最新基因敲除小鼠的构建_图文.ppt

如何设计条件性基因敲除小鼠模型摘要：小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。

很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。

小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。

很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。

条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。

它们都是位点特异性重组酶系统。

这里以Cre/LoxP系统为例。

比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。

将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。

Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。

该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。

LoxP的方向由中间这8个碱基决定。

这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。

令一个组成部分是Cre重组酶。

它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。

Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。

如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。

跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。

所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。

这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。

这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。

Slug基因敲除小鼠模型的建立陈栋1 焦学龙1 高学军1 王磊2 石宝昌2 崔海宁2（1青岛大学医学院附属医院普外科山东青岛 266003）（2海南医学院附属医院普外科海南海口 517010）放射性肠道损伤是放、化疗治疗腹部及盆部肿瘤病人的常见并发症，肠道干细胞凋亡是导致损伤的主要原因[1-2]。

Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因，具有凋亡抑制作用，可保护细胞免受细胞毒性损伤[3]。

我们前期的研究发现，Slug过表达能保护体外IEC6细胞免于射线损伤[4]，但Slug敲除后能否促进体外、体内肠道干细胞损伤还不明确。

为研究Slug对放射性肠道损伤的作用，本研究首先建立Slug基因敲除小鼠模型，旨在为今后的研究做准备，也为放射性肠道损伤的预防治疗提供新思路。

1. 材料和方法1.1主要材料Slug基因敲除打靶载体由上海南方模式生物研究中心构建，各种限制性内切酶、T4、DNA连接酶、Taq酶及PCR试剂等购自TaKaRa及NEB公司，DNA marker购自晶美生物工程公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司。

细胞培养所需试剂为Invitrogen公司产品。

引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

ES细胞株Tc-1由美国国立卫生研究院的王中向博士惠赠。

C57BL/6J小鼠由南方生物模式研究中心提供。

鼠尾基因组DNA裂解液，PCR相关试剂，Southern印迹相关试剂购自TaKaRa公司。

[α-32P]dATP购自亚辉公司，硝酸纤维素膜购自S&S公司。

1.2 小鼠胚胎的获取与处理引颈处死妊娠14天的雌鼠，75%酒精消毒，打开腹腔、取出有胚胎的子宫。

在PBS中将胚胎从子宫中解剖出来，去除卵黄囊、羊膜和胎盘，将胎鼠在新的PBS中洗两次。

将胚胎的头和内脏去除，用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片。

将胎鼠碎片转移到15 ml离心管，1000 rpm 离心2 min。

将上述处理的胚胎碎片弃上清，加入5 ml 0.25%EDTA-胰酶，37℃处理30 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打，1000 rpm，离心2 min。