孚尔根染色

孚尔根染色法DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。

1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。

孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

实验原理：细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。

水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。

这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。

水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。

在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。

随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。

最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。

希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。

与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。

二、实验目的：观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。

三、实验材料：上次实验制成了石蜡切片。

四、实验准备：1．用具立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。

2．玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。

盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。

染色缸上要贴上标签。

实验二孚尔根染色法一、实验原理染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。

细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。

二、实验目的学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。

三、实验材料、用具及药品1．材料：洋葱或大蒜的根尖2．用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、3．药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45％醋酸等。

四、实验步骤1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。

固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。

2.水解试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。

然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。

试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。

以下各步骤两试管相同。

（水解是本实验成败的关键之一。

重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。

如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。

DNA的细胞化学——Feulgen反应核酸是细胞中的重要组分，主要包括DNA和RNA。

DNA是遗传信息的载体，主要存在于细胞核中；RNA传递DNA的遗传信息，指导细胞合成各种蛋白质。

核酸的细胞化学研究已有近一个世纪的历史，1924年Feulgen和Rossenbeck于1924年创立显示DNA的特异性反应，1940年Brachet发明了甲基绿一派洛宁染色方法用以区别细胞中的DNA和RNA。

这些经典方法目前仍被广泛应用，并得到不断改进和发展。

研究细胞中核酸的含量及其动态变化，对于理解生长、发育、分化及凋亡等生物学基本问题具有重要的价值。

孚尔根反应(Feulgen reaction)是特异性显示DNA的最经典方法，得到了非常广泛的应用。

其原理是DNA经过稀盐酸水解后的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，脱氧核糖的C 端形成游离的醛基。

游离的醛基再同Schiff试剂的无色品红反应形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈现紫红色阳性反应。

甲基绿和派洛宁是2种碱性染色料，二者分别属于三芳基甲烷和氧杂蒽衍生物，与酸性的核酸具有亲和力，可以形成盐键而呈现出特殊的颜色反应。

在pH4.6时甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。

甲基绿分子具有2个正电荷，与聚合程度高的DNA具有较强的亲和力，与DNA双螺旋外侧的磷酸根基团结合从而阻止派洛宁从碱基之间插入，甲基绿与DNA的结合产物呈绿色；派洛宁只有1个正电荷，与低聚分子RNA具有较强的亲和力，中和RNA的磷酸基团，阻止甲基绿染色，派洛宁与RNA的结合物呈红色。

根据颜色的部位可以判断DNA和RNA的定位并且判断两种核酸的相对含量。

这一反应对pH敏感，脱水过程、染料的纯度和染料的结合力都影响到染色效果。

【实验目的】学习DNA的Feulgen染色方法，并了解Feulgen反应原理及其DNA在细胞中的分布。

掌握甲基绿-派洛宁法（methyl green-pyronin method）并了解DNA和RNA在细胞中的分布。

期末实验孚尔根染色法和植物染色体标本的制备207.12.1 6.结果与分析6.1结果（1）孚尔根染色结果图1.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果（10×10倍）图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果（10×40倍）①结果描述：在光学显微镜下，洋葱根尖细胞被均匀地压成了单层细胞，细胞分布较为均匀，变形细胞较少。

DNA成功被染上紫色，染色较深，视野背景为白色无红色颗粒较为清晰，视野中无气泡。

处于分裂时期的细胞约占10％，分裂期的细胞染色体染色较深，而分裂间期的染色较浅，中间有1-3个白斑为核仁。

②结果评价：较成功③结果分析：在物镜10倍观察下可以清晰反映出压片的结果与染色的情况。

在压片前要注意用亚硫酸水把染液冲洗干净，防止背景一片红，不利于观察，压片时先把根尖捣碎，防止细胞堆积；在压片时要固定好盖玻片防止盖玻片与载玻片之间发生摩擦，防止细胞变形，同时也要注意力度的把握和敲击的方向，垂直敲打，且从中间到边缘。

染色的时间要足够长，这是我实验时制作的第二张装片，染色时间为18min,第一张为10min，染色较浅，不利于观察。

视野中，由于分裂期的染色质高度螺旋为染色体，DNA浓度较高，所以分裂期的染色体染色较深，而分裂间期的细胞，DNA分裂较为均匀，所以染色较为均匀且相对浅，中间的白斑为核仁，因为核仁中主要为rRNA，所以不被染成紫色。

A B C DE F G HI J K LM N O P图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色有丝分裂过程（10×40倍）①结果描述：A间期:DNA均匀分部于细胞核中，核仁明显，为透明发亮圆形，可见1—3个。

B-E前期：细胞核膨大，染色质缩短变粗，晚前期（D、E）核仁、核膜消失。

F-G中期：染色体缩短变粗，形成姐妹染色单体，整齐排列与赤道板上。

H-L后期：着丝粒分裂，姐妹染色单体分离，分别移向细胞两极。

M-P末期：染色体解旋为染色质，核仁核膜重新出现，细胞中间形成细胞板。

课程名称：细胞生物学指导老师：成绩：__________________实验名称：孚尔根染色同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的1.以Feulgen染色法为例学习细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法；2.观察DNA在细胞内的分布。

二、实验原理孚尔根反应分为水解和显色两个步骤。

在水解过程中，细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后，DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的连接打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff氏试剂作用，形成紫红色的三苯甲烷衍生物。

Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。

但是，细胞中除了DNA酸解会产生醛基之外，多糖等物质也会产生醛基，此外细胞中可能还有自由醛基，但多糖的醛基不会再该反应条件下裸露，而且自由醛基可被盐酸消除；此外，细胞中的RNA也不被染色。

目前认为，RNA的N-糖苷键较为稳定，在孚尔根反应的酸解条件下，其嘌呤碱基不会易被脱去。

故只有DNA不完全水解出来的醛基才能与Schiff试剂反应生成紫红色产物；由于线粒体，叶绿体的结构原因，内部的DNA也不被染色。

从而，孚尔根反应时对细胞中核DNA高度专一的一种检测手段。

材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、实验材料与试剂器材：显微镜、盖玻片、染色缸、眼科剪、解剖刀、镊子、水浴锅试剂：Schiff试剂，亚硫酸水溶液，1mol/L HCl，5%三氯醋酸材料：洋葱鳞茎四、实验步骤1.撕取小块洋葱内表皮，放入10mL预热的60°C的1mol/L HCl中温育水解8-10分钟。

实验10孚尔根（Feulgen）反应
一、实验目的
掌握孚尔根（Feulgen）反应的原理和方法，观察了解DNA在细胞内的分布。

二、实验用具
洋葱内表皮，显微镜、染色缸、剪刀、镊子、培养皿等；1M HCl、希夫试剂、亚硫酸水溶液等。

三、原理
孚尔根反应是Feulgen和Rosserbeck于1924年发现的,是鉴定细胞内DNA特殊有效的方法。

其原理一般认为：稀酸（1M HCl,60℃)水解DNA，打开DNA分子上嘌呤碱和脱氧核糖连接的键，从而使脱氧核糖中的醛基释放出来，然后再与希夫试剂（Schiff试剂，无色品红）反应，由于醛基的氧化作用，使之与无色品红结合成紫红色的化合物。

细胞内凡有DNA的地方都呈阳性反应。

四、操作过程
1、将洋葱鳞茎内表皮放在1mol/l的HCl中，加热到60℃水解8-10分钟。

2、蒸馏水水洗3次。

3、入希夫试剂染色30分钟。

4、亚硫酸水溶液洗3次，每次1分钟。

5、水洗5分钟。

6、将鳞茎内表皮放在载玻片上，盖好盖玻片，用吸水纸吸去玻片上多余的溶液，置显微镜下检查，细胞内凡有DNA的地方都呈阳性反应（玫瑰红色）。

五、实验结果
绘图示Feulgen反应的结果即细胞内DNA的分布。

实验十二细胞内DNA 福尔根染色及测定一. 实验原理DNA经盐酸水解，使嘌呤碱基和脱氧核糖之间键打开，使核糖的一端形成自由醛基，SCHIFF 试剂与醛基反应形成紫色化合物，使细胞内的DNA显示出来，固绿着色浅染，用于衬托DNA的颜色.二. 实验方法1. 取小鼠附睾一只，放入5ml小烧杯中，加1-2滴生理盐水，然后剪碎捣碎,再加0.5ml生理盐水，制成悬浊液.2. 用双层200目的过滤布滤到青霉素小瓶中。

3. 制作小鼠精子涂片。

4. 取小鼠肝脏一小片，用双面刀片切新鲜切面,在载波片上制印片(如印章一样轻轻印一下,而不是涂片.否则没有完整的肝细胞,)。

5．吹风机吹干.6. 乙醇固定10min(放入染色缸中).7．自来水漂洗一下。

（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）。

8. 60℃下盐酸水解15min(放入染色缸中)。

9. SCHIFF试剂浸染4-6小时(放入染色缸中)。

10. 自来水漂洗一下。

（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）。

11．固绿快染4秒。

12. 自来水漂洗一下。

（非冲洗，以免冲走粘着的细胞） 13.吹风机吹干.14. 显微镜观察.15．显微数码拍照，比较精子和肝细胞内的DNA含量。

三. 结果观察小鼠精子的活动现象。

画精子和肝细胞福尔根染色的图片。

比较精子和肝细胞内的DNA含量。

1M HClHCl (12mol/L) 4.2mL*6=25.2TDW 50mL*6=300生理盐水（NaCl 0.85%）NaCl 0.85gTDW 100mL1%琼脂，湿盒，乙醚，放棉花大烧杯带塑料盆扣顶脂肪体和睾丸之间小小的是附睾，下面小的是储精囊。

要这两样小鼠睾丸与附睾的提取与位置1.颈椎脱臼处死雄性小鼠2. 用外科剪和镊子剪开皮肤层和肌肉层暴露内脏3. 在腹部的最下端位置可见大量脂肪层，用镊子夹着脂肪层轻轻向小鼠头方向牵引4. 能看一睾丸被牵出，成年小鼠的睾丸大约有一粒黄豆那么大，形状也类似5. 在睾丸下方一点与睾丸相连的位置，能看到附睾，白色，能看到其内有许多曲精小管6. 找到睾丸后附睾后，用小剪刀和镊子轻轻分享脂肪就能得到了。