PH0351 考马斯亮蓝染色液脱色液实验方法

PH0351|考马斯亮蓝染色试剂盒（染色液+脱色液）Commassie Blue Stain KitCatalog No：PH0351Size：☐100mL+500mL Store at RT考马斯亮蓝染色试剂盒(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

使用本试剂盒，采用常规染色脱色方法累计时间达到2-3小时后可以观察到蛋白条带；采用快速染色脱色方法20分钟左右即可观察到蛋白条带。

观察到最清晰的蛋白条带则需染色脱色更长时间。

试剂组分Components Size考马斯亮蓝染色液/Commassie Blue Stain100mL考马斯亮蓝染色脱色液/Commassie Blue Decoloring Solution500mL试剂存储室温保存，一年有效使用说明1.常规染色脱色方法：a.电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。

b.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。

注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。

凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。

凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。

通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。

染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。

c.倒出染色液。

染色液可以回收重复使用至少2-3次。

d.加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。

e.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。

期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。

蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法（实验报告）实验日期：2015年4月28日实验温度：室温实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：***班级：2013级生物技术1班姓名：** 学号：********I. 实验目的1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

II. 实验原理考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。

蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

III. 实验试剂与仪器1.实验试剂(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

(3)正常人血浆。

2.实验器材可见分光光度计，100μL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。

IV. 实验操作步骤1.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂混匀，室温放置5min后即可比色。

以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。

标准曲线绘制数据表012345样1样2标准蛋白μg数020*********A59500.5170.8050.941 1.157 1.192 1.465 1.4402.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。

考马斯亮蓝染色总结考马斯亮蓝染色是一种广泛应用于生物学实验中的染色技术，它可以用于检测许多不同的分子和细胞类型。

这种染色方法是法国生物学家Louis-Charles Malassez于1867年发明的，后由德国生物学家Richard Kuhn于1933年进行改良，使其成为现代生物学实验的标准技术之一。

本文将对考马斯亮蓝染色的方法、应用以及优缺点进行总结。

一、方法考马斯亮蓝染色的原理是，亮蓝染料可以与DNA的碱基对结合而形成复合物。

这种染色技术需要一些基本试剂，包括亮蓝染料、甲醛、醋酸以及石蜡等。

具体操作步骤如下：1. 取需要染色的细胞或组织样本，用生理盐水进行清洗；2. 将样本固定在载玻片上，用甲醛和醋酸进行固定处理；3. 将载玻片在70％乙醇和95％乙醇中依次浸泡，以去除固定剂；4. 在50％和75％醇溶液中浸泡数分钟，使样本逐渐变暗；5. 用亮蓝染料染色，通常需要在100倍和400倍低倍镜下观察。

二、应用考马斯亮蓝染色可以用于检测DNA、RNA、核蛋白和细胞质等细胞成分。

在分子生物学实验中，考马斯亮蓝染色被广泛应用于检测DNA条带的大小、纯度和含量。

此外，它还可以用于细胞形态和结构的观察，如观察细胞核、染色质和核仁等。

在医学领域中，考马斯亮蓝染色可以用于检测肿瘤、癌细胞、炎症细胞和血液样本等。

从组织样本中提取DNA或RNA 时，也会使用该染色技术。

三、优缺点优点：1.对许多不同类型的细胞和分子具有高度灵敏度和特异性。

2.操作简便，仅需要一些基本试剂和设备。

3.观察结果清晰，可以展示细胞组织的形态和结构。

4.染色技术稳定性好，结果可复制性高。

缺点：1.过程中可能会使样本遭到破坏或溶解。

2.亮蓝染料可能与背景杂质结合，导致结果不准确。

3.需要专业人员进行染色和观察，较为复杂。

4.染色后，样品无法再进行分子生物学的使用，比如PCR 反应等。

结语：考马斯亮蓝染色是一种简便、灵敏并且重要的分子生物学实验技术。

蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。

此反应重复性好，精确度高，线性关系好。

标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。

强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。

Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。

PH0357|考马斯亮蓝快速染色液（Commassie Blue Fast Staining Solution）Catalog No：PH0357Size：☐500mL Store at4℃◆简介考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液是一种即用型快速灵敏而且安全的染液，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE 或者非变性电泳蛋白凝胶的快速染色，染色时间短，半小时内即可检测到蛋白电泳条带。

◆保存4℃保存，有效期12个月◆使用参考工作液的配制，取100ml溶液B，加入2ml溶液A，混匀，此为工作液。

此工作液配好后请在一周内使用完，过期效果会有一定的影响。

1.将电泳后的PAGE胶（以8cm×10cm大小为例）取下放入容器中，加入50ml双蒸水或去离子水，加热至沸腾后停止，（可选：继续在脱色摇床上摇动5分钟），弃去水溶液。

2.加入25ml快速染色工作液，加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，弃去染色液（此时蛋白条带应已可见）。

3.加入约50ml水，加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，换水即可完成脱色，观察结果。

◆注意事项1.染色前的清洗步骤（第一步）中，水的质量非常重要，质量越好灵敏度越高，研究证明若用自来水加热清洗，染色效果与灵敏度仅与常规甲醇考马斯亮蓝染色（分子克隆第二版）相同。

2.脱色时可用自来水清洗。

3.若要得到无背景的染色胶，可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜。

4.经本染色液染色的PAGE胶，胶的缩涨度小于5%，染色后的胶可在水中放置数月而无明显脱色。

5.每次加热后，继续在脱色摇床上摇动5分钟，可增强染色效果。

6.本染色液有轻微腐蚀性，请带手套操作。

一、Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。

未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

二、Native-PAGE实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性SDS-PAGE电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。

一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。

分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。

酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。

2.1工作液配制30%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；4×分离胶Buff (1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80m水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100mL，4℃贮存；4×堆积胶Buff (0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80mL水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100mL，4℃贮存；10×电泳Buff (pH8.8 Tris-Gly):30.3 g Trisbase，144 g 甘氨酸，加水定容到1L，4℃贮存；2×溴酚蓝上样Buff：1.25mL pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0mL甘油+0.2mL0.5% 溴酚蓝+5.5ml ddH2O；-20℃贮存；10％APs；称取10g过硫酸铵，用水溶解后，稀释至100mL;0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450mL，冰醋酸100mL, ddH2O 450mL；考马斯亮蓝脱色液: 100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL ddH2O；2.2电泳胶的配制及电泳条件表12.3电泳10×电泳Buff（pH8.8 Tris-Gly）:100mL稀释到1L条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。

考马斯亮蓝染色液(常规法)产品简介：本考马斯亮蓝染色液(Commassie Blue Staining Solution)是以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE 等蛋白电泳胶的常规染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

本染色液可以和碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)配套使用。

使用本染色液进行染色，采用常规染色方法需至少1小时可以完成染色；采用快速染色方法数分钟即可完成染色。

本染色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。

保存条件：室温保存，至少一年有效。

注意事项：需自备脱色液。

脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)。

可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。

本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：1. 常规染色脱色方法：a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。

b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。

注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。

凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。

凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。

通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。

染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。

c.倒出染色液。

染色液可以回收重复使用至少2-3次。

d.加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。

注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。

也可以使用其它适当的脱色液。

e.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。

期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。