实验二 孚尔根核染色

孚尔根染色法中Schiff试剂配方的研究一、实验目的1、进一步深入了解孚尔根染色的基本原理2、探究尝试用非传统的方法配置Schiff试剂并观察其染色效果二、实验原理DNA是遗传的物质基础，应用Feulgen反应法显示细胞DNA是常用的组化染色技术，其中Sehitt试剂是染色成败的关键因素。

Sehiit试剂(希夫试剂)，又称品红醛试剂，与醛类反应呈紫红色。

它有多种不同的配制方法，归结起来有经典热配法以及冷配法。

实验室经常采用的热配法，配制过程繁琐，常会因一个步骤的偏差而造成配制失败，实验中尝试改用冷配法，可收到与热配法同样的染色效果。

Schiff试剂的主要成分是碱性品红，属三氨基三苯甲烷类，它由副品红、品红、二号碱性品红组成四。

碱性品红在酸性环境下与亚硫酸盐作用，生成无色品红。

其配制方法有2种：热配法(将碱性品红加热煮沸)是通过热效应来加速分子运动，使染料溶解与脱色；冷配法(室温下采用振荡或搅拌的方法)是通过增加分子间的碰撞，促进染料溶解与脱色。

2种方法的反应机制相同。

三、实验器材实验材料：蚕豆根尖实验器具：显微镜、载玻片、盖玻片、电炉、滤纸、烧杯、纱布、量筒、锥形瓶、标签、刀片、容量瓶实验药品：蒸馏水、卡诺氏液、0.1mol/L的盐酸、碱性品红、盐酸、偏重亚硫酸钠、活性炭。

四、实验方法1.浸种催芽选择无虫、饱满、大小均匀的蚕豆种子50粒放入蒸馏水的烧杯中， 25℃浸泡24h,其中换水1次。

种子吸胀后，在培养皿中铺一层脱脂棉，倒入足量的蒸馏水，将种子置于其中25 ℃培养2至3天，期间随时补充水分，大部分初生根长至1～2cm左右。

2.不同试剂配置1. 热配法（常规法）称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时振荡，继续煮5min（勿使之沸腾），充分溶解。

然后冷却致50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/L HCl，冷却致25℃时，加入0.5g偏重硫酸钠，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h（有时需要2至3天），使其颜色退至淡黄，然后加入0.5g 活性碳，用力振荡一分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。

实验二孚尔根染色法一、实验原理染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。

细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。

二、实验目的学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。

三、实验材料、用具及药品1．材料：洋葱或大蒜的根尖2．用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、3．药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45％醋酸等。

四、实验步骤1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。

固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。

2.水解试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。

然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。

试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。

以下各步骤两试管相同。

（水解是本实验成败的关键之一。

重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。

如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。

富尔根染色原理
富尔根氏核染色法是根据席夫氏(Schiff)试剂进行的反应而建立的。

席夫氏试剂含有碱性复红和亚硫酸，碱性复红与亚硫酸结合后，失去醌式结构而变为无色，当DNA经酸作用后生成的醛化合物与席夫氏试剂结合后，使醌式结构恢复，合成一种带紫红色的碱性复红衍生物。

1富尔根染色的基本原理：
富尔根氏核染色法对DNA具有特异性。

细菌细胞用此法染色后，可在普通光学显微镜下观察到核。

2 富尔根氏染色法主要分两步:
(a)将细菌用1mol/LHCl温和水解，使DNA中的嘌呤碱与戊糖分开，放出戊糖的醛基;
(b)放出的戊糖醛基与席夫氏试剂作用后呈紫红色。

3 富尔根氏染色法操作步骤：
1.取培养8-10小时的酿酒酵母涂片，室温下风干。

2.将涂片置于有2%锇酸的蒸汽瓶口上，用锇酸蒸气固定5分钟，然后放入加热至60℃的Schandiun固定液中10分钟。

3.用水冲洗固定后的标本，然后放在60℃1mol/LHCl中水解8分钟，水洗。

4.用席夫氏试剂作用30-40分钟。

5.由席夫氏试剂中取出放在亚硫酸水溶液中洗5分钟。

6.由亚硫酸水溶液中取出水洗，干燥后，用油镜观察。

中国海洋大学实验报告一、【实验目的】1、熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法。

2、对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识。

3、对组织切片进行染色，并观察组织中的细胞核。

二、【实验原理】Feulgen反应（Feulgen reaction）是显示DNA的最典型的组织化学反应，是学者Feulgen和Rossenbeck在1924年首次发明出来的，简称为Feulgen法。

因对DNA的显示反应具有高度专一性，因此常常被用来显示细胞内DNA的分布情况。

自Feulgen等发明出显示DNA的Feulgen反应方法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已基本取得共识。

其具体反应原理是：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。

Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。

也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

其反应机制如下图所示。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3三、【实验用品】1、材料：香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy's固定液固定的肝脏和精巢切片20片。

2、试剂：（1）schiff氏试剂将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。

在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。

（2）亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。

期末实验孚尔根染色法和植物染色体标本的制备207.12.1 6.结果与分析6.1结果（1）孚尔根染色结果图1.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果（10×10倍）图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果（10×40倍）①结果描述：在光学显微镜下，洋葱根尖细胞被均匀地压成了单层细胞，细胞分布较为均匀，变形细胞较少。

DNA成功被染上紫色，染色较深，视野背景为白色无红色颗粒较为清晰，视野中无气泡。

处于分裂时期的细胞约占10％，分裂期的细胞染色体染色较深，而分裂间期的染色较浅，中间有1-3个白斑为核仁。

②结果评价：较成功③结果分析：在物镜10倍观察下可以清晰反映出压片的结果与染色的情况。

在压片前要注意用亚硫酸水把染液冲洗干净，防止背景一片红，不利于观察，压片时先把根尖捣碎，防止细胞堆积；在压片时要固定好盖玻片防止盖玻片与载玻片之间发生摩擦，防止细胞变形，同时也要注意力度的把握和敲击的方向，垂直敲打，且从中间到边缘。

染色的时间要足够长，这是我实验时制作的第二张装片，染色时间为18min,第一张为10min，染色较浅，不利于观察。

视野中，由于分裂期的染色质高度螺旋为染色体，DNA浓度较高，所以分裂期的染色体染色较深，而分裂间期的细胞，DNA分裂较为均匀，所以染色较为均匀且相对浅，中间的白斑为核仁，因为核仁中主要为rRNA，所以不被染成紫色。

A B C DE F G HI J K LM N O P图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色有丝分裂过程（10×40倍）①结果描述：A间期:DNA均匀分部于细胞核中，核仁明显，为透明发亮圆形，可见1—3个。

B-E前期：细胞核膨大，染色质缩短变粗，晚前期（D、E）核仁、核膜消失。

F-G中期：染色体缩短变粗，形成姐妹染色单体，整齐排列与赤道板上。

H-L后期：着丝粒分裂，姐妹染色单体分离，分别移向细胞两极。

M-P末期：染色体解旋为染色质，核仁核膜重新出现，细胞中间形成细胞板。

课程名称：细胞生物学指导老师：成绩：__________________实验名称：孚尔根染色同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的1.以Feulgen染色法为例学习细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法；2.观察DNA在细胞内的分布。

二、实验原理孚尔根反应分为水解和显色两个步骤。

在水解过程中，细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后，DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的连接打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff氏试剂作用，形成紫红色的三苯甲烷衍生物。

Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。

但是，细胞中除了DNA酸解会产生醛基之外，多糖等物质也会产生醛基，此外细胞中可能还有自由醛基，但多糖的醛基不会再该反应条件下裸露，而且自由醛基可被盐酸消除；此外，细胞中的RNA也不被染色。

目前认为，RNA的N-糖苷键较为稳定，在孚尔根反应的酸解条件下，其嘌呤碱基不会易被脱去。

故只有DNA不完全水解出来的醛基才能与Schiff试剂反应生成紫红色产物；由于线粒体，叶绿体的结构原因，内部的DNA也不被染色。

从而，孚尔根反应时对细胞中核DNA高度专一的一种检测手段。

材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、实验材料与试剂器材：显微镜、盖玻片、染色缸、眼科剪、解剖刀、镊子、水浴锅试剂：Schiff试剂，亚硫酸水溶液，1mol/L HCl，5%三氯醋酸材料：洋葱鳞茎四、实验步骤1.撕取小块洋葱内表皮，放入10mL预热的60°C的1mol/L HCl中温育水解8-10分钟。

课程名称：细胞生物学指导老师：成绩：__________________实验名称：孚尔根染色同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的1.以Feulgen染色法为例学习细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法；2.观察DNA在细胞内的分布。

二、实验原理孚尔根反应分为水解和显色两个步骤。

在水解过程中，细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后，DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的连接打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff氏试剂作用，形成紫红色的三苯甲烷衍生物。

Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。

但是，细胞中除了DNA酸解会产生醛基之外，多糖等物质也会产生醛基，此外细胞中可能还有自由醛基，但多糖的醛基不会再该反应条件下裸露，而且自由醛基可被盐酸消除；此外，细胞中的RNA也不被染色。

目前认为，RNA的N-糖苷键较为稳定，在孚尔根反应的酸解条件下，其嘌呤碱基不会易被脱去。

故只有DNA不完全水解出来的醛基才能与Schiff试剂反应生成紫红色产物；由于线粒体，叶绿体的结构原因，内部的DNA也不被染色。

从而，孚尔根反应时对细胞中核DNA高度专一的一种检测手段。

材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、实验材料与试剂器材：显微镜、盖玻片、染色缸、眼科剪、解剖刀、镊子、水浴锅试剂：Schiff试剂，亚硫酸水溶液，1mol/L HCl，5%三氯醋酸材料：洋葱鳞茎四、实验步骤1.撕取小块洋葱内表皮，放入10mL预热的60°C的1mol/L HCl中温育水解8-10分钟。

实验十二细胞内DNA 福尔根染色及测定一. 实验原理DNA经盐酸水解，使嘌呤碱基和脱氧核糖之间键打开，使核糖的一端形成自由醛基，SCHIFF 试剂与醛基反应形成紫色化合物，使细胞内的DNA显示出来，固绿着色浅染，用于衬托DNA的颜色.二. 实验方法1. 取小鼠附睾一只，放入5ml小烧杯中，加1-2滴生理盐水，然后剪碎捣碎,再加0.5ml生理盐水，制成悬浊液.2. 用双层200目的过滤布滤到青霉素小瓶中。

3. 制作小鼠精子涂片。

4. 取小鼠肝脏一小片，用双面刀片切新鲜切面,在载波片上制印片(如印章一样轻轻印一下,而不是涂片.否则没有完整的肝细胞,)。

5．吹风机吹干.6. 乙醇固定10min(放入染色缸中).7．自来水漂洗一下。

（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）。

8. 60℃下盐酸水解15min(放入染色缸中)。

9. SCHIFF试剂浸染4-6小时(放入染色缸中)。

10. 自来水漂洗一下。

（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）。

11．固绿快染4秒。

12. 自来水漂洗一下。

（非冲洗，以免冲走粘着的细胞） 13.吹风机吹干.14. 显微镜观察.15．显微数码拍照，比较精子和肝细胞内的DNA含量。

三. 结果观察小鼠精子的活动现象。

画精子和肝细胞福尔根染色的图片。

比较精子和肝细胞内的DNA含量。

1M HClHCl (12mol/L) 4.2mL*6=25.2TDW 50mL*6=300生理盐水（NaCl 0.85%）NaCl 0.85gTDW 100mL1%琼脂，湿盒，乙醚，放棉花大烧杯带塑料盆扣顶脂肪体和睾丸之间小小的是附睾，下面小的是储精囊。

要这两样小鼠睾丸与附睾的提取与位置1.颈椎脱臼处死雄性小鼠2. 用外科剪和镊子剪开皮肤层和肌肉层暴露内脏3. 在腹部的最下端位置可见大量脂肪层，用镊子夹着脂肪层轻轻向小鼠头方向牵引4. 能看一睾丸被牵出，成年小鼠的睾丸大约有一粒黄豆那么大，形状也类似5. 在睾丸下方一点与睾丸相连的位置，能看到附睾，白色，能看到其内有许多曲精小管6. 找到睾丸后附睾后，用小剪刀和镊子轻轻分享脂肪就能得到了。

报告成绩实时记录成绩实验二 Feulgen反应显示DNA学生姓名学号班级座位号：同组同学日期： 2014 年 10 月 14 日备注：【Introduction】常用DNA定性和定量分析的方法及原理：（1）Feulgen反应：DNA经酸水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。

（2）甲基绿-派洛宁法：甲基绿-派洛宁为碱性染料，分别与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。

甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。

（3）HE染色：即苏木精-伊红染色法。

苏木精染液为碱性，使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

（4）Giemsa染色：含天青、伊红等，可与DNA上的磷酸基团结合，使染色体呈蓝紫色，而细胞质呈淡蓝色。

（5）免疫荧光技术：将已知的抗原或抗体标记上荧光素，反应后，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的黄绿色或桔红色荧光，从而确定抗原或抗体的定位，测定含量。

（6）显微光度术：利用显微分光光度计对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定。

（7）流式细胞术：在细胞分子水平上对单个细胞或其他生物粒子进行多快速的定量分析，可以高速分析上万个细胞，并能同时测量细胞的物理或化学性质。

【Materials & methods】实验材料：四膜虫培养液（200μl）；Carnoy固定液；Schiff试剂；1mol/L HCl；自来水；亮绿溶液；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；恒温水浴锅两台（60℃），恒温培养箱一台（30℃）。

实验操作：吸取少量四膜虫培养液于载玻片→干燥→用卡诺固定液固定10到20分钟→在盐酸内水浴15分钟左右→用Schiff试剂染色40分钟（要避光、30度恒温）→自来水清洗2次→亮绿溶液复染1到2秒钟→再次水洗→干燥→放在显微镜下观察。

feulgen染色法Feulgen染色法是一种细胞核染色的技术，是由德国生物学家弗朗西斯·费尔根（Robert Feulgen）在1914年发明的。

该技术的主要原理是利用増感反应特异性亲合性使DNA成为已知物质之一的二硫化物发生比较强的发色反应，因而得名 Feulgen 染色法。

Feulgen染色法以弗洛分离作为基础原理，对细胞内的核酸进行染色，并通过显微镜观察、分析和研究细胞发生分裂的相关特征。

该方法能够比较准确的区分细胞核与其他成分，尤其是有机质成分。

因此，Feulgen染色法在细胞学、细胞遗传学、组织学等领域中都有广泛的应用。

下面是 Feulgen 染色法的步骤：1. 细胞固定将要检测的细胞固定于载玻片上， Feulgen 染色法通常使用3.7%的甲醛作为固定液，使DNA在细胞和载玻片上不再发生运动和变化。

2. 酸解样品的酸解可以利用鹰嘴豆素和酸来进行。

这一步旨在剥离细胞的蛋白质并让核酸暴露在表面上，使其改变成醛基结构，以便接下来的染色成分与核酸相互作用。

3. 饱和无水硝酸样品用饱和无水硝酸处理，以去除酸中不必要的离子，同时也可以使其完成DNA的醛基反应。

4. Feulgen 组合液染色细胞样品将在染色溶液中放置2至10分钟，然后被放置于高氯酸中洗涤。

洗后，样品将被去水、除脂和用玻片覆盖。

5. 显微镜下观察使用荧光显微镜观察样品，利用目镜下特殊荧光物质的作用，可以使核酸发亮，显露出来并被直接观察到。

总的来说，Feulgen 染色法是一种快速、准确的核酸染色方法，可用于在细胞组织学、细胞遗传学和生物亚细胞学等领域中快速、准确地检测DNA的含量，为对生命现象的研究提供了有效的工具。