考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)

测量蛋⽩质三种⽅法测定原理测定蛋⽩质含量的三种⽅法原理院系：xxx专业：xxx姓名：xxx学号：xxx测量蛋⽩质三种⽅法测定原理【摘要】了解测量蛋⽩质三种测定⽅法的基本原理和优缺点。

三种⽅法为考马斯亮蓝法（Bradford法），Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

【关键词】蛋⽩质含量测定考马斯亮蓝法 Folin－酚试剂法紫外吸收法蛋⽩质含量测定法，是⽣物化学研究中最常⽤、最基本的分析⽅法之⼀⽬前常⽤的有两种古⽼的经典⽅法，即Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

另外还有⼀种近⼗年才普遍使⽤起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。

其中Bradford法和Lowry法灵敏度最⾼，⽐紫外吸收法灵敏10～20倍。

每种测定法都不是完美⽆缺的，都有其优缺点。

在选择⽅法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋⽩质的性质；③溶液中存在的⼲扰物质；④测定所要花费的时间。

简单列表为：考马斯亮蓝法双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋⽩质溶液测定的⽅法。

1976年由Bradford建⽴的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计的。

这种蛋⽩质测定法具有超过其他⼏种⽅法的突出优点，因⽽正在得到⼴泛的应⽤。

这⼀⽅法是⽬前灵敏度最⾼的蛋⽩质测定法。

它是⼀种蛋⽩定量法（⼀）实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是⼀种甲基取代的三苯基甲烷，分⼦中磺酸基的蓝⾊染料，在465nm处有最⼤吸收值。

考马斯亮蓝G-250能与蛋⽩质通过范得华相互作⽤形成蛋⽩质—考马斯亮蓝复合物蓝⾊溶液，引起该染料的最⼤吸收λmax的位置发⽣红移，在595nm处有最⼤吸收值。

由于蛋⽩质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远⾼于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可⼤⼤地提⾼蛋⽩质的测定灵敏度。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。

如核糖核酸酶或溶菌酶。

去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。

如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。

如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。

通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。

染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。

注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。

注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。

待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。

适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。

当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。

在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。

通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。

二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。

在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。

三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。

(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。

(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。

五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。

每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。

根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。

根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

计算出回归方程。

如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。

每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。

[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。

实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。

2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。

染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。

蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。

染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。

由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。

2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。

【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。

2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。

试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。

3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。

以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。

以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。

4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。