细胞化学染色法 PPT课件
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免疫荧光组织(细胞)化学染色方法免疫荧光组织(细胞)化学染色方法:直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全掩盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温肯定时间(参考:30min)。
3、取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按挨次过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。
4、取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度,一般可用"+'表示:(-)无荧光;()极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清晰可见;(++)荧光光明;(+++ --++++)荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上,而各种对比显示为()或(-),即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有肯定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。