中国南方地区马尔尼菲青霉分子流行病学初步研究_赵亮

Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ （Ｎｏｓ．３１０６０００６ ＆ ３１２６００２９），ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｆｕｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ （Ｎｏ．ｇｚｗｋｊ ２０１１－１－０６０），ｔｈｅ Ｓｏｃｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ
马 尔 尼 菲 青 霉 菌 （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ， ＰＭ）主要侵犯免疫受 损 的 人 群，引 起 马 尔 尼 菲 青 霉
１期
赵 亮 等 ：中 国 南 方 地 区 马 尔 尼 菲 青 霉 分 子 流 行 病 学 初 步 研 究
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病 （ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｏｓｉｓ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ，ＰＳＭ）。 该 病 主 要 在 东 南 亚 地 区 流 行 ，如 泰 国 、越 南 、柬 埔 寨 、老 挝 、香 港 等 ，在 流行地区，马尔尼菲 青 霉 菌 病 已 成 为 继 结 核 病 和 隐 球菌性脑膜炎之后 的 第 三 大 机 会 性 感 染，并 已 成 为 东南亚国家 ＨＩＶ 感 染 的 指 征 性 疾 病 。 ［１］ 我 国 以 广 西、广东地区多见，但 近 年 来，两 广 以 外 的 省 份 也 出 现感染病例。为了进一步探索该真菌在不同地区的 分布特点及分子流行病学特点。本文采用了微卫星 基 因 分 型 法 （ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｔｙｐｉｎｇ， ＭＬＭＴ）对贵州 及 广 西、广 东 地 区 的 马 尔 尼 菲 青 霉 菌临床株进行了分型和对比研究。
１ 材 料 与 方 法 １．１ 菌株来源 通过贵州省 贵 阳 市 传 染 病 院 ＨＩＶ 感 染 科 ，广 西 壮 族 自 治 区 龙 潭 医 院 检 验 科 ，广 州 孙 逸 仙医院等从 贵 州 省，广 西 省，广 东 省 各 地 区 病 人 血 液、皮 肤 分 泌 物 中 分 离 马 尔 尼 菲 青 霉 菌 菌 株 共 ５０ 株 ，其 中 贵 州 省 １６ 株 ，广 西 省 ２９ 株 ，广 东 省 ５ 株 。 １．２ 培 养 基 和 试 剂 ＰＤＡ 培 养 基 （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ－ ｔｏｒｉｅｓ），ＣＴＡＢ（四 川 金 山 制 药 公 司 ），ＰＣＲ 试 剂 盒 （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司），Ｔａｑ－ＤＮＡ 多聚酶（上海生工）。 １．３ 菌株分离与形 态 学 鉴 定 将 贵 州 收 集 到 的 标 本及获赠 自 广 西、广 东 的 菌 株 接 种 于 ＰＤＡ 培 养 基 上，３７ ℃培养，划线法分离纯化马尔尼菲青霉菌，挑 取单个菌落传代保存，分 别 于 ２５ ℃ 及 ３７ ℃ 观 察 马 尔尼菲青霉菌的菌丝相及酵母相形态特点。 １．４ ＤＮＡ 提取 将 ５０ 株 马 尔 尼 菲 青 霉 菌 接 种 于 ＰＤＡ 培养基，３７ ℃ 培 养 ７２ｈ，收 集 培 养 物，采 用 玻 璃珠 法 和 ＣＴＡＢ 法［２］ 提 取 马 尔 尼 菲 青 霉 菌 的 ＤＮＡ，吸光度法检测 ＤＮＡ 浓 度，并稀释成 １μｇ／μＬ 冷冻备用。 １．５ ＩＴＳ 检 测 与 鉴 定 以 ＩＴＳ４、ＩＴＳ５ 为 引 物，用 ＰＣＲ 试剂盒在 ２５μＬ 反 应 体 系 中 扩 增，上、下 游 引 物及 ＤＮＡ 各１μＬ，反应条件为预变性９４ ℃ ５ｍｉｎ， 然后变性 ９４ ℃ ３０ｓ、退 火 ５０ ℃３０ｓ、延 伸 ７２ ℃１ ｍｉｎ循环３５ 次，最 后 ７２ ℃ 延 伸 １０ ｍｉｎ，将 产 物 于 １．５％ 琼 脂 糖 中 电 泳 后 在 紫 外 灯 下 观 察 ，并 将 扩 增 产 物进行测序。 １．６ 微 卫 星 基 因 分 型 １．６．１ 引物合成 根据文献［３］，选择具有６个 以 上 二核苷酸重复单位的 微 卫 星 位 点 ＡＬ６８４９２４ （ＰＭ－ ＭＩ），ＡＬ６８６０３５ （ＰＭＭＩＩ），ＡＬ６８４８４７ （ＰＭＭＩ－ ＩＩ），合成引物，每对引 物 上 游 ５’端 用 ６－羧 基 荧 光 素 （ＦＡＭ）标 记 。 １．６．２ 微卫星序列分析 用合成的 ３ 对 引 物 对 ５０
及ＩＴＳ序列进行鉴定，运用多位点微卫星分型法（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｔｙｐｉｎｇ，ＭＬＭＴ）和 ＳＰＳＳ１８．０软件对分离的 马 尔 尼
菲青霉进行基因多态性及其相关性分析。 结 果 贵 州、广 西 和 广 东 共 收 集 鉴 定 马 尔 尼 菲 青 霉 临 床 株 ５０ 株，３ 个 微 卫 星 位 点
阳 ５５０００４； ２．广 西 壮 族 自 治 区 龙 潭 医 院 检 验 科 ，南 宁 ５３７６２４； ３．贵 阳 医 学 院 附 属 医 院 皮 肤 性 病 专 科 ，贵 阳 ５５０００４
Ｇｕｉｚｈｏｕ （Ｎｏ．［２０１１］３０１７），ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｃｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＆ Ｌｉｖｅｌｉｈｏｏｄ Ｐｌａｎ ｏｆ Ｇｕｉｙａｎｇ （Ｎｏ．［２０１１１０３］１６） Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ： Ｋａｎｇ Ｙｉｎｇ－ｑｉａｎ， Ｅｍａｉｌ：ｋａｎｇｙ－ ｉｎｇｑｉａｎ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
国家自然基金地方项目（３１０６０００６及３１２６００２ 号），贵 州 省 卫 生 厅 科 学技术基金项目（ｇｚｗｋｊ２０１１－１－０６０），贵州 省 社 会 发 展 科 技 攻 关 项 目 （黔科合 ＳＹ 字［２０１１］３０１７号），贵阳 市 科 技 局 社 会 发 展 与 民 生 计 划 （筑 科 合 同 ［２０１１１０３］１６ 号 ） 通 讯 作 者 ：康 颖 倩 ，Ｅｍａｉｌ：ｋａｎｇｙｉｎｇｑｉａｎ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ 作者单位：１．贵阳医学院微生物学教研室暨蛋白组学重点实验室 ，贵
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００２－２６９４（２０１４）０１－００３６－０４
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ｉｎ ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ
ＺＨＡＯ Ｌｉａｎｇ１，ＴＡＮＧ Ｘｉｕ－ｗｅｎ２，ＷＡＮＧ Ｍｅｉ－ｚｈｕ１，ＣＡＯ Ｙｕ３，ＭＯＵ Ｌｉ－ｌｉ １， ＪＩＮ Ｆａｎｇ１，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｙｕ－ｒｕ１，ＫＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｑｉａｎ１
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ，５０ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ａｎｄ Ｇｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｎ ５０ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ＰＭＭＩ，ＰＭＭＩＩ ａｎｄ ＰＭ－ ＭＩＩＩ ｐｒｉｍｅｒｓ ｂｙ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｉｚｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｌｌｅｌｅ ｓｉｚｅ，ｔｈｅ ５０ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ （ＭＬＭＴ）ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳＰＳＳ １８．０．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＭＬＭＴ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ－－ＰＭＭＩ，ＰＭＭＩＩ ａｎｄ ＰＭＭＩＩＩ ｌｏｃｉ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ２９，９ａｎｄ ８ａｌ－ ｌｅｌｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｏｆ ４７ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ（ＰＭＭＴ）ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ５０ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｕａｎｇｘｉ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ａｎｄ Ｇｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｋｉｎｄ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．Ｗｅ ｓｐｅｃｕｌａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｓｏｍｅ ｋｉｎｄ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｔ ｐａｒｔ ｏｆ ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ａｒｅａｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ；Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ
性 ，我 国 南 方 地 区 相 邻 省 份 马 尔 尼 菲 青 霉 的 种 群 基 因 结 构 与 地 域 分 布 之 间 存 在 着 一 定 的 相 关 性 。
关 键 词 ：马 尔 尼 菲 青 霉 菌 ；多 位 点 微 卫 星 基 因 分 型 ；分 子 流 行 病 学
中 图 分 类 号 ：Ｒ３
摘 要：目的 分离及鉴定贵州、广西、广东各地临 床 分 离 的 马 尔 尼 菲 青 霉 （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ，ＰＭ），通 过 微 卫 星 基
因多态性分析进行分子流行病学初步研究。方法 从 贵 州、广 西、广 东 地 区 临 床 病 人 标 本 中 分 离 马 尔 尼 菲 青 霉 ，通 过 形 态 学
ＰＭＭＩ、ＰＭＭＩＩ、ＰＭＭＩＩＩ分 别 检 测 到２９、９ 和８ 种 等 位 基 因 ，５０ 株 菌 共 分 为４７ 个 微 卫 星 型 （ＰＭＭＴ）；聚 类 分 析 将 贵 州 及 广 西 、