高产纤溶酶菌株的筛选及鉴定 (1)

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达引言：纤溶酶是一种重要的酶类，能够降解纤维素生物质，具有广泛的应用前景。

筛选和克隆高活性纤溶酶菌株成为研究的重要方向。

本文将探讨一种高活性纤溶酶菌株的筛选方法，并介绍其基因克隆表达的技术。

一、高活性纤溶酶菌株的筛选方法1. 环境样品的收集与处理需要采集有可能存在纤溶酶菌株的环境样品，如土壤、沉积物等。

然后，将样品进行过筛处理，以去除较大颗粒物和杂质，得到较为纯净的菌种样品。

2. 纤溶酶的活性测定利用碳水化合物基质（如CMC）来检测样品中纤溶酶的活性。

将样品与基质混合后，在一定温度下反应一段时间，然后通过添加酚红指示剂来判断样品中是否产生了纤溶酶。

3. 分离纯化菌株通过向含有纤溶酶活性的样品中接种在有选择性培养基上，将含有纤溶酶菌株的单个菌落分离出来。

然后，通过连续传代培养，筛选出纤溶酶活性较高的菌株。

4. 提取基因组DNA采用常规方法，从筛选出的纤溶酶菌株中提取出基因组DNA。

5. 纤溶酶基因的聚合酶链式反应（PCR）扩增根据已知的纤溶酶基因序列，设计特异引物进行PCR扩增，以获得纤溶酶基因的DNA片段。

二、纤溶酶基因的克隆表达1. DNA片段的连接和克隆将纤溶酶基因的PCR产物与适当的载体（如pET、pUC等）进行连接，并转化到大肠杆菌中，形成重组菌株。

2. 重组菌株的筛选与鉴定通过对重组菌株进行抗生素筛选、PCR扩增和限制性酶切等方法，筛选出含有纤溶酶基因的目的菌株，并进行序列分析以确保基因的准确性。

3. 表达载体构建与转化将已验证的含有纤溶酶基因的重组质粒进行扩增放大，并用合适的浓度导入宿主菌株中。

4. 培养与诱导表达将含有重组质粒的宿主菌株进行培养，并在适当的时间和条件下通过添加诱导剂（如IPTG）来诱导基因的表达。

5. 纤溶酶表达产物的纯化与活性鉴定通过离心、层析等技术手段，将纤溶酶表达产物从培养物中分离纯化，并进行活性测定。

结论：通过以上筛选和克隆表达方法，可以得到高活性的纤溶酶菌株，并实现其基因的克隆表达。

纤维素酶高产菌株选育研究进展指导老师：梁智群学生：郭法谋班级: 08级发酵工程学号: 0813303002纤维素酶高产菌株选育研究进展郭法谋（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005）摘要：纤维素酶在经济上的可行性主要是受到纤维素酶成本的限制,因此筛选出产高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源的前提和关键。

本文总结了纤维素酶高产菌选育的国内外研究进展，以及诱变育种、原生质体融合技术育种、纤维素酶基因克隆的国内外研究现状，对今后纤维素酶高产菌的选育研究发展趋势做了全面的分析和综述。

关键词：纤维素酶；诱变育种；原生质体融合；基因克隆Mutation Breeding of Cellulase HighProducing StrainGUO Famou(College of Life Science and Technology Guangxi University Nanning530005 China)Abstract:The cost of the cellulase is the mainly restrictions if it is viability in the economic, Therefore, screening high activity cellulase producing strain is a prerequisite and key resources for development and utilization of cellulose.This paper summarizes the bacteria breeding high-yield cellulase research at home and abroad, as well as mutation breeding, protoplast fusion breeding, gene cloning cellulase research at home and abroad In the current,for future high-yield cellulase Breeding Research and Development has done a comprehensive analysis of trends and synthesis. Keywords:cellulase；breeding; Protoplast fusion; Cloning纤维素酶在饲料、酿造、粮食加工、果汁与蔬菜加工、纺织等各个方面都具有重要的用途。

高产纤溶酶突变株的筛选及发酵条件的优化
单金津;李靖圆;谢和
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2013(041)006
【摘要】为给纤溶酶的开发应用提供理论依据,以解淀粉芽孢杆菌GZJSI-12为出
发菌株,对高产纤溶酶突变株进行了筛选,并优化了发酵条件.结果表明:经紫外线和2.5％硫酸二乙酯复合诱变获得稳定突变株GZJSI-12-1,菌株产酶活力达1
593.591IU/mL,是出发菌的2.22倍.最佳发酵条件为pH(灭菌前)9.5、接种量6％、装液量30mL/250mL.活力回收率为6.30％,纯化倍数为7.90,比活为
6383.06IU/mg.
【总页数】5页(P110-114)
【作者】单金津;李靖圆;谢和
【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵
州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】S154.34
【相关文献】
1.高产纤溶酶霉菌固体发酵工艺条件的优化 [J], 闵伟红;李佳;王影;张锦玉;李玉
2.角质酶产生菌Thermobifida fusca WSH03-11诱变及高产突变株发酵条件优化[J], 张守亮;陈坚;华兆哲;堵国成
3.纤溶酶高产菌株筛选及其液体发酵条件研究 [J], 周伏忠;贾蕴莉;陈国参;谢宝恩;王红云
4.高产纤维素酶突变株的筛选及其产酶条件优化 [J], 邹宗胜;王婧雅;赵运英;毛银;邓禹
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农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪（河南师范大学生命科学学院，河南新乡，453007）【摘 要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一，具有易获得、廉价等优点。

近年来，随着全球经济的迅速发展，能源消耗巨大，地球环境遭到严重破坏；因此，寻找可再生的清洁能源迫在眉睫，所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注，也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。

本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总，展望今后的研究方向。

【关键词】高产纤维素；酶菌；筛选；鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在，但是降解过程生产成本高、环境污染问题，效果不理想。

经大量研究发现，纤维素酶是酶的一种，能够有效降解纤维素。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。

细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。

2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析，从一定地区取样如：土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等；取一定量样品在三角瓶中富集培养；先梯度稀释，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上，37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。

根据菌落形态观察，保存不同种的菌落，利用牙签蘸取菌落，放入离心管进一步富集；之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基，保持对应关系，进行培养；继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标；接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别；最后用16SrDNA 鉴定，通过PCR 电泳比对后送公司进行测序；确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。

目前经大量实验，从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1，发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL；从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp，在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL；从湿润木屑中分离和筛选获得１株高产纤维素酶目的菌株ＬＹＷ－１等。

产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。

常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。

2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。

3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。

二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。

常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。

2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。

3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。

三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。

2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。

3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。

4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。

综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。

通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。

纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶，对生物质的利用具有重要意义。

选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。

以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法：
1. 采用自然筛选法：从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品，通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。

这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。

2. 遗传工程法：通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造，引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。

3. 诱变法：通过化学物质（如EMS、亚硝酸钠等）或辐射（如紫外光、X射线等）处理菌株，诱发基因突变，筛选出纤维素酶高产突变菌株。

4. 基因筛选法：通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制，筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。

5. 代谢工程法：通过改造代谢途径，优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素，提高纤维素酶产量。

以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。

酿酒科技 2021 年第 3 期（总第 321 期）• LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2021 No.3(Tol.321)17DOI ： 10.13746/j.njkj.2021033泸州老窖大曲中高产纤溶酶菌株的分离及鉴定张立强1 ’2’3，冉茂芳1 ，王松涛1 ’2'3，刘光钱|'2，马卓2，任剑波2，沈才洪1 ’2.3,许涛1，2(1.於州品创科技有限公司，四川泸州646000;2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000;3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000)摘要：从泸州老窖大曲中分离纯化得到13株蛋白酶活力较高的微生物，对微生物的菌落形态和细胞形态进行观察，结果表明，这些微生物均为革兰氏阳性芽孢杆菌。

经琼脂糖-纤维蛋白原平板法对 其产纤溶酶活性进行测定，筛选出2株纤溶酶活力较高的菌株：QM 5和Q M 12,纤溶酶活力分别为3711.48 IU/mL ±418.93 IU/mL 和 4270.83 RJ/mL ±563.52 IU/mL 。

对 QM5 和 QM12 进行 VITEK 2 COM- PACT 全自动微生物鉴定、16S rDNA 全序列测定及系统发育树分析，结果表明，菌株QM 5为贝莱斯芽孢杆菌（Sac///i« ve/eze«j/s) ,QM 12为地衣芽抱杆菌（Sac!7/z« //c/iem/ormk)。

芽抱杆菌能够合成多种生理 活性物质■，如活性肽、地衣素和》比嗓类化合物等，在白酒中也有检出，其中地衣素也具有一定的纤溶活 性。

本研究结果有利于揭示白酒的预防动脉粥样硬化等养生保健功能。

关键词：大曲；纤溶酶；分离鉴定；贝莱斯芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌中图分类号:TS261.1; TS261.7文献标识码:A文章编号：100卜9286(2021 )03-0017-08Isolation and Identification of Strains with High Yieldof Fibrinolysin from Daqu of Luzhou LaojiaoZHANG Liqiang1，2,3, RAN Maofang1，2, WANG Songtao12,3, LIU Guangqian 12，MA Zhuo2, REN Jianbo2, SHEN Caihong 12 3 and XU Tao 1,2(1 .Luzhou Pinchuang Technology Co. Ltd” Luzhou，Sichuan 646000; 2丄uzhou Laojiao Co. Ltd.，Luzhou, Sichuan 646000;3. National Engineering Research Center of Solid-state Brewing, Luzhou, Sichuan 646000, China)Abstract : 13 microbial strains with high yield of protease were isolated from Daqu sampled in Luzhou Laojiao Distillery. All of them were identified as gram-positive Bacillus strains via colonial and morphological observation. Agarose-fibrin plate method was em­ployed to evaluate the fibrinolysin-producing ability of the isolated strains, and two strains with high yield of fibrinolysin were ob- tained and labeled as QM5 and QM12, with their fibrinolytic activities being 3711.48 IU/mL 土418.93 IU/mL and 4270.83 IU/mL 土 563.52 IU/mL, respectively. Results of physiological and biochemical tests, 16S rDNA sequencing and phylogenetic tree analysis indi­cated that QM5 was Bacillus velezensis , and QM12 was Bacillus licheniformis . Bacillus strains could synthesize various bioactive sub­stances, including bioactive peptide, lichenysin and pyrazines, which were also detected in Baijiu; lichenysin also exhibited certain fi- brinolytic activity. The results of this study would help to reveal the healthcare function of Baijiu, such as preventing atherosclerosis. Key words : Daqu; fibrinolysin; isolation and identification; Bacillus velezensis \ Bacillus licheniformis血栓疾病是一种由大量纤维蛋白和血小板凝 死、心源性猝死等疾病。

纤维素酶高产菌的筛选和鉴定魏亚琴;邵建宁;麻和平;张文齐;杨勇;刘彩云;赵昊星;慕婷婷【摘要】从兰州榆中县兴隆山国家自然保护区采集土样,先用羧甲基纤维素钠刚果红培养基筛选出79株Hc值较大的产纤维素酶菌株,再经液体发酵复筛测CMC酶活和滤纸酶活.结果表明,经复筛后菌株No-15A的纤维素酶活力最高,羧甲基纤维素酶活1 376.20 U/mL,滤纸酶活497.78 U/mL,其粗酶液分解滤纸快速明显,且该菌株生长速度最快,每日菌落直径增长量为4～5 cm.经形态学初步鉴定菌株No-15A 属青霉.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)005【总页数】4页(P19-21,25)【关键词】纤维素酶;羧甲基纤维素酶活;滤纸酶活;青霉【作者】魏亚琴;邵建宁;麻和平;张文齐;杨勇;刘彩云;赵昊星;慕婷婷【作者单位】甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;兰州大学生命科学学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;南开大学生命科学院,天津,300071;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000【正文语种】中文纤维素是自然界分布最广泛、最丰富、最廉价的多糖物质，是植物细胞壁主要成分［1］，也是地球上年产量最大，具有巨大潜力的可再生天然资源。

据估计，纤维素生成量每年高达1 000多亿t，中国每年农作物秸秆总产量为7亿多t，仅农业生产中形成的农作物残渣，如稻草、玉米秸、麦秸，每年就5亿t之多［2］，目前这些资源大部分通过简单焚烧，在浪费能源的同时也对环境造成污染。

随着石油、煤炭、天然气等不可再生资源日渐耗竭，有效转化，科学利用数量极其庞大的纤维素资源具有广阔的前景［3］。

利用纤维素酶水解纤维素成葡萄糖并进一步发酵转化成燃料乙醇、SCP饲料蛋白和各种平台化合物等，对缓解全球能源危机、饲料资源和化工原料紧张，保护环境等均具有重大意义［4］。