试验体外代谢试验是研究药物在体外模拟环境中的代谢过程，包括微粒体酶体和肝酶体代谢试验。

微粒体酶体代谢是指药物在细胞质中的代谢，而肝酶体代谢则是指药物在肝细胞的内质网中的代谢。

通过体外代谢试验，可以获得关于药物代谢酶的详细信息和药物代谢通路的理解。

3. 体外代谢酶体系体外代谢酶体系是建立在包含药物代谢酶的部分纯化物中的体外代谢试验。

这种方法可以对药物代谢酶进行更加详细的分析，包括其结构、功能和识别机制等。

体外代谢酶体系可以被广泛应用于药物代谢研究、药物安全性评估和药物治疗反应预测等领域。

4. 代谢产品分离代谢产品分离是一种直接从样品中获得药物代谢产品的方法，包括代谢产物分离和纯化，以及将代谢产物通过质谱技术或结合质谱和其他分析技术进行鉴定和定量。

这种方法可以便捷地获得药物代谢产物，为药物代谢途径和代谢酶系统的研究提供重要信息。

5. 分子生物学方法分子生物学方法包括克隆、表达和纯化药物代谢酶等。

这种技术可以通过基因工程技术对特定酶进行修改和优化，以便更好地研究药物代谢通路和药物代谢产物。

此外，这种方法还可以筛选新的药物代谢酶和新的代谢产物，推动药物发现和开发。

总结来说，以上几种药物代谢研究技术与方法各有所长，相互补充，可以为药物代谢的探索和理解提供重要的工具和手段。

药物代谢研究的未来将继续探索新的技术和方法，以推进药物的研发和治疗。

体外代谢清除率模型用于预测药物肝代谢过程的研究黄峰中药学2110948107摘要：本文主要就计算体外代谢清除率的理论与预测模型做一综述，以期使体内药物代谢过程的检测更加准确，并在此基础上可以预测创新药物在体内可能进行的代谢过程，确定其是否适合进行进一步研究开发，为筛选新药提供新的思路。

关键词：代谢清除率；药物代谢动力学；体外模型前言药物发现与开发的目标是找出并确定具有药理活性的新化学实体。

在过去的几十年里, 药物发现与开发一般方法是在进行药理活性检测后,再对新化学实体进行临床前的动物实验和临床人体试验[1]。

近些年随着组合化学和高通量活性筛选技术的发展,已经使人们能够在一周之内筛选的化合物超过10万个[2],从而发现大量具有药理活性的化合物。

然而一个化合物最终成为能够上市的药物,必须具备良好的类药属性,即：药效活性、安全性、药代属性和适宜制剂的理化性质。

其中,药代属性主要是指化合物能够通过不同生物膜到达作用部位的能力,包括口服生物利用度的高低；以及化合物能否在体内保持一定的浓度水平；与靶受体维持足够时间的结合以产生具有临床意义的药理作用等。

药代研究是一项非常复杂的费时费力的工作，是目前加速药物发现阶段研究速度的瓶颈。

此外,要在前期阶段了解化合物的药代动力学特征,还有一个重要的原因是考虑开发新药的经济成本,一个新药上市需要投入大量的资金,大约在10~30亿美元之间[3],其间被淘汰化合物的数量也是惊人的,因而可以说大量的资金是投入到那些失败了的化合物。

因此,任何能够尽早地揭示化合物的药代动力学特征的研究方式对于降低在高成本的药物开发阶段的失败率是非常有价值的[4]。

肝脏是药物的主要代谢器官,富含参与药物I相代谢和II相代谢的混合功能氧化酶系统,其中90%药物主要是由细胞色素P450酶(cytochromeP-450,CYPs)参与进行生物转化。

当前,人肝细胞[3, 4]、肝切片[5]、cDNA表达的基因重组肝药酶系[6]及人肝微粒体[7]等体外模型已被成功用于对体内肝代谢研究的预测。

［关键词］ 靶向小分子药物； CYP450； 直接抑制； 时间依赖性抑制 ［中图分类号］ Ｒ965． 2 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734（ 2015） 13 － 1523 － 08
Inhibitory effect of SPH0396，a small molecular targeted antitumor agent， on cytochrome P450 isozymes using an in vitro “cocktail”method
［作者简介］ 张乐多，女，工程师，硕士，主要从事新药研发中药物代谢动力学筛选研究。联系电话： （ 021） 61871700 － 8187，E-mail： zhangld@ sphchina． com。 ［通讯作者］ 夏广新，男，博士，教授级高级工程师，主要从事新药研发工作。联系电话： （ 021） 61871700 － 6080，E-mail： xiagx@ sphchina． com。
ZHANG Le-duo1 ，XIANG Zhi-xiong1 ，WAN Hui-xin2 ，XIA Guang-xin1 （ 1 DMPK Department of Central Ｒesearch Institute； 2 Department of Pharmaceutical Chemistry， Central Ｒesearch Institute，Shanghai Pharmaceuticals Holding Co． ，Ltd． ，Shanghai 201203，China）
［摘要］ 目的： 评价靶向小分子抗肿瘤化合物 SPH0396 在体外对人肝微粒体 CYP450 酶 7 种主要亚型 的直接抑制作用和时间依赖性抑制作用，从而为预测其体内抑制情况和临床药物-药物相互作用提供依据。 方法： 采用人肝微粒体外“鸡尾酒法”的孵育体系，选取人肝微粒体 CYP450 酶 7 种主要亚型的混合探针底 物，以液质联用（ LC / MS / MS） 法同时测定各探针底物相应代谢产物的生成量，并求算 SPH0396 对 7 种主要 亚型直接抑制的半数抑制浓度（ IC50 ） 值和时间依赖性抑制的 IC50 偏移值，进而评价 SPH0396 对 7 种主要亚 型的抑制作用。结果： SPH0396 对 CYP1A2 的 IC50 ＞ 100 μmol·L － 1 ，没有直接抑制； 对 CYP3A4 /5，CYP2D6， CYP2C9，CYP2C19 的 IC50 在 10 ～ 17． 6 μmol·L － 1 之间，为较弱的直接抑制作用； 对 CYP2B6 和 CYP2C8 的 IC50 值均为 2． 2 μmol·L － 1 ，为 中 等 强 度 直 接 抑 制 作 用； 对 CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19，CYP1A2，CYP2B6 和 CYP2C8 的 IC50 没有偏移，但是对 CYP3A4 /5 的 IC50 偏 移 分 别 为 2． 6 （ 咪 达 唑 仑） 和 4． 2 （ 睾 酮） ，因 此 对 CYP3A4 /5 存在时间依赖性抑制作用。结论： SPH0396 对主要的 CYP450 酶亚型存在直接抑制和机制性抑制 作用，如果 SPH0396 被开发为临床药物，必须密切关注其与上述酶底物之间发生药物相互作用而导致合用 药物药动学改变的可能，避免临床药效无法发挥，甚至不良反应的加剧。

肝微粒体体外代谢在中药生物转化中的应用研究进展
宋川霞;韩雪花;郭大乐
【期刊名称】《成都中医药大学学报》
【年(卷),期】2017(40)2
【摘要】中药生物转化是我国传统中药与现代生物技术的有效融合的产物,而肝微粒体对中药有效成分的体外代谢研究是中药生物转化一个重要领域。

肝微粒体对中药有效成分的体外代谢研究对于中药药性改变、疗效提高、降低毒副作用、中药有效成分代谢途径的确定等方面具有一定的指导作用。

肝微粒体体外代谢研究为指导临床合理、安全用药、中药的二次开发利用以及新药的研究与开发提供可靠的依据。

本文主要针对肝微粒体体外代谢在中药生物转化中的应用研究进展进行综述。

【总页数】4页(P115-118)
【关键词】肝微粒体;体外代谢;中药;生物转化;应用
【作者】宋川霞;韩雪花;郭大乐
【作者单位】成都中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R284;R2-03
【相关文献】
1.UPLC-MS/MS方法研究次乌头碱在大鼠肝微粒体CYP450中的体外代谢产物及代谢酶亚型 [J], 毕云枫;李雪;皮子凤;宋凤瑞;刘志强
2.肝微粒体体外温孵法与基因重组P450酶系在药物体外肝代谢研究中的应用进展
[J], 刘颖;马小军
3.利多卡因在人肝微粒体中的体外生物转化 [J], 张顺国;唐跃年;李方
4.去氢土莫酸在大鼠体外肝微粒体体系中的生物转化研究 [J], 阿拉腾其木格;杨秀伟
5.基于液相色谱-质谱联用的肝微粒体中药物代谢酶定量方法研究进展 [J], 王欢欢;吕雅瑶;彭博;钱小红;张养军
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代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。

由此，代谢稳定性研究常作为早期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。

目前常用于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。

而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下文将带着这些疑问进行阐述。

1 肝微粒体与肝细胞的差别要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。

肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。

由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。

另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。

此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。

(摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies inDrug Design and Development》一书)（参考Membrane transporters in drug development一文）2 LMS和HMS结果存在差异的原因此处将LMS和HMS的差异的原因分为机制性的原因和经验性的原因。

• 复合：药物首先与氧化型细胞色素P450 Fe3+结合成复合物。 • 还原：P450 Fe3+-药物接受还原辅酶Ⅱ提供的电子，由辅酶Ⅱ细胞色素
C还原酶传递，还原成P-450 Fe2+药物。 • 接受一分子氧：P450 Fe2+药物中的低铁血红素能与分子氧结合。 • 再接受电子还原： O2—P—Fe2+—药物再接受两个电子，由NADPH提供
谢谢大家
药物相互作用实验过程
• 采用与代谢稳定性一致孵育体系，冰浴上加入1 µL的一系列浓度的待 测化合物（1、10、100、1000、10000 µM）和1 µL的各特异性探针 底物（空白对照样品不加待测化合物，只加等量溶剂），在37 ℃水 浴中预热5 min，然后冰浴上加入5 µL的肝微粒体酶，轻轻混匀，根据 不同的探针底物在37 ℃水浴中孵育10~30 min，加入有机溶剂混匀终 止反应，每个浓度组设3个平行样品。其中待测化合物浓度为0.01、 0.1、1、10、100 µM。反应结束后，采用LC-MS/MS方法测定各特异 性底物对应的代谢产物的生成量，考察不同浓度的药物对各个特异性 探针底物代谢速率的影响。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
实验过程和代谢稳定性实验一致只是选用的肝微粒体为几种不同种属不同种属的代谢稳定性实验?采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系一致的实验过程分别加不同种属的肝微粒体酶孵育通过不同种属中药物剩余量的百分比的对数与反应时间做曲线求斜率计算不同种属的代谢半衰期和清除率比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接近程度最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考

树豆酮酸A对人肝微粒体中5种常见细胞色素P450酶的体外抑制作用研究作者：陈瑞周维张丽朱高峰黄静汤磊来源：《中国药房》2021年第02期摘要目的：研究树豆酮酸A对人肝微粒体中的5种细胞色素P450（CYP）酶的体外抑制作用。

方法：采用Cocktail探针药物法，在人肝微粒体中加入50.0、15.0、5.0、1.5、0.5、0.15、0.05 μmol/L的树豆酮酸A，与混合探针药物[包含非那西丁、右美沙芬、奥美拉唑、睾酮、甲苯磺丁脲（分别为CYP1A2、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9的探针药物）]共同孵育60 min。

在另设空白组和阳性对照组[α-萘黄铜、奎尼丁、（+）-N-3-苄基香酚、酮康唑、磺胺苯吡唑（分别为CYP1A2、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9的特異性抑制剂）]的基础上，以葛根素为内标，采用超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS/MS）分析相应代谢产物（对乙酰氨基酚、右啡烷、5-羟基奥美拉唑、6β-羟基睾酮、羟基甲苯磺丁脲）的含量。

以ACQUITY UPLC®BEH C18为色谱柱，以0.01%甲酸水溶液-0.01%甲酸乙腈为流动相（梯度洗脱），柱温为40 ℃，流速为0.4 mL/min，进样量为2 μL;采用电喷雾电离源，以多反应监测模式进行正负离子扫描，数据采集范围为m/z 100～1 200，碰撞气为氩气，雾化气为氮气，锥孔气流量为50 L/h，脱溶剂气流量为800 L/h，正、负离子模式下毛细管电压分别为2.0、1.5 kV，离子源温度分别为120、110 ℃，脱溶剂的温度分别为400、450 ℃。

使用Graphpad Prism 5.0软件进行非线性回归分析并计算半数抑制浓度（IC50）。

结果：上述各代谢产物检测浓度的线性范围分别为0.26～8.35、0.36～34.56、0.10～3.09、3.67～117.37、0.15～4.88 μmol/L（R2>0.99），定量下限分别为0.26、0.36、0.10、3.67、0.15 μmol/L。

药物在肝微粒体酶的体外代谢研究引言：药物代谢研究对于药物的临床应用非常重要。

在人体内，肝脏是主要的药物代谢器官之一、药物在肝脏中被代谢为水溶性化合物，以便能够更容易地从体内排出。

肝脏代谢中的一个重要组成部分是微粒体酶。

微粒体是肝细胞中一种重要的细胞器，包括内质网、高尔基体和溶酶体。

微粒体酶主要负责药物的氧化、还原和水解等反应。

其中，细胞色素P450（CYP）家族是最为重要的微粒体酶之一、CYP酶参与药物的氧化代谢，并且在药物代谢中起着重要的催化作用。

药物在体外代谢研究中，常常使用肝微粒体酶来模拟体内药物代谢。

这种模型既可以用于研究药物被微粒体酶代谢的速率，也可以用于揭示药物代谢途径和代谢产物。

方法：在体外代谢研究中，一种常用的方法是测定药物在肝微粒体中的代谢速率。

这可以通过测定产物的形成速率或底物消失速率来实现。

通常情况下，选择一定浓度范围的药物，在一定时间内与肝微粒体共同反应。

反应结束后，使用高效液相色谱仪（HPLC）等分析方法，分离和鉴定代谢产物。

结果和讨论：通过肝微粒体的体外代谢研究，可以获得药物的代谢速率常数（Clint）和代谢产物的种类及药物代谢途径。

Clint反映了药物在体内被微粒体酶代谢的速度。

它是药物浓度的函数，浓度越高，代谢速率越快。

药物的代谢速率常数可以用于预测其在体内的代谢消除速度，以及调整药物给药剂量和间隔时间。

此外，体外代谢研究还能揭示药物的代谢途径和代谢产物。

其中，药物代谢途径主要包括氧化、还原和水解等反应。

这些代谢反应产生了多种代谢产物。

以肝微粒体代谢为例，其中一个重要的酶家族是CYP酶。

不同的CYP酶参与不同的药物代谢反应，并生成特定的代谢产物。

通过分析药物代谢产物的种类和结构，可以了解药物在体内的代谢途径。

结论：药物在肝微粒体酶的体外代谢研究是了解药物代谢的重要手段之一、通过体外代谢研究，我们可以获得药物的代谢速率常数和代谢产物，从而预测其在体内的代谢消除速度和调整药物给药剂量和间隔时间。

主要的药物代谢研究方法有：1.肝脏代谢的研究方法肝脏代谢的研究方法中有肝微粒体温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏灌流技术、肝组织切片法、基因重组P450酶系、微透析技术等。

⑴肝微粒体温孵法--肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，一般采用差速离心法获得肝微粒体。

此法制备简单，代谢时间短，易于重现，方便大量操作以积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而应用较为普及。

⑵肝细胞体外温孵法--本法同肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应，适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时，该方法得到广泛的应用。

⑶肝脏灌流技术--该技术使肝脏具有独立并接近于生理条件的循环体系，在严格控制的条件下，药物与灌流肝脏接触，然后通过肝静脉液与门静脉液分析、肝脏生化指标的测定以及肝脏纵切片检查，以确定药物在肝脏发生的变化以及对肝脏的效应。

肝脏灌流技术大体上可分为3大类：离体肝灌流、在体肝灌流及在体肠-肝灌流技术，又同时分为：循环型和一过型。

⑷肝组织切片法--肝组织切片法不破坏肝脏的细胞构成和组织结构，不仅完整保留了所有肝药酶及各种细胞器的活性，而且保留了细胞与细胞间的联系及一定的细胞间质，因而更能反映药物在体内生理条件下的实际代谢情况，代谢活性可保持8~24h，但因为组织切片机的价格昂贵，所以应用受到限制。

⑸基因重组P450酶系--基因重组P450酶系具备分子生物学技术优势，因而具有分子水平的特点，较其他的体外肝代谢方法更能具体量化的研究药物代谢，在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。

⑹微透析技术--微透析技术是一种在体取样技术，可连续跟踪体内多种化合物随时间的变化；取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点化合物的浓度，且样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定；用于研究药物代谢，可维持实际生理条件，消除了传统药物代谢研究中因组织均匀化破坏细胞隔室造成对代谢研究结果的影响，并可获得有关药物代谢中间过程的信息，而传统方法只能了解代谢的最终产物，不能反映其中间过程。

阿替美唑不同种属体外代谢产物鉴定比较及代谢通路研究李正;高尤;杨春苗;仇晓燕;张天宏;张文鹏;苏瑞斌;庄笑梅【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2018(0)12【摘要】目的应用Q-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC/LTQ-Orbitrap-MS)鉴定和比较阿替美唑在不同种属肝微粒体以及细胞色素P450(CYP)同工酶中的代谢产物,探讨阿替美唑代谢转化的种属差异及代谢通路,为新药研发和可能的药物相互作用研究提供科学数据.方法应用不同种属肝微粒体以及重组人源CYP同工酶体外温孵模型获得体外代谢产物.体外样品采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS分析,Phenomenex C18(100 mm×2.1 mm,5μm)柱分离,0.1％甲酸水溶液-乙腈流动相梯度洗脱,流速0.5 mL·min-1,正离子模式检测.结果根据精确相对分子质量和二级碎片离子信息,初步鉴定了阿替美唑在不同种属肝微粒体孵育样品中产生3个氧化产物,包括末端乙基羟基化(M1)、苯环氧化(M2)和咪唑环氧化(M3)产物,产物谱无种属差异.CYP同工酶温孵法发现,M1由CYP2A6,2D6和3A4介导产生,M2由CYP2A6,2D6和2C19介导产生,M3由CYP2A6,2B6和3A4介导产生.结论阿替美唑体外CYP酶介导的代谢转化无种属差异,代谢通路广泛,不易发生基于CYP代谢酶介导的药物相互作用.【总页数】7页(P946-952)【作者】李正;高尤;杨春苗;仇晓燕;张天宏;张文鹏;苏瑞斌;庄笑梅【作者单位】军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850;海军青岛特勤疗养中心,山东青岛266071;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850【正文语种】中文【中图分类】R969.1【相关文献】1.LC-MS/MS 法研究 Cocktail 探针药物咖啡因、右美沙芬、奥美拉唑、咪达唑仑及其代谢产物在大鼠血浆中的药代动力学 [J], 徐利云;候丛颂;杨志宏;孙晓波2.反相高效液相色谱法测定奥美拉唑及其代谢产物5′-羟基奥美拉唑和奥美拉唑砜的血药浓度 [J], 付良青;黄丰;吴德政;郭军华3.Liguzinediol在不同种属肝微粒体中代谢产物的比较研究 [J], 戴贞丽;文红梅;单晨啸;尤晓亲;董棒;孙学;李伟4.沉香样品中曲霉属真菌菌株HNWSW-20的分离鉴定及其次生代谢产物的研究[J], 邓加艾;戴好富;王宇光;陈惠琴;谭志琼;梅文莉5.不吸水链霉菌代谢产物抗真菌作用的研究（Ⅱ．）不吸水链霉菌代谢产物体内、体外抗真菌作用的观察 [J], 侯芳玉;刘长林;杨丽春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

肝微粒体体外代谢实验原理你知道吗，肝脏就像咱们身体里的一个超级大工厂呢。

这个工厂里有好多小“工人”，肝微粒体就是其中很重要的一部分。

肝微粒体就像是一群特别的小助手，它们在肝脏里干着超级厉害的活儿——代谢。

那啥是代谢呢？简单来说，就是把咱们吃进去的东西呀，还有身体里自己产生的一些物质，加工处理一下。

比如说，有些药物进入咱们身体了，肝脏就得想办法把它变得对身体有用或者变得能排出体外。

这时候肝微粒体就登场啦。

肝微粒体里面有好多酶，这些酶就像是小工匠手里的工具。

这些酶可以对药物或者其他物质进行各种改造。

比如说，有的酶可以把一个大的分子拆成几个小的部分，就像把一个大蛋糕切成好几块小蛋糕一样。

还有的酶呢，可以给某个物质加上点什么东西，或者去掉点什么东西。

这就改变了原来物质的性质啦。

在体外做肝微粒体代谢实验，就像是把肝微粒体这个小助手从肝脏这个大工厂里请出来，放到一个专门的小实验室里工作。

我们为啥要这么干呢？这是因为在体外做实验，就可以更清楚地看到肝微粒体到底是怎么对那些物质进行代谢的。

我们会给肝微粒体提供一些要代谢的东西，就像给小助手一个任务一样。

然后呢，我们就可以在旁边观察啦。

这个过程中，我们可以知道肝微粒体是怎么用它里面的酶来处理这些物质的。

比如说，我们可以看看这个代谢的速度有多快，就像看小助手干活儿有多麻利一样。

而且呀，通过这个实验，我们还能发现很多有趣的事儿呢。

比如说，有些药物在肝脏里可能会被代谢得特别快，这就意味着这种药可能在身体里待不了多久，效果可能就不太好。

而有些药物可能代谢得很慢，那它在身体里停留的时间长，可能就会有一些其他的影响。

这个实验还能帮助我们了解不同的因素对肝微粒体代谢的影响哦。

就像是给小助手不同的工作环境，看看它们的工作效率会有什么变化。

比如说，温度呀，酸碱度呀，这些条件变了，肝微粒体代谢那些物质的能力可能就不一样了。

这就像我们人一样，在不同的环境下干活儿的状态也会不同呢。

另外呢，肝微粒体体外代谢实验也能帮助我们研究药物之间的相互作用。

体外肝代谢系统的研究与应用探讨关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨摘要：肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。

对肝药酶的研究方法中，以动物肝脏或肝细胞为根底，构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。

对体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。

本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统，并对各体外代谢研究方法进行比拟，指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的，选择适当的研究方法的重要性。

关键词：细胞色素P450酶；肝微粒体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流药物代谢（drug metabolism）一般是指药物的生物转化（drug biotransformation）。

药物经生物转化后，可引起药物的药理活性或∕和毒理活性的改变。

因此，研究药物的生物转化，明确其代谢过程，对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。

肝脏是药物生物转化的重要器官，含有参与药物代谢重要的酶系（细胞色素P450酶，cytochrome P450，CYP450)，该酶系参与药物及各种内源性和外源性化合物在体内的代谢过程。

CYP450酶系由三十多种同工酶（亚型）组成，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族［1］。

本文所介绍的各种体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶，为研究药物体外代谢提供了研究的对象和根底。

动物肝体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择性，为整体试验提供可靠的科学依据。

以肝脏为根底的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。

1肝微粒体1.1肝微粒体的制备多数采用差速离心法［2］，通过高速离心使微粒体与其他成分别离，操作简单，无需其他试剂辅助。

但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受到一定的限制。

针对这些情况，可采用试剂辅助别离的方法［3］，在离心前额外参加一定比例的PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。

李 兰 张丹参河北科技大学，【摘要】体外代谢研究对阐明药效物质基础及作用机制有重要意义。

常见的体外肝代谢研究方法有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、反映体内药物的综合代谢情况，内外的药物代谢转运的研究。

目前肝灌流技术和基因重组成本、数据处理技术等要求较高，的科学技术方法和手段。

由于药物体外肝代谢对新药研究与开发、因此该文将对其进行重点论述。

【关键词】体外肝代谢；体外温孵法药物代谢是指机体对药物在体内的处置过程，其中包括吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和排泄（excretion）4个阶段［1］。

其中药物代谢及转化的主要器官为肝脏，是药物生物转化的主要场所，是富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能的氧化酶系统，药物的Ⅰ相反应（官能团反应）和Ⅱ相反应（结合反应）都是在肝药酶系统的参与下发生的。

体外药物肝代谢与体内代谢相比，有许多的优点：①可排除体内诸多的干扰因素，直接观察代谢酶对底物的选择性代谢；②体内代谢转化率低且检测手段不灵敏；③体外代谢研究具有简便快速的特点，适合大量化合物的药动学筛查；④不需消耗较多的样品和实验动物，研究费用相对较少［2］。

通过追踪药物化学成分在体内代谢的过程，结合药理活性的研究，有助于阐明药效物质及其作用机制，药物的体外代谢研究在提高药物疗效、安全合理用药、新药研发等方面的意义不可忽视。

实验研究中心常用的体外肝代谢方法主要有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝灌流技术、肝组织切片技术、基因重组P450酶系等［3-4］，并广泛的应用于药物毒理学、药动学及药效学的研究中，根据不同的要求和目的加以选择和利用，可达到理想效果。

现对常用的体外肝代谢研究方法进行综述，以期为药物体外肝代谢研究方法在新药研发中的应用提供参考价值。

1 肝微粒体体外温孵法肝微粒体体外温孵实验是一种利用差速离心技术从动物肝脏中提取肝微粒体，并加入还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）或尿苷二磷酸葡糖醛酸（uridine diphosphate glucuronic acid，UDPGA），在体外模拟生理环境下进行代谢反应。

代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异同时，肝细胞中存在着多种代谢途径，如CYP、UGT、SULT等，化合物可能同时被多种代谢酶代谢，导致代谢产物的种类和数量较多。

而肝微粒体中仅存在少数几种代谢酶，化合物的代谢产物种类和数量相对较少。

因此，化合物在LMS 和HMS中的代谢产物种类和数量的差异是机制性的原因。

2.2经验性原因除了机制性原因外，LMS和HMS结果存在差异还有一些经验性的原因。

例如，不同制备方法和制备批次的肝微粒体和肝细胞可能存在差异，不同实验室使用的肝微粒体和肝细胞也可能存在差异。

此外，实验条件的不同，如温度、pH值、底物浓度等，也可能导致LMS和HMS结果存在差异。

因此，在进行LMS和HMS实验时，需要注意控制实验条件的一致性，以减少经验性因素对结果的影响。

3 如何选择数据进行化合物评价和预测人体清除率在进行化合物评价和预测人体清除率时，应该选择LMS 和HMS中较慢的代谢速率作为标准值。

因为这个代谢速率反映了化合物在体内的代谢稳定性。

同时，应该注意控制实验条件的一致性，以减少经验性因素对结果的影响。

在预测人体清除率时，可以根据化合物在LMS和HMS中的代谢速率，结合药物的分布和排泄特性，进行体内药物动力学模型的建立和预测。

化合物主要通过非CYP代谢酶如AO、UGT和MAO-A 在肝细胞中代谢，而肝细胞中这类酶的含量高于肝微粒体，因此化合物在肝细胞中的代谢速率较快。

然而，当化合物为肝脏主动摄取转运体时，肝细胞代谢速率并不会快于肝微粒体。

这一点在Mechanistic insights from comparing intrinsic clearance values een XXX一文中得到了证实。

此外，一些经验性的研究表明，LMS与化合物的理化性质、渗透性和酶表型有关。

其中，主要经CYP3A和UGT代谢的化合物其固有清除率LMS高于HMS。

这一点在XXX一文中得到了验证。

面对LMS和HMS的差异，我们需要解决两个问题：在化合物筛选早期，以哪个数据为准来进行化合物的ranking；在化合物开发阶段，采用哪个数据来进行人体清除率的预测。