甲霜灵胶体金试纸条复核报告

分析与检测Oct 2020 CHINA FOOD SAFETY 43甲氨基阿维菌素是从发酵产品阿维菌素B 1开始合成的一种新型高效半合成抗生素杀虫剂，溶于丙酮和甲醇、微溶于水、不溶于己烷。

因其具有超高效、低毒、低残留、无公害等生物农药的特点，故被广泛应用于蔬菜、果树、棉花等农作物中以防治多种害虫。

但是，该药物具有神经毒性和发育毒性，脂溶性强，在动物体内分布广泛且代谢周期长，容易造成药物残留，进而通过食物链危害人体健康。

因此，对食品中的甲氨基阿维菌素残留量进行检测十分必要。

目前，用于检测甲氨基阿维菌素残留量的方法大多为仪器方法，但仪器采购成本高、检测时间长、操作复杂，不符合基层实验室高效、便捷的检测要求。

因此，本文制备出一种甲氨基阿维菌素的单克隆抗体，并将其应用于胶体金免疫层析试纸条，使其能够满足基层实验室的检测需求，有利于丰富监管手段和提高监督水平。

1 材料与方法1.1 材料与仪器甲氨基阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素等标准品（纯度≥95%），购自北京标准物质研究中心；氯金酸（HAuCl 4•3H 2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），购自美国Sigma 公司；柠檬酸三钠、碳酸钾，购自北京百欣试剂公司；样本提取剂、样本复溶液、胶体金分析仪，由北京勤邦生物技术有限公司提供；涡旋仪、均质器，购自湖南湘立科学仪器有限公司。

1.2 试验方法1.2.1 甲氨基阿维菌素半抗原的制备取0.886g 甲氨基阿维菌素，加乙腈70mL 溶解，加0.91g 氨基丙酸的水溶液2mL，充分搅拌后加入37%甲醛0.32mL 与三氯乙酸0.77g，加热，于60℃反应12h，反应停止后加水80mL 与乙酸乙酯100mL，萃取分离，减压蒸干，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯体积比5：1洗脱分离，得到丙酸甲氨基阿维菌素半抗原0.76g，收率为77%。

1.2.2 免疫原的制备——甲氨基阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联物合成一种甲氨基阿维菌素胶体金免疫快速检测试纸条的研制□ 吴广 贾芳芳 冯才伟 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技术有限公司 北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心□ 杨筑稀 贵州民族大学社会学与公共管理学院本文通过制备甲氨基阿维菌素半抗原，研制出一种能够检测蔬菜、水果中甲氨基阿维菌素的胶体金免疫层析试纸条，检测限为5μg/kg，检测时间为15min，假阳性率和假阴性率均为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。

目录一、引言二、验证项目三、验证指标四、验证方法五、结果分析及评价六、验证小组签字七、最终批准一、引言公司厂房、设施和公用系统已经进行了全面的验证，验证报告也已完成。

此次验证有助于寻找某验证产品划线胶板烘干工艺中的烘干时间与最终结果的关系，以保证该工艺在某个时间段内进行烘干能生产出完全符合质量标准的划线胶板。

二、验证目的：检查并确认该烘干工艺下，烘干时间控制在什么范围内能稳定生产出完全符合质量标准的划线胶板。

三、验证指标：对划线胶板生产过程中的不同烘干时间的划线胶板进行验证，验证的项目主要有：灵敏度、均匀性、批内差、批间差、稳定性。

四、验证方法1.划线胶板生产前准备过程的确认目的：通过此项检查，确认划线胶板按工艺规程生产所使用的厂房、设施等其他公用服务系统、物料等是否符合要求。

1.1公用服务系统验证产品：检查项目检查方法标准要求检查结果洁净室（区）的洁净度洁净室（区）洁净度监控管理规程应符合10万级洁净级别洁净区与室外大气的静压差检查压力表显示和记录应≥10Pa洁净室内温湿度检查温湿度计显示和记录温度：应18~26℃相对湿度：应45~65%检查结果：检查人：检查日期：复核人：复核日期：1.2原辅材料验证产品：检查项目检查方法标准要求检查结果抗体检查抗体保存条件及是否在使用期限内抗体按照说明书要求的条件进行保存，且在使用期限内。

缓冲液检查外观、pH值及配制记录溶液澄清透明、无异物，配制记录完整，pH值与记录相符。

检查结果：检查人：检查日期：复核人：复核日期：1.3 操作间及设备（附录1：相关仪器验证报告）验证产品：检查项目检查方法标准要求检查结果操作间清场按相关标准检查应无任何与本次生产无关的物料，门上应有“清场合格证”三维平面点膜喷金仪按相关标准检查符合相关文件说明数显鼓风干燥箱按相关标准检查符合相关文件说明除湿机按相关标准检查符合相关文件说明检查结果：检查人：检查日期：复核人：复核日期：1.4 划线胶板（附录2：贴板记录；附录3：相关生产记录）验证产品：名称型号批号领用量实用量损耗量划线胶板NC膜C线包被溶液T线包被溶液检查结果：操作人：操作日期：检查人：检查日期：1、5配套样品及金标垫等材料（附录4：组装记录）验证品种：名称规格批号领用量实用量损耗量样品垫金标垫吸水纸MAX线PE膜条检查结果：检查人：检查日期：复核人：复核日期：2.划线胶板烘干时间的验证目的：通过此项验证，确保在该烘干工艺下，烘干某一段时间能指导生产出合格均一的划线胶板。

应用胶体金免疫层析法检测动物组织中呋喃西林代谢物的残留赵正苗　罗晓琴　汪善良　冯才茂　扶　胜（北京勤邦生物技术有限公司　北京　１０２２０６） 【摘要】本文应用胶体金免疫层析法检测动物组织中残留的呋喃西林代谢物。

结果表明，试纸条检测限为１．０μｇ／ｋｇ，假阳性率小于５％，假阴性率为０；对其他药物无交叉反应，特异性较好；对实际样品检测结果与ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法检测结果一致。

可见胶体金试纸条法具有操作简便、快速、直观的特点，可作为筛选法对样品进行现场快速筛查。

关键词：胶体金免疫层析法；动物组织；呋喃西林代谢物 呋喃西林（Ｎｉｔｒｏｆｕｒａｚｏｎｅ）属于硝基呋喃类中的一种，其抗菌谱极广，有很好的抗菌作用。

但由于硝基呋喃类药物对人体具有潜在的危害性，欧盟已于１９９５年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类药物〔１〕，我国农业部发布的第１９３号公告中规定硝基呋喃类禁止所有用途，在所有食用动物中禁用〔２〕。

由于硝基呋喃类药物对光敏感、代谢快速，母体化合物在动物体及其产品中很快就降至检出限以下，但其代谢物以蛋白结合物的形式在体内可残留较长时间〔３〕。

国内外报道硝基呋喃类代谢物残留检测的方法主要有液相色谱（ＨＰＬＣ－ＵＶ）、液相色谱－质谱（ＬＣ－ＭＳ）、液相色谱－串联质谱（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）、荧光偏振免疫分析技术（ＦＰＩＡ）等〔４～１５〕。

目前欧盟对硝基呋喃类代谢物的检测方法灵敏度规定为１μｇ／ｋｇ〔４〕，瑞士等国际基准实验室报道的ＨＰＬＣ－ＭＳ方法要求检出限达到１．０μｇ／ｋｇ，但也仅限于检测ＡＯＺ和ＡＭＯＺ〔４，５〕。

ＨＰＬＣ－ＭＳ等仪器方法通常作为一种精确、稳定的确证方法使用，但具有成本高、前处理繁琐、操作技术要求高等缺点，不易实现现场快速筛查，基于胶体金免疫层析技术（ｇｏｌｄ　ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｓｓａｙ，ＧＩ－ＣＡ）的快速诊断试纸条（简称胶体金试纸条），已逐渐应用于动植物检疫、食品安全监督等诸多领域，与ＥＬＩＳＡ试剂盒相比，其具有更为简便快速、无需检测仪器，且成本低、无污染等优点。

磺胺二甲嘧啶胶体金免疫层析试纸条的技术报告1 胶体金的制备1.1 玻璃器皿的准备玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗，硅化。

硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。

专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。

将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后，取出，大量自来水冲洗，洗洁精洗涤，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，37℃温箱烘干后备用。

1.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液在胶体金免疫层析试验中，检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，如果太大又会遇到空间位阻问题。

空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位，例如IgG分子(160 000 Daltons)大约8nm，约有4nm可以与金颗粒的表面结合，其最适的标记金颗粒为40nm，而对小分子抗原来说，可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记。

取0.01％氯金酸水溶液100ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.5ml，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。

室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。

1.3 胶体金的质量鉴定1.3.1 肉眼观察用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。

1.3.2 紫外扫描鉴定取冷却后的胶体金溶液进行400～600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽。

紫外扫描的最大吸收峰波长为523nm，根据回归方程Y= 0. 4271X + 514. 56计算得到胶体金颗粒粒径为19.76nm。

由图谱可以看出最大吸收峰的峰宽较小,说明胶体金颗粒分布比较均匀。

1.3.3 透射电镜鉴定透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。

论文题目：有机磷农药胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制学科专业：生物化学与分子生物学学位申请人：刘莹指导教师：魏新林（副教授）摘要有机磷农药目前仍在世界范围内广泛使用，其检出率高、超标严重、毒性大，对消费者的身体健康造成了极大的危害。

加大有机磷农药的监控力度，开发快速检测技术成为有机磷农药残留检测的研究趋势，是事关国计民生的重大食品安全问题。

本研究基于免疫分析原理，利用胶体金标记技术，研制了一种胶体金免疫层析试纸条，为有机磷农药的现场监控提供了可能，并为农药小分子的胶体金免疫层析试纸条的制作提供了理论依据。

本实验的主要研究内容和结果如下：1 通过重氮化法合成了一种有机磷人工抗原。

先将合成的有机磷半抗原产物通过质谱分析和核磁共振鉴定，确定半抗原合成成功。

偶联后的全抗原经紫外扫描和红外光谱鉴定，确定半抗原与载体蛋白偶联成功。

经浓度测定，有机磷人工抗原产物的蛋白含量为 4.32mg/ml。

通过紫外吸收法测得半抗原和载体蛋白的偶联比为7.61：1。

2 制备了有机磷单克隆抗体胶体金标记探针，确定胶体金标记的最佳pH为8.0，最适蛋白量为24 µg/ml。

通过斑点金免疫渗滤实验和免疫层析实验，鉴定制备的金标抗体探针具有免疫活性。

3 以有机磷人工合成抗原为包被抗原固定于硝酸纤维素膜的检测线位置，以羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜的控制线位置，组装了胶体金免疫层析试纸条。

对试纸条的各个组分进行了研究，确定了硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫等膜材料的使用型号，对各种膜的浸泡处理液的配方进行了优化选择，对免疫层析反应的溶液系统进行了筛选，并对包被抗原、羊抗鼠二抗及金标抗体的浓度和喷量进行了调试和确定。

最后对制备的胶体金试纸条进行了灵敏度、特异性、稳定性和重复性等各项质量性能指标测试。

结果表明，该胶体金试纸条可检出杀螟硫磷、甲基对硫磷、对硫磷等9种有机磷农药，最低检出浓度可达0.25 mg/kg，可用于多种有机磷农药的初筛。

快速检测联苯菊酯的胶体金层析试纸条研制朱海;许稳健;杨星星;付辉;李细清;李远兵;严义勇;毕思远;汪凤林【摘要】[目的]采用免疫胶体金技术,建立一种快速检测联苯菊酯的试纸条方法.[方法]利用有机合成方法制备了联苯菊酯半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫抗原,利用人工免疫的方法获得其单克隆抗体,通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证.联苯菊酯胶体金层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,并将联苯菊酯抗原与羊抗鼠IgG分别喷制到硝酸纤维膜上,与样品垫、吸水垫组装在PVC衬板上制备而成.[结果]联苯菊酯胶体金层析试纸条检测限为500～800 μg/kg,具有速度快、简单等优点.此外,该试纸条与大部分的拟除虫菊酯没有明显的交叉反应,利用该试纸条可实现对苋菜中联苯菊酯添加试验的准确判定.[结论]胶体金试纸条方法具有前处理简单、检测速度快、可以肉眼判断结果等优点,该试纸条有望实现对果蔬中联苯菊酯残留的快速筛查.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(000)007【总页数】4页(P59-62)【关键词】联苯菊酯;单克隆抗体;胶体金;快速检测;免疫层析【作者】朱海;许稳健;杨星星;付辉;李细清;李远兵;严义勇;毕思远;汪凤林【作者单位】深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101;深圳市博英菲生物科技有限公司,广东深圳518102;深圳市易瑞生物技术有限公司,广东深圳518101【正文语种】中文【中图分类】TS207.5+3联苯菊酯(Bifenthrin，BF)是一种人工合成的拟除虫菊酯类农药，具有杀虫谱广，击倒作用快，持效期长，强大的胃毒和触杀作用等特点[1-2]。