兔(Rabbit)卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)-NEWA

一、实验目的1. 探究兔子血清中抗体的产生及其特异性。

2. 分析兔子血清抗体与其他动物血清抗体的交叉反应性。

二、实验原理1. 兔子血清抗体实验基于抗原-抗体特异性结合原理。

将抗原物质注入兔子体内，兔子体内产生针对该抗原的特异性抗体。

2. 将兔子血清抗体与不同动物的血清进行混合，观察沉淀反应，分析抗体特异性及交叉反应性。

三、实验材料1. 实验动物：兔子（体重约2.5kg）2. 实验试剂：抗原（如卵蛋白）、兔抗人血清抗体、人血清、黑猩猩血清、狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清3. 实验器材：注射器、离心机、移液器、培养皿、显微镜等四、实验方法1. 兔子血清抗体制备（1）将抗原（如卵蛋白）注入兔子体内，免疫兔子。

（2）免疫后一周，采集兔子血液，分离血清。

（3）用ELISA法检测兔子血清抗体滴度，确定抗体产生。

2. 抗体特异性及交叉反应性分析（1）将兔子血清抗体与不同动物的血清进行混合，如人血清、黑猩猩血清、狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清。

（2）观察混合液是否产生沉淀反应，分析抗体特异性及交叉反应性。

五、实验结果1. 兔子血清抗体制备（1）免疫后一周，采集兔子血液，分离血清。

（2）ELISA法检测兔子血清抗体滴度，抗体滴度为1:32000。

2. 抗体特异性及交叉反应性分析（1）将兔子血清抗体与人血清混合，产生沉淀反应。

（2）将兔子血清抗体与黑猩猩血清混合，产生轻微沉淀反应。

（3）将兔子血清抗体与狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清混合，未产生沉淀反应。

六、实验讨论1. 兔子血清抗体实验成功制备了针对抗原的特异性抗体，表明兔子体内能够产生针对特定抗原的免疫反应。

2. 兔子血清抗体与人血清产生沉淀反应，表明兔子血清抗体具有特异性，可以识别并结合人血清中的抗原。

3. 兔子血清抗体与黑猩猩血清产生轻微沉淀反应，表明兔子血清抗体具有一定的交叉反应性，但与狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清无交叉反应，说明抗体特异性较高。

抗人T细胞兔免疫球蛋白Kang Ren T Xibao Tu MianyiqiudanbaiAnti-human T Lymphocyte Rabbit Immunoglobulin本品系由人T淋巴细胞免疫家兔后,取其血清或血浆经去除杂抗体、纯化、浓缩后,再经病毒灭活处理并加入适宜稳定剂后冻干制成。

不含防腐剂和抗生素。

1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2 制造2.1 免疫血清2.1.1 免疫抗原免疫用抗原为人胸腺细胞,或符合“血液制品生产用人血浆”中供血浆者标准的健康人血液分离的人淋巴细胞。

胸腺供体为HBsAg、HCV抗体、HIV-1/HIV-2抗体和梅毒血清学检查应为阴性。

分离后T淋巴细胞数应不低于总细胞数的90%,红细胞数应不高于总细胞数的5%。

2.1.2 免疫动物免疫用家兔至少应符合普通级实验动物的要求(附录ⅩⅢ B和附录ⅩⅢ C),体重为2000~2500克,检疫合格者方可使用。

2.1.3 免疫方法按批准的免疫程序免疫。

2.1.4 采血及分离血清加强免疫后,淋巴细胞毒试验效价达1∶400时即可采血。

分离的血清置-20℃以下保存。

保存期不应超过2年。

2.2 原液2.2.1 混合血清经56℃水浴30分钟灭能,辛酸-硫酸铵盐析分离纯化或经批准的其他分离纯化法,杂抗体吸收,再用DEAE-sephadex A-50色谱纯化抗人T细胞兔免疫球蛋白。

杂抗体吸收用的人红细胞、人血小板、人胎盘组织及人血浆的供给者应符合“血液制品生产用人血浆”中供血浆者标准。

2.2.2 原液检定按3.1项进行。

2.3 半成品制备2.3.1 配制加入适量麦芽糖或其他适宜稳定剂。

按成品规格以灭菌注射用水稀释至所需蛋白质浓度,并适当调整pH值及钠离子浓度。

2.3.2 半成品检定按3.2项进行。

2.4 成品制备2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)试剂盒使用方法检测范围：96T0.8μg/ml -24μg/ml使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)水平。

用纯化的小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入OV A-sIgE，再与HRP标记的OVA-sIgE抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的OV A-sIgE呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)浓度。

试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（48μg/ml）0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

24μg/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液12μg/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液6μg/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液3μg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液1.5μg/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

兔子igg 恒定区序列兔子IGG（Immunoglobulin G）是一种恒定区序列，也被称为抗体的IgG亚型。

抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，能够识别和结合到身体中的外来物质，如细菌、病毒和其他病原体，以促进其清除和破坏。

兔子IGG是兔子体内产生的主要抗体类型之一。

它在体内起着至关重要的作用，能够识别和中和病原体，以保护兔子免受感染和疾病的侵害。

兔子IGG的恒定区序列是指其抗体分子中与结构和功能相关的部分。

这个区域的序列在兔子中是固定的，不会发生变化。

兔子IGG的恒定区序列具有多个重要的特征。

首先，它能够与病原体的表面抗原结合，形成抗原-抗体复合物。

这种结合可以通过多种机制来中和病原体，如阻止其进入宿主细胞、激活免疫细胞杀伤病原体或激活补体系统。

其次，兔子IGG的恒定区序列还能够与免疫细胞表面的Fc受体结合，从而激活免疫细胞，增强其杀伤病原体的能力。

兔子IGG的恒定区序列在不同的亚型中有所差异。

目前已经发现了多个兔子IGG亚型，如兔子IGG1、兔子IGG2和兔子IGG3等。

每个亚型都有其特定的结构和功能。

例如，兔子IGG1亚型通常与免疫细胞的FcγR I和FcγRIII受体结合，而兔子IGG2亚型则主要与FcγRII受体结合。

这些不同的亚型在兔子的免疫应答中发挥着不同的作用。

兔子IGG的恒定区序列还可以用于研究和应用。

由于兔子IGG具有高度的特异性和亲和力，它可以用于识别和定量其他物质，如蛋白质、激素和药物。

这种特性使得兔子IGG被广泛应用于科学研究、生物医学和生物技术领域。

例如，兔子IGG可以用于制备特异性抗体，用于检测和诊断疾病。

此外，兔子IGG还可以用于制备免疫球蛋白和抗体药物，用于治疗和预防疾病。

总结来说，兔子IGG的恒定区序列是兔子体内产生的一种重要抗体类型。

它具有多种功能，能够识别和中和病原体，保护兔子免受感染和疾病的侵害。

兔子IGG的恒定区序列还可以应用于科学研究和生物医学领域，用于诊断和治疗疾病。

12020.03·试验研究 | Experimental research0 引言许多研究表明，动物的生化指标检测结果受到动物本身的品系、年龄、性别、营养健康状况、饲养条件以及试验时样品的采集方法、保存方式、使用的检测方法等多种因素影响[1-3]。

目前尚无实验动物血液学、血清生化指标的权威参考值，也很少有试验动物血液学、生化指标检测的专用试剂，通常都是使用检测人的血液生理、生化指标的试剂进行检测[4]。

近年，随着科学技术的不断进步及我国生物医药科学研究逐步走向国际化的趋势，血清生化指标的检测方法和仪器不断更新完善，全自动生化分析仪有操作简单、准确性高、标本用量少、消耗试剂少、测试速度快、省时省力等优点，因此，现在被广泛应用于实验动物血清生化指标的检测。

新西兰兔是生物医学实验研究中最常用的动物之一，原产于美国加利福尼亚州[5]。

因其具有繁殖力强、生长发育迅速、耳朵大血管清晰便于实验、易产生发热反应等优点已被广泛应用于生物医学的教学实验以及心血管病、内分泌、物质代谢、遗传学、药理学等试验研究领域[6]。

但是目前关于普通级新西兰兔的血清生化指标的公布数据少之又少，因此本研究通过测定同一实验中心提供的健康普通级成年新西兰兔的血清生化指标，旨在建立普通级新西兰兔血清生化指标检测方法及其参考区间，为动物实验提供基础数据。

1 材料与方法1.1 试验动物和样本血清健康的普通级成年新西兰兔，雌雄随机，体重2.5～3.0kg ，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK （渝）2017-0008；使用许可证号：SYXK （渝）2018-0003。

成年普通级新西兰兔空腹12～14 h ，静息15 min 以上，由同一人使用一次性静脉采血针，在耳中动脉穿刺，采血2～3 mL 于含促凝剂的负压管中，立即颠倒混匀8～10次，静置30 min 后离心（3 500 r/min ，5 min ），分离出血清于EP 管中待测。

兔血清白蛋白和ＩｇＧ的分离纯化与鉴定目的：以兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定实验为例，阐述了血清蛋白制备与分析的过程。

方法：使用了硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC等分离纯化鉴定蛋白质的方法。

结果：制备了兔血清白蛋白和γ－球蛋白(IgG)，测定被分离物质的相对分子量，鉴定纯化产品的均一性。

结论：该实验作为一门生物综合性大型实验，非常有利于培养学生掌握蛋白质制备与分析的综合技能。

标签：分离纯化；白蛋白；γ－球蛋白；实验血清白蛋白是人体内重要的营养物质，在血液中有重要生理功能，是血液总渗透压的主要调节物质，其浓度可以反映肝脏的功能，其水平的改变能导致一系列的病理性继发症。

血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。

此外，血清白蛋白还有重要的药用价值，注射白蛋白针剂可治疗浮肿等症。

血清球蛋白是血清蛋白质的重要组成部分，能与外来的特异性抗原起免疫反应而保护机体。

检查血清总蛋白及白、球蛋白的比值，即可了解肝脏受损害的程度。

总蛋白下降、白／球蛋白比值减少、电泳试验γ－球蛋白增加，是肝炎的常见情况。

因此，测定血清白蛋白常用于患者状态的非特异监视。

1 材料与方法1．1材料试剂与仪器1．1．1材料兔血清。

1．1．2 试剂饱和(NH4)2SO4溶液、磷酸盐缓冲液(pH6.3)、Sephadex G －25、二乙氨乙基(DEAE)纤维素、三氯醋酸、0.5mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.06mool／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.02tool/L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、SPA-Sepharose－4B、结合缓冲液(pH8.9)、缓冲液I(pH7.0的PBS)、缓冲液I(pH 3.0的PBS)、Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)、柠檬酸溶液(pH3.0)、0.9％NaCI溶液、标准血清白蛋白液、考马斯亮蓝G250等。

小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析试剂盒使用说明书产品编号：E0720m2. 血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

每次检测都应该做标准曲线。

如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。

每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。

5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测豚鼠血清，血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgE(OV AsIgE)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)水平。

用纯化的豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵清蛋白特异性IgE(OV A sIgE)，再与HRP标记的卵清蛋白特异性IgE(OV A sIgE)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgE(OV A sIgE)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

羊抗兔IgG(H+L)，HRP标记产品名称：Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP，羊抗兔IgG(H+L)，HRP标记货号：4050-05规格：1.0 mL特异性：抗体识别兔子的IgG重链和轻链以及兔子IgM轻链。

来源：高效价山羊抗血清交叉作用：小鼠和人免疫球蛋白和混合血清，可能与其他物种免疫球蛋白反应。

纯化：亲和色谱法，兔IgG共价链接在琼脂糖上。

缓冲溶液成分：储存溶液50%甘油，50% PBS, pH 7.4，无添加剂（启维益成有售）。

同型对照：Goat IgG储存温度：2-8°C应用：ELISA 1-3FLISAFlow Cytometry 4-7Immunohistochemistry-Frozen Sections 8-10Immunohistochemistry-Paraffin Sections 6,11-13Immunohistochemistry-Whole Mount 14,15Immunocytochemistry 16-19Immunoblotting 20-28Separation 29参考文献：1. Maroney AC, Finn JP, Connors TJ, Durkin JT, Angeles T, Gessner G, et al. Cep-1347 (KT7515), asemisynthetic inhibitor of the mixed lineage kinase family. J Biol Chem. 2001;276:25302-8.(ELISA)2. Zhang X, He M, Cheng L, Chen Y, Zhou L, Zeng H, et al. Elevated heat shock protein 60 levelsare associated with higher risk of coronary heart disease in Chinese. Circulation.2008;118:2687-93. (ELISA)3. Jin K, Wang S, Zhang C, Xiao Y, Lu S, Huang Z. Protective antibody responses againstClostridium difficile elicited by a DNA vaccine expressing the enzymatic domain of toxin B.Hum Vaccin Immunother. 2013;9:63-73. (ELISA)4. Burger PE, Gupta R, Xiong X, Ontiveros CS, Salm SN, Moscatelli D, et al. 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