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工业微生物产生菌的分离筛选（四）各种微生物对养分要求和培育条件是不同的,在分别筛选时若在这两个方面加以调整掌握,就能获得更好的分别效果.1. 培育基的养分成分各种微生物对碳源、氮源要求各异,有的对养分还有特别的要求,事先了解被分别微生物的养分要求,从而设计一个合理快速的分别培育基,能够收到事半功倍的效果.放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源.在选择分别放线菌时,通常采纳改良的HV琼脂培育基、土豆-胡萝卜水汁液培育基和淀粉琼脂培育基能取得较好的效果.但不同菌种对养分要求差别很大,如奴卡氏菌在有氧条件下用一般培育基即可分别到,而以色列放线菌则在有CO2存在且有相宜培育基的状况下才能正常生长繁殖.筛选水解酶产生菌时,通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分别,如以淀粉为碳源的培育基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分别培育基,可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培育基,可以鉴别蛋白酶的产生菌.纯种分别时,把以上琼脂平板置于相宜的温度培育肯定的时间,如具有产生水解酶力量的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,依据圈的大小可初步推断酶活力强弱.测定水解圈直径与菌落直径之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供进一步筛选.2. 培育基的pH细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱,霉菌和酵母菌要求偏酸.因此,分别培育基的pH应当调整到被分别微生物要求范围.这不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.例如,分别柠檬酸产生菌的黑曲霉,就是利用调整培育基的酸碱度获得胜利的.其分别方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸 10%～20%配成培育液,调整pH2.0～2.5,以肯定量的培育基和土样匀称混合,用毛细吸管点种在平皿内事先掩盖的无菌滤纸上（2～3层）,于30℃培育,这样可以分别到产生柠檬酸的黑曲霉.分别碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时,可以把培育基调到pH9～11,在此范围内不宜生长的微生物被抑制,这对分别本身起到浓缩作用.大多数水解酶的生长最适pH基本相近,而酶的作用pH未必与产酶pH相同.培育基的pH要结合养分成分和培育条件来考虑.由于微生物在生长繁殖过程中,由于代谢作用会产生酸性或碱性产物,pH发生变化,微生物生长受到抑制.一般培育基中碳氮比（C/N）高者,培育后倾向于酸性,反之则倾向于碱性.无机盐的性质也会影响pH变化,（NH4）2SO4是生理酸性无机氮源,其中NH4+被菌体利用,留下SO42-,培育液变成酸性.而NaNO3是生理碱性氮源,其中NO3-被菌体分解利用后,剩余Na+,使培育液变成碱性.如发酵过程缺氧,则代谢向有机酸合成方向进行,pH下降.为了维持培育基的PH,一般要加磷酸盐,如K2HPO4、KH2PO4,使培育基具有肯定的缓冲力量.假如培育液中的酸碱变化很大,磷酸盐的缓冲容量不足以调整pH变化,则可适当加入碳酸钙,以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类,使培育基的pH能保持在恒定的范围内.此外,在分别霉菌时,加几滴乳酸不仅可以维持肯定酸碱度,而且可以抑制细菌的生长.3. 排解不需要的菌类实行调整pH的方法来抑制非目的微生物的生长,虽然能起到肯定的作用,但并不是对全部的菌类都有效.有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长,而个别的霉菌,也同样可以在中性或偏碱的培育基中生长.为了更有效地抑制非目的微生物的生长,要加入一些专一性的抑制剂.（1）分别细菌时,在培育基中加入浓度为50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生长.（2）分别放线菌时,在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长,还能激活放线菌孢子的萌发.加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制细菌和真菌,而不影响放线菌的生长.（3）分别霉菌和酵母菌时,在培育基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml,可以抑制细菌和放线菌生长.（4）分别根霉和毛霉时,由于这些微生物的菌丝易扩散成片,难以得到纯化的菌落,通常在培育基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝扩散,使菌落长得小而紧密.一般用于分别单一目的微生物的培育基中均含有抑制其他微生物的抑制剂,这些专用的抑制剂在小型试验室配制较麻烦,现已有成品供应,只要直接加入基础培育基即可.如氨苄西林,主要用于分别亲水气单孢菌.4. 掌握培育温度掌握培育温度,也是一种获得目的微生物的有效措施.各类微生物生长温度不同,从大范围来看,可分三大类：一类是高温微生物,最适温度在50～60℃.假如要分别这类菌可将分别培育基置于50～60℃温度下培育,能抑制一些嗜冷、中性微生物生长,可以有效地分别到高温菌类.其次类是中温微生物,它们的最适生长温度是20～40℃,超过50℃,就停止生长.这类微生物最为常见,、数量都占首位.工业发酵微生物绝大多数都属于此类.其中不同类群微生物对温度又有所差别,一般细菌、放线菌最适温度为25～37℃,霉菌和酵母最适温度为20～28℃.第三类为低温微生物,它们的最适温度为15℃或更低.当从样品中分别各种菌类时,分别置于自身最适温度下培育也可大体上抑制另一些微生物的生长.当分别某些特别产物的微生物时,对温度的选择还需考虑某些内在的关系,如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时,由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高,其凝固点越低,即细胞在较低温度下仍能表现出活力,因此在低于正常温度10℃下分别效果最好.。
高产漆酶菌株的筛选及对染料的降解
高产漆酶菌株的筛选是指在自然环境中寻找出能够高效产生漆酶的菌株。
常规的筛选方法包括培养物染色法、营养物变质法、纸板涂片法等。
其中，培养物染色法是最常见的筛选方法，通过将待筛选菌株培养在含有染料的培养基上，观察染色变化来筛选出具有高产漆酶能力的菌株。
营养物变质法则是通过使用染料作为唯一碳源进行培养，筛选出能够利用染料作为唯一碳源并高效降解染料的菌株。
纸板涂片法是通过将待筛选菌株涂片于含有染料的纸板上，观察菌落生长和染料降解情况来筛选高产漆酶菌株。
高产漆酶菌株对染料的降解是指这些菌株能够将染料分子降解为无害的物质或将其转化为可再利用的物质。
漆酶是一种特殊的氧化酶，具有广谱的染料降解能力。
菌株通过产生漆酶来降解染料，漆酶可以在染料分子中引入氧原子，使得染料分子发生氧化反应，降解为低分子化合物。
高产漆酶菌株对染料的降解能力通常会通过测定漆酶活性、测定染料降解率等指标来评估。
降解染料可以有效地减少染料对环境的污染，这对环境保护和可持续发展具有重要意义。
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus）是一种重要的食品、药用真菌，具有制作红曹和红曲色素的能力。
红曲霉色素是一种天然的食品着色剂，被广泛应用于食品加工和制药工业。
而红曲霉也是一种可以用于生物转化生产脂质和多糖等重要化合物的微生物。
红曲霉高产菌株的筛选及固态发酵研究对于提高红曲霉发酵产物的产量和质量具有重要意义。
一、红曲霉高产菌株筛选1. 优良菌株的选择红曲霉菌株的筛选是红曲生物技术研究的关键之一。
目前，常用的筛选方法是通过对菌株的培养条件、生理生化特性以及代谢产物等进行评价，从中选取表现出高产、高效、高稳定性的优良菌株。
在筛选过程中，需要考虑到不同菌株之间的遗传变异、发酵产物的生产能力等因素，综合评价后确定优良菌株。
2. 根据菌株代谢产物进行筛选红曲霉菌株具备多样的代谢产物，包括红曲素、黄酮素、黄酮甾醇和多糖等。
在筛选优良菌株时，可以通过检测这些代谢产物的合成能力，选择产量高、纯度高、质量好的优良菌株。
还可以采用高通量筛选技术，如基因组学、代谢组学和蛋白质组学等方法，加快筛选速度，提高筛选效率，为选取优良菌株提供科学依据。
3. 利用基因工程技术筛选优良菌株利用基因工程技术，可以对红曲霉的代谢途径进行调控和优化，从而提高其生产产物的能力。
通过转录组分析和基因功能鉴定，可以筛选出与产物合成相关的关键基因，并通过基因工程技术对这些基因进行改造、调控，从而提高产物的产量和质量。
二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵的基本原理固态发酵是指微生物在不同有机物基质中进行生长和代谢过程。
相比于液态发酵，固态发酵具有体系复杂、生物多样性丰富、营养物质丰富等优点。
对于红曲霉来说，固态发酵可以有效提高产物的产量和质量，加快生长速度，促进代谢物的生成，增强抗胁迫能力。
2. 固态发酵的工艺优化固态发酵的工艺优化是红曲霉生物技术研究的重中之重。
优化工艺可以从发酵基质的选择、培养基成分、发酵条件等方面入手，通过对各项参数进行调控和优化，提高红曲霉的产物产量和质量。
高效菌筛选方法及策略菌筛选是指在大量细菌中筛选出具有特定性状或有潜力的菌株。
高效菌筛选方法和策略的研发对于开展微生物研究和利用具有重要意义。
以下是一些常用的高效菌筛选方法及策略。
1.快速筛选方法：快速筛选方法主要通过缩短菌筛选的时间，提高筛选效率。
其中一种常用方法是利用荧光标记在特定条件下或对特定物质的响应。
如利用绿色荧光蛋白（GFP）标记菌株，通过荧光筛选可以快速获取目标菌株。
2.抗性筛选方法：抗性筛选方法通过添加特定抗性基因或对抗特定抗生素，来获得对这些抗生素具有耐受性的菌株。
这样一来，对抗生素的敏感菌株可以被消除，而具有抗性的菌株则可以快速筛选出来。
3.变异筛选方法：变异筛选方法通过利用菌落的形态、色素等可变性特征，筛选出变异菌株。
可以通过菌落形态观察、涂片染色、荧光筛选等方法，快速获得形态或性状变异的菌株。
4.高通量筛选方法：高通量筛选方法利用自动化设备，如微孔板阵列、高通量测序仪等，对大量菌株进行快速筛选。
这种方法主要应用于菌株库的筛选或特定代谢产物高效筛选等方面。
5.代谢产物筛选方法：这种方法通过检测菌株代谢产物的产量或特性，筛选出具有特定代谢产物的菌株。
可以通过色谱-质谱联用技术、高效液相色谱、质谱成像等手段，对菌株代谢物进行分析和筛选。
6.分子筛选方法：分子筛选方法利用特定的分子探针或探测基因，在菌株中筛选具有特定基因或特定基因表达的菌株。
可以通过PCR、南方印迹等技术，对菌株的基因组或转录组进行筛选。
综合利用上述方法和策略，可以实现高效菌株的筛选。
同时，还可以采用多因素组合的策略，如结合菌株形态、生长能力、产物产量和基因组信息等进行筛选。
高效菌筛选方法和策略的研发有助于加快菌株研究和开发，提高微生物资源的利用效率。
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌是一类常见于自然界中的微生物，主要分布于果酱、蜂蜜、果汁等酸性环境中。
醋酸菌能够利用酒精和氧气生成乙酸作为能量源，在食品加工、饮料发酵以及环境保护中具有重要的应用价值。
为了获得高效的醋酸菌菌种，需要进行菌种的分离筛选。
以下是醋酸菌菌种分离筛选方法的一般步骤：1.样品的收集与处理：从酸性环境中收集样品，如水果糖浆、果酱、蜂蜜等。
样品应保持新鲜，并避免污染。
如果样品是固体的，可以通过混合样品和生理盐水来制备悬浮液。
2.菌落计数：将悬浮液经过适当稀释，并均匀分布在含有固体培养基的琼脂平板上。
用细菌计数板或细胞计数器对菌落进行计数。
选取外形典型的菌落进行进一步的分离。
3.菌种分离：根据菌落形态、色素沉积、生理特性等进行分离。
选取外形典型的菌落，利用无菌环针在无菌琼脂平板上进行涂布。
4.筛选培养基的选择：醋酸菌是革兰氏阴性菌，最适生长温度一般在30-35°C范围内。
常用的筛选培养基包括葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂（GAC）和醋酸葡萄糖琼脂（GAA）。
也可以根据菌种特性选择适宜的培养基进行筛选。
5.培养条件控制：将分离出的菌种接种在含有适宜营养物质的筛选培养基上，并控制培养条件。
包括温度、pH值、搅拌速度等。
优化培养条件可以提高菌种的产量和质量。
6.菌种纯化：逐步单菌分离并培养，目的是获得纯种菌株，确保菌株的纯度和稳定性。
7.菌种特性分析：对分离出的菌种进行鉴定和特性分析，包括形态学观察、生理特性鉴定、生化指标检测和分子生物学方法确定其种属和亲缘关系等。
总结：醋酸菌菌种的分离筛选是一个多步骤的过程，需要进行样品收集、菌落计数、菌种分离、筛选培养基的选择、培养条件控制、菌种纯化以及菌种的特性分析。
通过这些步骤的实施，可以获得高效的醋酸菌菌种，为醋酸菌的应用提供有力的支持。
工业菌株的筛选及其应用随着生物技术的发展，微生物在工业领域的应用日益广泛。
而对于工业菌株的筛选，早已成为了微生物学研究的重要领域。
工业菌株的筛选能够为生产提供高效率和低成本的微生物资源，因此备受工业界的关注。
本文旨在探讨工业菌株的筛选以及它们在工业领域的应用。
一、工业菌株的筛选1. 抗生素生产菌株的筛选抗生素是细菌产生的代谢产物，而这些产物的生产是受许多环境因素的影响。
因此，对于抗生素生产菌株的筛选可以通过组织微生物菌株库或样品筛选出合适的菌株进行研究。
而深入探索抗生素生产菌株的代谢途径，则可通过遗传学和分子生物学的手段来实现。
2. 酶类生产菌株的筛选相信大家都做过菌落PCR，相较于传统需分离纯化工艺进行酶活度测定，菌落PCR可以更快速、可靠地测定酶类的活性。
因此采用菌落PCR在筛选酶生产菌株上具有极高的效率。
同时，借助现代生物技术手段可更深入了解菌株中产酶相关基因的分布情况以及途径，有助于优化交叉反应影响生产效率的酶类工业制程。
3. 代谢物生产菌株的筛选微生物代谢途径的不同，可能导致产生不同的代谢产物。
在代谢物生产菌株的筛选中，可以通过利用高通量筛选、基因电转化、表达筛选等多种方法来筛选出最佳的代谢物生产菌株。
这些菌株在医药、健康食品等领域中有着广泛的应用。
二、工业菌株的应用1. 医药工业微生物的发展极大地推动了医药领域的进展。
许多药物，包括抗生素、酵素药、胰岛素、肝素等均是通过微生物发酵得到的。
同时，利用误差拼接和遗传修饰等技术对微生物进行改造，还可开发出新型抗生素等药物。
2. 能源工业微生物在生物燃料和生物氢领域中有着广泛的应用。
利用微生物代谢子或藻类光合作用，可将光能转化为生物质或能量。
通过利用微生物这一天然的能源转化系统，可以实现包括生物柴油、生物气体等在内的多种生物燃料的制备。
3. 食品微生物在食品加工、保鲜等方面也有着广泛的应用。
如利用酵母菌发酵食材，可以制备出各种口感独特、品质稳定的面包、酸奶等食品。
・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2015, 31(3):127-134近年来，丁二酸应用的领域不断拓展，国际市场的需求量也迅猛增加［1］。
工业上生产丁二酸的方法主要为化学方法，常见的化学合成的方法有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯的氰化水解法、加氢法等，生产工艺相对成熟［2，3］。
但化学法生产丁二酸的价格较高，且会消耗大量石油等不可再生资源，不利于资源的可持续发展，同时在生产过程中还会造成环境的污染［4，5］。
微生物发酵法制备丁二酸具备诸多优势，如由于菌种特性及微生物酶的专一性，丁二酸纯度高且产品易分离；生物法生产丁二酸工艺与传统化学法相比，生产过程简化且成本低、生产条件温和且耗能小、生产工艺安全且对环境友好，因此生物法生产丁二酸已成为目前诸多学者研究的热点［6］。
丁二酸的生物法生产主要有两种方式，葡萄糖经糖酵解转化为磷酸烯醇式丙酮酸后，一方面继续以三羧酸循环顺式的方式（丙酮酸→乙酰-CoA →柠檬酸→丁二酸）生成丁二酸，另一方面以三羧酸循环反式途径（苹果酸→延胡索酸→丁二酸）生成丁二酸［7，8］。
其中，丁二酸代谢产生还需要受到CO 2、丙酮酸羧化酶、柠檬酸合成酶等条件的调节［9，10］。
目前，能够产丁二酸的菌种主要有黑曲霉、谷氨酸棒状杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌和重组大肠杆菌等［11］。
研究发现，放线杆菌l30Z 菌株和它的变异株具有1-8 g/L 氟乙酸盐的耐受力，可以生产大量的丁二酸［12］。
产琥珀酸放线杆菌ATCC55618也是国内丁收稿日期：2014-08-04基金项目：国家自然科学基金项目（21306040）作者简介：王乐，男，博士，讲师，研究方向：微生物学，发酵工程；E -mail ：wanglely1984@ 通讯作者：惠明，男，博士，教授，研究方向：发酵工程；E -mail ：huiming69@一株丁二酸高产菌株的筛选与选育王乐 宇光海 杨硕晔 王为为 惠明（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）摘 要： 旨在提高丁二酸发酵生产水平，通过初筛、复筛从土壤中分离得到了高产丁二酸菌株，发酵结束后利用高效液相色谱法检测丁二酸的产率为34.45%。
⾼产细菌素乳酸菌的筛选（⽅案）项⽬⼀⾼产细菌素乳酸菌的筛选⼀、概述1、乳酸菌乳酸菌是⼀群形态、代谢性能和⽣理学特征不完全相同的⾰兰⽒阳性菌( G+) 的统称，在发酵碳⽔化合物时其代谢产物主要为乳酸。
乳酸菌形态多样，通常不运动，乳酸菌微好氧，在固体培养基上培养时，采⽤厌氧或低氧压可增加其在表⾯的⽣长物，乳酸菌的⽣长温度在20~53℃，最适温度是30~40℃，耐酸，最适pH 通常是5.5~6.2，⼀般pH在5.0 或更低情况下可以⽣长，在碱性或中性条件其⽣长速率降低。
2、细菌素细菌素是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成产⽣的⼀类具有抑菌活性的蛋⽩质或多肽，主要对同源和近缘的细菌有抑制作⽤，在产⽣细菌素的同时还会产⽣免疫蛋⽩，从⽽避免细菌素对⾃⾝细胞的杀伤作⽤。
乳酸菌素是乳酸菌在代谢过程中，合成并分泌到环境中的⼀类对⾰兰⽒阳性菌，尤其是亲缘较近的细菌具有抑菌作⽤的杀菌蛋⽩或多肽乳酸菌素( Nisin) 是乳酸球菌代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作⽤的物质。
作为乳酸菌细菌素，许多证据表明，Nisin对细胞主要作⽤在细胞质膜，⽽对细菌的杀菌作⽤是由于在菌膜上形成空洞，使膜的通透性增⼤。
⼆、实验⽬的1.熟练掌握培养基的接种，抑菌试验。
2.掌握培养基的配制原则与⽅法。
3.了解⽜津杯法，并能规范操作相关步骤。
三、实验内容1.材料与试剂泡菜⼤肠杆菌、⾦黄⾊葡萄球菌1mol/L NaOH、和HCl溶液、pH试纸、⽊⽠蛋⽩酶、双氧⽔2．培养基①MRS培养基: 蛋⽩胨10g、⽜⾁膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢⼆铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、⼄酸钠5g、磷酸氢⼆钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18g、蒸馏⽔1000mL,②⽜⾁膏蛋⽩胨固体培养基：⽜⾁膏3.00g、蛋⽩胨5.00g、NaCl3.00g、蒸馏⽔1000ml、琼脂粉8.00g、115℃灭菌20min。
③⽯蕊⽜奶培养基：⽜奶培养基(⽜奶培养基的制备取脱脂奶粉，制成10%的溶液) ，每100ml中加⼊2.50ml⽯蕊⼄醇溶液( 取⽯蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加⼊40%⼄醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，再加⼊40%⼄醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，与第1次倒出液合并，再以40%⼄醇加⾄全量为300ml，滴加1mol/L 盐酸，随加随振摇，⾄溶液变紫⾊为⽌,pH6.0~8.0，混匀，取5~10ml分装于试管中，115℃灭菌20min。
实习报告题目：生物腐殖酸高产菌株的筛选姓名：黄兆峰学号：080500130学院：生物科学与工程学院专业：微生物工程年级：2005生物腐植酸高产菌株的筛选摘要：腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中，目前已在工农业、医学与环境保护等方面发挥着重要的作用。
福建省诏安县绿洲生化有限公司自主研制的生物腐植酸，富含多种有益微生物，已在水产养殖、水质改良、发酵泥炭生产高养分绿色环保肥料等方面取得了良好的社会经济效益。
但由于生产仍是土法建堆的模式，并未筛选功能明确的发酵菌种进行发酵，因此存在产酸低、产品质量不稳定等缺陷。
为此，本课题以工厂发酵原料与发酵产品为基质，进行腐植酸高产菌株的分离筛选，测试初筛的单一菌株产腐植酸的能力，并开展了优势单一菌株的复合发酵与扩大发酵研究，结果如下：1）从发酵蔗渣原料与发酵产品中进行菌种分离，经耐45℃高温和降解纤维素试验，共初筛获得12株能在45℃下生长且降解纤维素良好的菌株，其中细菌11株，霉菌1株。
2）将初筛的菌株以模拟工厂发酵生产腐植酸的条件对其产腐植酸能力进行测试。
通过300ml三角瓶发酵,以产腐植酸为指标，测定分离菌株25号菌和A号菌产腐植酸为最优，12#和E号菌次之。
其中25号菌株腐植酸含量增长为6.98%，A号增长6.63%，12号菌增长5.63%， E号增长5.22%。
由于A号菌为霉菌，所以暂不考虑其发酵能力。
故筛选出12号菌，25号菌和E号菌为优势菌株。
关键词：菌种筛选，腐植酸含量，分离纯化第一章前言1.1腐植酸的概述腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中。
近年来，腐植酸类物质的应用越来越广，涵盖了农业、医药、工业等多个领域。
腐植酸在农业上的应用以肥料为主。
一方面，其本身就可以促进作物呼吸和新陈代谢、促进各种酶特别是糖转化酶的活性、促进细胞发育和植物生长、增强植物吸收养分能力等，从而提高作物的产量。
另一方面，腐植酸对化肥和微肥有明显的增效作用，它能与化学肥料复配成有机—无机复合肥，增加肥效，减少化肥被固定和流失，提高化肥的利用率；同时，腐植酸结构单元上含有羧基、羟基、醇羟基、醌基、半醌基、甲氧基、烯醇基、胺基等多种活性功能团，作为一种源广价廉的天然螯合剂，腐植酸与土壤中难溶于水的微量元素等螯合后使得微量元素很容易被作物吸收和运转。
自然界腐植酸广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及煤炭中。
我国是腐植酸资源大国，其资源储量大，分布广，品位好[1，2,3]。
近年来，我国也通过秸杆发酵生产人工合成腐植酸类物质的生化腐植酸[4]。
腐植酸类物质的基本性质和特征决定了它在保持农业生态系统健康中有着重要的应用意义，因而也越来越引起人们的重视[5]。
1.2 腐植酸的形成关于腐植酸形成的微生物学机理在20世纪主要有七种影响着我国学术界。
一是瓦克斯曼提出的木质素----蛋白质复合体学说；二是威廉斯提出的微生物作用学说；三是微生物合成假说；四是植物和微生物细胞自溶假说；五是科诺诺娃学说；六是恩德斯提出的植物残体形成腐植酸的过程和煤化机制；七是我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论,即水解阶段—产酸阶段—合成和聚合阶段。
指出参与厌氧发酵形成腐植酸的微生物不是一个纯菌种,而是由多个微生物生理群联合作用的结果。
在此对我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论进行阐述。
边文骅学者从自然界选取优质活性污泥为菌种，在室内富集培养扩大，优化生产条件，在500mL、5000mL发酵器发酵试验的基础上，扩大为1m3、20m3环流厌氧发酵器的中试生产规模均获得了良好的效果。
从而认识到，腐植酸是有机物质（动、植物残体）在适当的温度、湿度、酸碱度和厌氧条件下，通过功能不同的多种微生物的代谢，形成腐植酸的过程，这一过程大概分为三个阶段。
第一阶段，或称水解阶段，由发酵细菌产生胞外酶水解大分子有机物质如纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶质、脂肪和蛋白质等。
根据他们作用的底物不同，分别称为纤维素分解菌、半纤维素分解菌、木质素分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌和蛋白质分解菌等生理群，在它们的作用下，多糖类物质水解为单糖，蛋白质水解为肽和氨基酸，脂肪水解成甘油和脂肪酸。
第二阶段，或称产酸阶段，进入细胞的各种可溶性物质，在各种胞内酶的作用下进一步分解代谢，生成多重挥发性脂肪酸和醇,如乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲醇、乙醇等，同时出现许多活性基团，如-OH、-COOH等。
第三阶段，或称为合成和聚合阶段，在微生物细胞内合成，菌体死亡后释放出来或在细胞外通过聚合作用生成腐植酸[6]。
1.3 腐植酸分类腐植酸分类因其形成与来源方式而不同。
按照腐植酸的形成方式分为两大类：天然腐植酸和人工腐植酸。
前者包括土壤腐植酸、水体腐植酸和人工腐植酸；后者包括生物发酵腐植酸、化学合成腐植酸和氧化再生腐植酸。
按照腐植酸来源的方式分为三大类：原生腐植酸、再生腐植酸与合成腐植酸。
原生腐植酸是天然物质的化学组成中所固有的腐植酸。
再生腐植酸是指各阶段煤经过自然风化或人工氧化方法生成的腐植酸。
合成腐植酸通常系指用人工方法从非煤类物质所制得的与天然腐植酸相类似的物质[7]。
1.4 腐植酸的提取腐植质是一类广泛存在于自然界的天然高分子有机物。
它具有比表面积大、结构复杂、带有多种活性官能团，能够与许多有机、无机物发生相互作用。
在工农业、医药、环保等领域有广泛的用途。
腐植质的主体是腐植酸与金属离子相结合的盐类，要想得到腐植酸，就必须将其从土壤或溶液中提取出来，但较为困难，腐植质根据其溶解性质可以分为3个级分：富里酸（既溶于酸又溶于碱），腐植酸（只溶于碱而不溶于酸），胡敏素（不溶于酸和碱）。
思路是：先将土壤或溶液中未分解或部分分解的动植物残体分离，然后用不同的溶剂来浸提土壤或溶液，最终得到腐植酸。
腐植酸的提取方法主要有三种：酸抽提法、碱抽提法和微生物溶解法。
酸抽提法首先在原料中加入稀酸混匀，进行蒸汽煮沸并搅拌，后进行过滤或离心，取上清液水洗至pH=5后收集沉淀物即得到腐植酸[8]。
碱抽提法与酸抽提法操作相似，首先加入碱抽提剂（氢氧化钠或碳酸钠），使原料中的腐植酸生成水溶性的腐植酸钠，将其与原料进行分离，将得到的腐植酸钠溶液进行酸化，生成腐植酸析出。
可在碱抽提前进行空气氧化预处理、硝酸氧化预处理或超声波预处理，以提高腐植酸的提取率[9]。
微生物溶解法先将培养基分装，灭菌后接入特定的微生物，生长一段时间后加入一定量的腐植酸灭菌样品，然后置于培养箱或摇床中，使菌、胞外液、培养液与腐植酸接触并发生作用。
待溶解的腐植酸使培养液染成较深的颜色后，测定一定加样天数里腐植酸的转化率。
方法是将培养液与菌和未转化的腐植酸分离，得到溶液用硫酸使转化为腐植酸沉淀下来[10]。
三种方法各有各的优缺点，酸抽提法比较早的操作坊法，简单，易于操作，生产周期短，而且省去碱法使用的碳酸物，因此酸抽提法价格比较低，但是酸抽提剂法后的腐植酸因含杂质太多,使其应用受到限制。
碱抽提法是目前主要使用的方法，操作同样简单，周期短，只是使用得碱抽提剂的价格比较贵。
微生物溶解法是新兴的方法，其反应温和，可清洁转化，产物生物活性高，缺点是反应周期长，产率低，现主要作为实验研究。
1.5 腐植酸的性质1.5.1 溶解性腐植酸能或多或少地溶解在酸、碱、盐、水和一些有机溶剂中，因而可用这些物质作为腐植酸的抽提剂。
这些抽提剂一般分为碱性物质（如KON、NH4OH、Na2CO3、Na4P2O7等）、中性盐（如NaF、Na2C2O3等）、弱酸性物质（如草酸、柠檬酸、苯甲酸等）、有机溶剂（如乙醇、酮类、吡啶等）和混合溶液（NaOH和Na4P2O7混合）五类[11]。
1.5.2 胶体性质腐植酸是一种亲水胶体，低浓度时是真溶液，没有粘度；而在高浓度时则是一种胶体溶液或称分散体系，呈现胶体性质。
当加入酸类或高浓度的盐类物质时可使产生凝聚，一般使用稀盐酸或稀硫酸，保持溶液pH在3～4之间时，此溶液经静止后就能很快析出絮状沉淀[12]。
1.5.3 酸性腐植酸分子结构中有羧基和酚羟基等基团，使其具有弱酸性。
所以腐植酸可以与碳酸盐、醋酸盐等进行定量反应。
腐植酸与其盐类组成的缓冲哦、溶液，可以调节土壤的酸碱度，使农作物在适宜的pH值条件下生长。
1.5.4 离子交换性腐植酸分子上的一些官能团，如羧基-COOH上的H+可以被Na+、K+、NH4+等金属离子置换出来而生成弱酸盐，所以具有较高的离子交换容量。
腐植酸的离子交换容量与pH有关，当pH从4.5提高到8.1时，腐植酸的离子交换容量从1.7mol/g增加到5.9mol/g。
1.5.5 络合性能由于腐植酸含有大量的官能团，可以与一些金属离子（Al3+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Cr3+等）形成络合物或螯合物。
腐植酸结构中参与金属漯河或螯合的官能团一般是羧基和酚羟基，可能还有羰基和胺基。
1.5.6 生理活性腐植酸的生理活性系指腐植酸促进生物体生理活动的能力。
腐植酸的生理活性在植物上表现为刺激植物生长代谢、改善子实质量和增强植物抗逆能力，但与腐植酸的浓度和腐植酸的分子量大小有关系[13]。
1.6 本课题选题依据1）目前为止，我国生物腐植酸行业还处于初级阶段，生物腐植酸发酵厂采用的发酵方法主要是人工堆建发酵法，产量低、产品质量不稳定，某些生产环节（如干燥）仍依赖于自然条件，通过酸碱反应提取腐植酸液，提取率低，而且生产的生化腐植酸农用产品中含有益菌数量较低；2）福建省诏安县绿洲生化有限公司采用枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和自然菌群复合发酵甘蔗渣制取生物腐植酸，不但含量较高，而且产品中保留了大量有益菌，使产品功能更趋丰富。
但目前该公司还处于中试生产规模，现有菌种的蔗渣转化和产酸能力还有待进一步提高，发酵和干燥等生产工艺还有待进一步改进。
3）中国腐植酸工业协会和专家学者多次提倡生物腐植酸行业应规模化、机械化，应以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产。
1.7研究内容与创新点1.7.1 研究内容1）菌种分离以纤维素筛选培养基为基础，从不同蔗渣原料及腐植酸产品中分离筛选耐高温的纤维素降解菌，主要分离纯化细菌和霉菌，并获得单一菌株。
2）菌种初筛以工厂发酵生产腐植酸模式为条件，研究各单一菌株产腐植酸的性能，以活性腐植酸产量为指标，筛选能高效生产腐植酸的菌株。
1.7.2 创新点本课题从现有发酵原料和发酵产品中分离能高效分解蔗渣并转化成活性腐植酸的菌株，并对初筛的菌株进行单一发酵和组合发酵生产腐植酸进行研究，这为后续以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产奠定良好基础。
