去内毒素质粒小提试剂盒说明书

E.Z.N.A Plasmid Miniprep Protocol 质粒小规模提取试剂盒Product Number D6942 and D6943,D6944注意：1．使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存2．加60ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.室温保存除试剂盒外还需准备：可达到13000×g的离心机无核酸酶的离心管无菌去离子水或TE缓冲液纯乙醇操作规程：(提取过程在室温下进行)：1.在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml LB培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37cº振荡培养12-16h。

需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.2. 取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min，去上清3. 加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。

（用移液枪吹打进行重悬浮）4.加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。

最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。

(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)5.加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀6.室温13000×g离心10min，紧凑的白色沉淀就会形成，迅速进行到下一个步骤7.特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。

要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。

室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱8.弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度以备后续试验使用。

如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略9.弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min，弃过滤液。

精品文档。

1欢迎下载 E.Z.N.A.™ 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文）（适用于No. D6942, D6943 & D6944）1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培养基进行培养。

37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。

使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。

强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。

此类菌株包括DH5α和JM109。

2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。

轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。

3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。

充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA 非常重要。

4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。

可能需要孵育2min 。

不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。

该步反应不要超过5min 。

溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。

5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。

为避免形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。

6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。

白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。

7. 小心翼翼．．．．的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。

确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。

室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。

8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。

该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。

9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。

内毒素去除试剂盒说明书I. DESCRIPTION细菌内毒素(脂多糖，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。

人们在研究革兰氏阴性菌血症和内毒素血症的过程中，发现细菌内毒素在其中起着关键的作用，内毒素使机体免疫功能严重受损，进一步的发展可能引发脓毒性休克，弥散性血管内凝血，急性呼吸窘迫综合症，全身炎症反应综合症或致命性多器官功能衰竭。

因此，内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的，尤其对于基因药物、蛋白药物、单抗克隆药物、治疗性疫苗、小分子化学药物等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。

本试剂盒使用的是一类高效内毒素去除树脂，它以修饰过的多粘菌素B（PMB）为配体，进行特异性的内毒素去除。

经此亲和树脂纯化，样品最终的内毒素水平可低于0.1 EU/ml。

亲和树脂的主要特性如下表：规格 1.5 ml预装柱结合能力高达2,000,000 EU/ml 树脂配基修饰的多粘菌素B (PMB)pH 范围pH 5-10基质4% 交联的琼脂糖凝胶颗粒大小90 µm保存温度2°C-8°C使用寿命18个月平衡缓冲液磷酸盐缓冲液，pH 8.0适合纯化对象蛋白，多肽，抗体，多糖等离子条件0.1-0.5 M NaCl可耐受试剂20% DMSO, 20% 乙醇, 20% 甘油;1 M 尿素, 300 mM 咪唑; 0.05% 吐温-20, 10 mM DTT 等II. KEY FEATURES·高稳定性，高去除效率·高结合力：> 2, 000, 000 EU / ml (CV)·无需恒流泵即可调节流速·重复使用5次不会改变柱子效果·使用方便，试剂盒中提供无热源缓冲液，无热源收集管，无热源枪头等III. CONTENTS试剂盒内容 3 – 5个测试亲和树脂 1.5 ml 预装柱再生缓冲液125 ml平衡缓冲液125 ml流速控制器1个无热源接收管 1 包(3个/包)无热源枪头(1 ml) 2包(6个/包) 说明书1份IV. MATERIALS AND EQUIPMENT NEEDED BUT NOT PROVIDED1. 铁架台2. 0.1 M的氢氧化钠和0.1M盐酸, 用于调节样品pH值V. ENDOTOXIN REMOVAL PROTOCOL样品处理：样品的pH值和离子强度在内毒素去除的过程中起着重要作用。

质粒抽提：质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

实验原理：提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。

详细内容请参考《分子克隆实验指南》。

另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。

碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。

将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。

只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。

当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。

煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。

加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA 变性。

但是。

闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。

当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。

GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS60007.3 v.A GENMED无内毒素小量质粒抽提试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED无内毒素小量质粒抽提试剂是一种旨在通过化学和生物裂解细胞、 沉淀、亲和树脂过滤、萃取来达到脱盐、去内毒素、去蛋白、去杂质小分子的纯化无内毒素质粒DNA的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种质粒/柯斯质粒DNA样品的制备，OD260/280在1.8-2.0之间。

产物可用于各种后续分子生物学操作。

产品即到即用，性能稳定，操作方便迅速，提取效率和纯化程度高。

技术背景内毒素（Endotoxin）是一种脂多糖（Lipopolysaccharides；LPS），革兰氏阴性细菌细胞膜的组成成分。

在质粒纯化过程中，细菌裂解释放出内毒素，伴随着质粒，严重干扰后续真核细胞的转染，尤其对于敏感的细胞株。

GENMED无内毒素小量质粒DNA制备技术综合了酶解、碱裂、煮沸等优势元素，融入了特异亲和树脂充分有效地使细菌中核酶、PCR反应抑制剂失活，并清除内毒素（低达<0.1 EU/微克）以及非DNA 分子，其效率和纯度都出乎其上。

产品内容GENMED混匀液（Reagent A）毫升GENMED裂解液（Reagent B）毫升GENMED平衡液（Reagent C）毫升GENMED去毒液（Reagent D）毫升GENMED去干扰剂（Reagent E）微升GENMED沉淀液（Reagent F）毫升GENMED清理液（Reagent G）毫升GENMED保存液（Reagent H）毫升产品说明书1份保存方式保存GENMED混匀液（Reagent A）和GENMED去干扰剂（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备1.5和2毫升离心管：用于样品操作的容器微型台式离心机：用于沉淀核酸涡旋震荡仪：用于混匀反应物37℃恒温水槽：用于孵育反应物1．加入毫升含质粒的细菌到毫升离心管（注意：确保细菌量OD600＝ ;如果细菌量不足，影响质粒提取）2．放进微型台式离心机离心秒，速度为g（例如eppendorf 5415D，RPM）3．小心抽去上清液4．加入微升GENMED混匀液（Reagent A），涡旋震荡少许，使细菌颗粒混匀5．加入微升GENMED裂解液（Reagent B），轻轻混匀6．加入微升GENMED平衡液（Reagent C），强力涡旋震荡秒7．放进微型台式离心机离心分钟，速度为g（例如eppendorf 5415D，RPM）8．小心移取微升上清液到新的毫升离心管，避免絮状物9．同时移取微升GENMED去毒液（Reagent D）到另一个新的毫升离心管（注意：参见注意事项3和4）10．放进微型台式离心机离心分钟，速度为g（例如eppendorf 5415D，RPM）11．小心抽去上清液12．加入微升实验步骤的上清液13．涡旋震荡秒14．平放在平式摇荡仪上孵育分钟，速度为RPM15．放进微型台式离心机离心分钟，速度为g（例如eppendorf 5415D，RPM）16．小心移取微升上清液到新的毫升离心管，避免黑色小粒17．加入微升GENMED去干扰剂（Reagent E），混匀18．放进℃恒温水槽孵育分钟19．加入微升GENMED沉淀液（Reagent F）20．涡旋震荡秒21．放进微型台式离心机离心分钟，速度为g（例如eppendorf 5415D，RPM）22．小心抽去上清液23．加入微升GENMED清理液（Reagent G）24．放进微型台式离心机离心分钟，速度为0g（例如eppendorf 5415D，RPM）25．小心抽去上清液26．空气中晾干27．加入0微升GENMED保存液（Reagent H）28．放进℃冰箱里备用注意事项1．本产品为20次操作2．本产品采用特殊树脂法3．使用GENMED去毒液（Reagent D）前，充分混匀4．使用1毫升枪头，将枪头尖端部分剪去，用于移取GENMED去毒液（Reagent D）5．细菌量是个重要因素：通常1毫升细菌可获得1－5微克无内毒素质粒6．如果需要制备各种数量的细菌质粒/柯斯质粒，可订购中量和大量规格7．本公司提供GENMED RNA清除试剂盒（GMS20059）和GENMED去内毒素试剂盒（GMS20067）8．本公司提供系列质粒提取试剂产品1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定去内毒素和纯化程度高使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。

质粒小提试剂盒 Mini Plasmid Kit(目录号：HS0101)产品包装（注意：使用前将全部RNase A 溶液加到Buffer P1中混合均匀，2 ~ 8℃保存）保存条件本试剂盒在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。

若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。

单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。

加入RNase A 后的Buffer P1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。

产品简介本试剂盒用于质粒DNA 的小量制备与纯化。

菌体经碱裂解、高盐、低pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。

通过漂洗液PW 的清洗可去除杂质，在低盐、高pH 条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒DNA 。

使用本试剂盒可从1 ~ 5 ml 过夜培养的菌液中纯化得到高达20 ug 的高纯度质粒DNA ，在30 min 之内完成提取任务。

所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR 、测序等各种常规分子生物学操作。

北京厚生博泰科技有限公司Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 快速：步骤少，操作简便，节约时间。

2. 简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液不需要另加乙醇，即开即用。

3. 高质：OD260/280在1.7 ~ 1.9之间。

4. 稳定：正确保存条件下一年内提取效果不发生变化。

操作步骤1. 取1 ~ 5 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。

（注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1 ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次）2. 加入250 ul Buffer P1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。

（注意：是否将RNase A溶液加到Buffer P1中并混合均匀；菌体沉淀是否悬浮充分，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）3. 加入250 ul Buffer P2，温和颠倒混匀6 ~ 8次，直到溶液变得清亮粘稠。

质粒小量提取试剂盒说明书货号：D1100规格：50T/100T保存：常温保存，复检期一年。

（注：RNase A以附件形式发货，收到未使用前请-20℃保存）试剂盒内容：试剂盒组成D1100-50T D1100-100TRNase A300ul500ul溶液Ⅰ15ml30ml溶液Ⅱ15ml30ml溶液Ⅲ20ml40ml漂洗液15ml15ml×2洗脱液15ml30ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份产品说明：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。

离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。

使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。

溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA （将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。

如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

操作步骤:1、取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3、向离心管中加入250ul溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

质粒小质粒小量提取量提取量提取试剂盒试剂盒（Plasmid Miniprep Kit ）目录号目录号：：ZP101 版本版本：：2014-10-15 试剂盒内容： 试剂盒组成ZP101-1 (50次) ZP101-2 (100次) ZP101-3 (200次) RNaseA (10 mg/ml) 150 μl 300 μl 600 μl 溶液1 15 ml 30 ml 60ml 溶液2 15 ml 30 ml 60 ml 溶液3 20 ml 40 ml 80 ml去蛋白液W1 30 ml 60 ml 120 ml 漂洗液W2 15 ml 2X15 ml 2X30 ml 洗脱缓冲液TE 15 ml 15 ml 30ml 吸附柱 50个 100个 200个 收集管(2 ml) 50个 100个 200个 说明书 1份 1份 1份 储存条件： 本试剂盒在室温(15-25℃)干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于2-8℃。

若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。

单独包装的RNase A 在-20℃可稳定保存1年以上。

加入RNase A 后的溶液1应置于2–8℃保存，可稳定保存半年。

产品简介： 本试剂盒采用碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。

离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附DNA。

本说明书操作步骤适用于从1-5 ml过夜培养的大肠杆菌LB(Luria-Bertani) 培养液中，快速提取多至40 μg纯净的高拷贝质粒DNA。

使用本试剂盒提取的质粒DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译等。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

1． 按1：100的比例向溶液1中加入RNaseA，混匀，置于2–8℃保存。

2． 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液W2中加入无水乙醇。

去内毒素质粒小提试剂盒说明书试剂盒组成50次100次RNase A 100ul 200ul内毒素清除剂20ml 40ml溶液P1 10ml 20ml溶液P2 10ml 20ml溶液P3 10ml 20ml结合液30ml 60ml漂洗液15ml 15ml×2洗脱液10ml 20ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份注：该试剂盒置于室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。

产品简介：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。

离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，同时加入Solarbio公司特制的内毒素清除剂，可最大限度地去除内毒素。

从1-5ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取5-15μg纯净地高拷贝质粒DNA，提取率达85-90％。

使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的试验，以及其它一些常规试验如酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。

操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。

如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3、向离心管中加入200ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。