QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)

质粒抽提一、溶液及培养基配制：1、LB液体培养基（1）配方:酵母提取物（Yeast extract）5g/L胰蛋白胨（Tryptone）10g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。

B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。

C、定容。

D、加塞、包扎。

F、高压灭菌121 C, 30min ,灭菌后室温保存备用。

若要分装需要在超净台内。

G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP ）。

先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。

（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基（1）配方:酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠（NaCl）5g/L胰蛋白胨（Tryptone）10g/L氨苄青霉素溶液100^g/ml （终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）琼脂粉15g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。

B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。

C、5mol/L NaOH 溶液调pH 到7.4。

D、定容。

E、分装、加塞、包扎。

F、高压灭菌121 C, 30min。

G、火菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中（或室温），待培养基温度降到55C时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。

（3）倒板：一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4 C保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。

首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。

小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。

转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐；注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。

纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作：1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养补充：1.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合2.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA3.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制4.准备1个冰浴盒用于步骤65.准备室温下的异丙醇10.5ml6.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤：peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。

(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。

(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。

QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。

（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。

（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。

（4）需准备好异丙醇和70%酒精。

（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。

表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。

2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。

3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。

4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。

5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。

6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。

7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。

8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。

洗涤2次。

使用之前：1、加RNase A溶液至Buffer P1，混匀，保存在2-8度2、选做：以1:1000加LyseBlue reagent至Buffer P13、4度预冷Buffer P3.检查Buffer P2 for SDS沉淀4、准备异丙醇5、加40ml 96%-100%至试剂盒提供的无内毒素水中。

6、用无内毒素或无热源的塑料制品步骤1.收获过夜LB培养物（高拷贝100ml;低拷贝250ml）,6000×g,15min,4度2.充分重悬菌体沉淀于10mlBuffer P13.加10mlBuffer P2，颠倒管子4-6次来混匀，室温（15-25℃）孵育5min，如果加了reagent，溶液会变蓝4.在孵育时，将QIAfilter Cartridge cap旋到QIAfilter Cartridge的出口嘴。

将QIAfilter Cartridge放到一个方便的管子或QIArack。

5.加10ml预冷的Buffer P3，颠倒管子4-6次混匀。

若加了LyseBlue reagent，混匀溶液直至无色。

6.将裂解的菌倒进QIAfilter Cartridge圆筒。

室温孵育10min。

不要插入plunger！从QIAfilterCartridge cap的出口嘴移开cap。

轻轻将plunger插入QIAfilter Cartridge，然后过滤细胞裂解液至50ml管。

7.加2.5ml Buffer ER至过滤的裂解液中，颠倒大约10次混匀，放冰上孵育30min。

8.用10mlBuffer QBT平衡QIAGEN-tip 500，通过重力清空柱子9.将第7步过滤的裂解液倒在QIAGEN-tip，使其进入tip。

10.用30mlBuffer QC 洗QIAGEN-tip，洗两次。

11.用15ml Buffer QN洗脱DNA至一个30ml无内毒素或热源的管子。

12.加10.5ml室温的异丙醇至洗脱的DNA混匀来沉淀DNA，≥15000×g离心30min,4℃。

质粒大抽protocol(用QIAGEN Maxi Column)2003/4/28陈俊1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到3ml选择性培养基，摇床培养14小时,225 rpm。

2. 从小量培养物中取1ml用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物，以1：1000接种到100 ml选择性LB培养基中，摇床培养14小时,225 rpm。

3. 从大量培养物中取700微升菌液和300微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过夜后，放入-70℃冰箱中。

并且在stocklist中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的上方)。

4. 把100ml的菌液倒进250ml离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟（No41 rotor 8500rpm）。

5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（确定是否加了RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。

然后将悬浮液转到50ml的离心管中。

6. 加入4ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。

样品不要斡旋，buffer P2用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的CO2酸化。

7. 加入4ml 预冷的PH调节液buffer P3,及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育15分钟。

后再一次混匀样品．20000g，4℃离心30分钟（N046 rotor 18000 rpm）.若上清不够清需再离心15min. 此步可对上清取样240ul （sample 1）以备检测分析8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。

用4ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。

QIAGEN large-Construct Kit提取过程：准备工作：(1)100mlATP溶液：2.75g无水的ATP-Na2溶解于40ml双蒸水，用10MNaOH(约1ml)调pH至7.5，用双蒸水定容至50ml，分成300μl每小份保存于-20℃。

(2)将RNaseA(220μl)溶液加入Buffer中，每瓶P1加一支RnaseA(用前离心)，终浓度为100ug/ml。

(3)将225μlExonclease Solvent溶液加入ATP-Dependent Exonclease中，轻轻混匀。

放置15min，不要激烈振荡，使其充分溶解。

(4)检查P2中是否有SDS沉淀，如果有则溶解沉淀的SDS。

(5)在4℃下预冷P3。

(6)65℃预热QF Buffer。

提取步骤：(1)从新制备的平板上挑取单克隆接种于2～10ml含有氯霉素（终浓度为12.5ug/ml）的LB液体培养基中，37℃，300rpm摇床培养大约8h。

（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）(2)取0.5～1ml菌液接种至500mlLB培养基中，即按1/500或1/1000的比例接种。

37℃，300rpm摇床培养12～16h（使细胞密度达到3～4*109/ml）。

（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）(3)4℃，4000rpm（6000g）离心15min，以收集菌体。

此菌体沉淀可存放到-20℃冻存。

(4)用20ml P1 buffer充分悬浮菌体（用P1 buffer前检查是否添加了RNaseA，此步务必要充分悬浮以使菌体裂解充分）（如果没有60ml大小的管子，则可以将重悬后的细菌分到两个50ml的管子中，分别处理完第（5）（6）步在第（7）步后再混合到一起）。

(5)加20ml P2 buffer，轻柔颠倒4～6次，混匀，室温放置5min。

此步加入P2buffer后要立即盖上盖子，以防止空气中的CO2与Pbuffer作用，同时放置时间不能超过4min，此时不能剧烈摇晃。

质粒DNA中提方法（QIAfilter midi kit 25）适用于100 微克的高质粒或粘粒DNA，使用QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。

低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。

为质粒选择适当的培养体系。

在开始之前的注意事项■如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而增加DNA 产量。

■可选：删除样品的步骤用符号表示☞为监测分析凝胶（见第34 页）的过程。

■加入buffer P3后，样品不再需要冰浴。

在开始之前做的东西■把提供的RNase A 添加到buffer P1 中。

一瓶RNase A (使用之前简要地离心）加入一瓶buffer P1 ，终浓度为100 ug/ml。

■检查buffer P2 是否由于低温存储产生SDS沉淀。

如有必要，37 ° C下使SDS溶解。

.■在4 °C预冷buffer P3。

■可选：使用前将提供的LyseBlue 试剂添加到buffer P1 混合。

每个buffer P1 瓶加入一小瓶LyseBlue （在使用之前简要离心），达到1: 1000 稀释。

LyseBlue 可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的SDS、基因组DNA污染、细胞碎片等。

过程1.摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5 ml LB 培养基中。

在37 ° C 摇菌约8 h （约300 rpm）。

使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。

2.稀释选择性LB 培养基1/500 -1/1000。

若为高拷贝质粒，接种到25 毫升或● 100毫升的介质具有▲ 25—50 µ l 或● 100 – 200 µ l 起始培养液。

若为低拷贝质粒，接种▲ 50 — 100 毫升或● 250 毫升的介质具有▲ 100 – 200 µ l 或● 250-500 µ l 起始培养基。

质粒大抽（手提）步骤资料来自网络，适当改进试剂配制：Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。

1M NaOH (400ml )：分子量：40，秤取16g NaOH，溶于400ml 双蒸水中。

2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml 双蒸水中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。

10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。

Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml 双蒸水，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。

Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml 双蒸水，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。

(注：不需要定容，严格按步骤操作)Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml 双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。

菜鸟级大抽质粒实验前准备QIAGEN版目前本人以菜鸟级身份，在师兄师姐们的指点下顺利使用QIAGEN 试剂盒进行了大抽，现在将操作步骤、实验原理注意事项、之前需要准备的东西都进行一下小小的总结，以方便各位菜鸟们在实验之前有个基本的认识，这样操作起来心里会比较有数。

但介于本人只是菜鸟级的所以给出的建议仅仅是本人最近几次实验的总结，仅供参考，如果有什么问题还请高手们指点。

在做质粒大量提取前一般需要进行固体培养基铺菌、小试管摇菌然后1L液体培养基摇菌，最后收集菌液进行质粒提取。

D1---准备需要的瓶子及进行固体培养基养菌。

配置固体培养基配方：每升固体(L)LB培养基配方：Nacl 10g 、胰化蛋白胨10g、酵母粉5g 、琼脂糖15g,加950ml 去离子水（RO）高压灭菌20min灭菌后加入待冷却至60°左右时加入相应的抗生素（浓度根据不同的抗生素而定），倒入洗净高压灭菌的玻璃平皿中。

基本上100ml 即可以制作7-10个，所以不用倒的太多太厚，个人觉得细菌生长要求的培养基并不多，所以不用太厚，但要铺的均匀，倒入平皿后不要晃动，待其凝固。

在等待凝固的同时，就可以准备菌液了。

将之前保存的菌液从﹣20°的冰箱中取出，在室温中令其溶解。

充分冲悬混溶，根据之前的浓度大小，取一定量的菌液。

我用的菌液是师姐之前自己保存的，说是浓度还可以，建议我取20μl，结果长出来也还是很满，个人感觉大肠杆菌生长旺盛，只要10-20μl即可以顺利长起来的。

用小枪尖点在已经凝固好的固体培养基的中间，用铺菌专用的铁丝铺满整个平皿，注意铁丝在使用前要用酒精棉擦拭干净并且在酒精灯下充分烧灼灭菌，待铁丝冷却后方可使用。

将铺好菌的平皿放在37°孵箱中孵育过夜。

未使用的平皿可以用封口胶封口保存在4°冰箱中。

一般可以在一个月内使用。

2.为明天的小试管摇菌做准备配液体100mlLB培养基，用于小量培养大肠杆菌。

质粒抽提详细步骤质粒提取实验步骤摇菌：（先倒入锥形瓶再消毒）1 将配好的LB培养液高温消毒后，放入40C冰箱，冷却；2 在酒精灯旁操作，向锥形瓶中加入100mlLB，加入150ul氨苄（看抗性）；3 再向锥形瓶中挑入少量菌（液体：60~80ul；固体：绿豆大小）；4 放入摇床，摇一夜。

LB培养液的配方1）胰化蛋白胨（）10g/L(tryptone)2）酵母提取物5g/L（yeast extract）3）Nacl 10g/L4）去离子水（双蒸水）950ml 终体积为1000ml5）配好后，需高温消毒（纱布或报纸包）质粒提取：QIAGEN plasmid Midi kit（25）试剂盒准备2个50mlEP管，提2个质粒一共要6个50mlEP管。

使用前注意事项：1）P1在使用前要加入RNAase，终浓度为100ug/ml，P1一直放40C。

2）事先溶解P2（天冷时P2会出现沉淀，应放37 0C水浴溶解）。

3）预冷至P1、P3（P2作用为裂解细胞）至4 0C。

4）提质粒前一天消毒50ml，20ml管子及2mlEP管及LB，干燥待用。

5）摇菌和保菌都要开酒精灯，尽量保持无菌，用酒精灯擦桌子和瓶口，不能讲话或者戴口罩。

步骤：1 摇菌100ml过夜（100ml菌分两次离心，锥形瓶中剩余的菌留作保菌用）；2 酒精灯旁操作，倒入50ml管子，6000g、15min（离心力/RCF）、40C（配平及记得更换转子/Rootor）,离心完后弃去上清收集细菌；3 用3ml P1重悬细菌沉淀物（充分溶解，沉淀可通过枪反复上下吸打混匀）分两管离心，各加3ml P1，后再混合为一管，保证100ml 菌液用了3ml P1重悬。

4 加3ml P2（P2比较粘稠，用之前要晃匀），充分混匀到整个液体都变蓝（上下轻柔颠倒4~6次），室温放置5min（混匀时不可过猛，以免弄断genemic DNA；裂解物是粘性的，溶解时间切勿超过5min，一旦加入P2就应立即将管子盖上，以防酸化）；5 加入预冷的P3 3ml，立即温和的混匀至蓝色消失（上下轻柔颠倒4~6次），放置冰上避光孵育15~20分钟P3后，产生蓬松白色物质，沉淀物变得不粘（沉淀物包括genemic DNA、蛋白质、细胞碎片、SDS）；6 4 0C、≥20000g、30min离心，将上清液放入另一10ml的EP 管（注意移动时不能晃，以免将沉淀转入），直接在离心室加，加完一个扔一个，注意一点沉淀都不能吸进去，吸时用双枪头，黄枪头套在蓝枪头外，减少冲击；7 离心同时，用4mlQBT润洗QIAGEN-tip100（平衡膜），弃去脱下上液；8 用2×10mlQC洗QIAGEN-tip100两次，弃去滴下的液体（注意滤膜不要干燥，管中液体满了就弃去，液面不要触及TIP下部，如果触及则用双蒸水冲洗），加入离心后并经过萃取的上清液，萃取步骤如下图；20000g、15min、4 0C离心把离心后的上清液直接加到TIP中过滤（TIP标记）；9 待液体差不多滤过时，用5ml的QF洗脱膜上的DNA，用10mlEP管收集洗脱物（最先流出来的3~4滴弃去），收集后混匀，可用摇床10min；10 每管用3.5ml的室温异丙醇沉淀DNA，混匀10min，然后4 0C、≥15000g、离心30min，沉淀在管底的异丙醇沉淀物有玻璃样外观，非常松软，弃去上清时小心；11 先加1ml的70%乙醇洗DNA沉淀，移入1.5ml的EP管（把沉淀打散后再移入，能不用2mlEP尽量不用，TIP的架子要回收），15000g离心10分钟，倒去上液，不要触及沉淀，重复洗一次（把沉淀吹打到液体中，轻柔）；12 空气中干燥沉淀5~10分钟，待干燥后（无色透明）用合适体积（50ul）的AE溶解沉淀（560C水浴10min，加快溶解），放入4 0C冰箱过夜；13 第二天测浓度（DNA），稀释到1ug/ul，待转染用。