多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究

多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究王霄(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：详细介绍了动植物多糖的常见提取纯化方法的最新研究进展，并比较了各种方法的优缺点。

每种方法都有各自的优缺点，在提取时应根据所选材料的性质选用不同的方法，有些方法在一定的条件下可与别的方法协同作用，并对糖的含量测定及分析鉴定方法的研究进展作了概述。

关键词：多糖；提取；纯化；分析鉴定；研究进展中图分类号：TU 411.01文献标识码：AProgress of Polysaccharides Extraction, Purification and Identification MethodsWANG Xiao(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plant polysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each mothed. Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions. In addition, analysis and identification of polysaccharides are outlined.Key words: polysaccharides; extraction; purification; analysis and identification; research progress0多糖概述多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。

由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。

多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。

多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。

多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。

近年来，国际上对糖及糖复合物的研究己成热点，糖类结构测定和生物活性研究取得了明显的进展。

大量实验事实揭示糖类是重要信息分子，参与许多生理和病理过程[1-2]。

到目前为止。

己有300余种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从中草药、食药用菌中提取的水溶性多糖最为重要。

已发现有100多种中草药、食药用菌来源的糖缀合物具有广泛的药理及生物活性[3]。

在对各种中药材化学成分研究的过程中，人们逐步提高了对植物多糖的关注。

植物多糖研究比较深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、银杏叶多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品领域已经取得很好的应用。

多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景[4-7]。

1多糖的提取工艺1.1水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。

多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。

用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5 h，多糖的质量分数和得率均较高。

影响多糖提取率的因素有：提取温度、浸提料液比、提取时间以及提取次数等。

为此，研究者对影响多糖提取工艺的这些因素进行了大量研究。

林娟[8]等研究表明水提法提取甘薯多糖的优化工艺条件为：提取温度85℃，加水比1：7，提取时间2.5h，提取率为26．71％。

刘永[9]等研究表明：最佳提取条件为95℃，料液比1：20(g：mL)，提取时间2h，提取3次，茶叶多糖含量为35.92 mg/g。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。

但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高[10]。

1.2酶法提取酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件下分解植物组织，加速有效成分的释放或提取。

此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等非目的产物。

此法可使后续的浓缩和脱蛋白工艺更简易、省时，粗多糖的纯度更高。

但会提高生产成本，对提取条件要求较高。

杨云[11]等人采用的单酶法和复合酶法提取大枣多糖，单酶法提取多糖含量最高可达44.69％，而复合酶法多糖最高含量可达68.13％。

1.3超声波提取超声法是利用超声波对细胞组织的破碎作用来提高多糖浸出率的，具有快速、安全、简便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破坏等优点，但对提取设备要求较高。

李进伟[12]等通过响应面分析法考察超声波功率、提取时间、提取温度、料液比对枣多糖得率与纯度的影响，得出枣多糖最佳的提取工艺条件为：超声波功率86～96W，提取温度45～53℃，提取时间20min，料液比1:20（g:ml），枣多糖得率7.63%，纯度35.57%。

与传统的水浴浸提法相比，该方法不仅缩短了提取时间，且提高了枣多糖得率与纯度。

1.4 微波提取微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。

赵怡红[13]等研究表明北冬虫夏草多糖微波提取最佳条件：微波功率550W、固液比l：30、提取时间30s、提取1次，多糖收率3.67％。

刘青梅[14]等研究结果表明:对于紫菜多糖提取微波提取优于热水提取,微波冻融提取效果最佳,提取率最高达7.45%,而热水提取率为2.05%.影响微波浸提的主要因素为浸提时间,其次是微波功率和液固质量比。

优选方案为微波功率200W、提取时间8 min、水与紫菜液固质量比40:1。

1.5超临界流体提取超临界流体提取法根据某些气体在超临界状态下具有特殊的液相性质，对一些组分有较好的溶解性，用来提取目的产物。

一般采用CO2超临界萃取多糖组分。

朱俊玲[15]通过超临界CO2流体萃取处理芦荟多糖，多糖得率为85.1％，是传统方法的1.5倍。

超临界萃取的最佳工艺条件是乙醇用量为250 ml/100g芦荟、萃取压力为25 MPa、萃取温度为35℃。

1.6超滤法超滤是一种膜分离技术。

该技术应用于多糖的提取，具有不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点[16]。

1.7酸提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能够得到更高的提取率。

如赵宇等[17]对海蒿子多糖的提取方法研究发现，从多糖提取得率来看，酸提法优于传统的水提法。

不过此方法只在一些特定的植物多糖提取中占优势，目前报道的并不多。

不过在操作上还是应该严格控制酸度，因为在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。

1.8碱提法与酸提法类似，有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。

不过，也应控制碱的浓度，因为有些多糖在碱性较强时也会发生水解。

2多糖纯化方法2.1除蛋白根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）为5∶1 或4∶1，混合物剧烈振摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。

此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失。

但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用Sevage 法效果更佳。

李婉婷[18]研究结果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除去款冬花多糖中的蛋白最为理想，该法的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶的酶底比为l％，pH值7.0，先在50℃水浴中酶解2h，再经Sevage法脱蛋白3次，其蛋白脱除率为88.95％，多糖保留率为92.63％。

2.2透析法透析法是利用一定孔目的膜，使无机盐或小分子糖透过，而将大分子的多糖截留下来从而达到纯化多糖的目的。

此法的关键是要选择孔目合适的透析膜。

纤维膜孔径为2～3nm，可使单糖分子通过，分离效果较好，透析时常需要多次换水，溶液的pH值维持在6.0～6.5范围内。

2.3凝胶柱层析法凝胶柱层析法主要是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的。

但溶液流经多孔性凝胶柱时，小分子已扩散人孔中，各溶质依分子量大小顺序依次流出。

此方法快速、简单、条件温和。

常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sephamse)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂。

此法还可进行多糖相对分子量的测定。

王赫[19]采用Sephadex G-100凝胶色谱柱分离纯化，从龙胆水溶性多糖中分离纯化得到 2 种不同的均一多糖组分TP-1、TP-2。

2.4纤维素住层析法纤维素阴离子交换剂柱层析对多糖的分离是利用pH 6时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，用pH相同离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱出来。

常用的阴离子交换纤维素有DEAE-纤维素和ECTEOLA 纤维素。

张兰杰[20]等就采用DEAE-纤维素柱分离北五味子多糖，分别得到了白色结晶和黄色粉末两种多糖产物。

3多糖的分析3.1含量的测定测定方法：硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe[21]法、薄层色谱法、酶法、原子吸收法[22]、HPLC法、凝胶电泳法、亲和电泳法连、续流动分析法检测法[23]、次亚碘酸盐定量法、蒽酮-硫酸法（总糖）、DNS法[24]（还原法）、磷钼比色法、邻钾苯胺比色法等。

每种方法只对某些多糖的测量效果好。

比色法分光光度法离子交换色谱法酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析。