细菌的鞭毛染色及活细菌的运动性观察

细菌鞭毛染色及活细菌运动性观察
摘要本实验采用硝酸银染色法对苏云金芽孢杆菌与铜绿假单胞菌进行鞭毛染色，在油镜下观察其菌体形态和鞭毛的形态、数量、着生位置。

并采用压滴法，用美蓝染色后观察细菌的运动性。

关键词鞭毛、硝酸银染色法、压滴法、运动性
前言鞭毛是某些细菌表面细长弯曲的丝状物，是细菌的运动器官和特殊构造。

细菌鞭毛的长短、数量和生长位置是鉴别菌种的一个重要的形态学指标，也是细菌重要的抗原物质与致病因素。

根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。

细菌的鞭毛非常纤细，直径一般在20nm左右，采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。

鞭毛染色法的基本原理是在染色前先经媒染剂处理，媒染剂吸附在鞭毛上，使鞭毛加粗，然后再进行染色，便可达到普通光学显微镜的辨析范围以内。

常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。

鞭毛染色一直被提倡作为革兰阴性非发菌的鉴别手段之一，先后出现了Leifsen法、镀银法、Ryu氏法等多种鞭毛染色的方法。

鞭毛细长透明，其宽度在普通光学显微镜波长检验范围之外，所以不易观察。

如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛，同时可以观察细菌的运动性特征。

1 材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）铜绿假单细胞菌（P.Aeruginosa）
1.1.2染色液和试剂
香柏油，二甲苯，硝酸银鞭毛染液，0.01%美蓝水溶液等。

1.1.3仪器及其他
普通光学显微镜，酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，
试管，镊子，滴管，盖玻片，吸水纸等。

1.2方法及步骤
1.2.1硝酸银染色法
1.2.1.1清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，置洗含衣粉过的水中煮沸20min。

取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。

1.2.1.2 菌液制备菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在
新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。

无菌操作，用接种环分别在苏云金芽孢杆菌培养基和铜绿假单胞菌平板上挑取菌落边缘菌体，接种环接触提前滴在载玻片上的水滴上，制成轻度混浊的菌液，注意不要剧烈震荡。

1.2.1.3制片将玻片缓缓倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。

涂片放空气中自然干燥。

1.2.1.4染色①滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3～5min；②用蒸馏水充分洗净A液；
③用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。

1.2.1.5镜检先低倍镜观察，再高倍镜观察，最后用油镜观察。

镜检时，如未见鞭
毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。

菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。

1.2.2压滴法
1.2.2.1菌液制备无菌操作，用接种环分别在苏云金芽孢杆菌培养基和铜绿假单胞菌平板上挑取菌落边缘菌体，接种环接触提前滴在载玻片上的水滴上，制成轻度混浊的菌液，注意不要剧烈震荡。

1.2.2.2 制片载玻片的菌液上加入一滴0.01%的美蓝水溶液，混合均匀。

用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡。

1.2.2.3镜检将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。

要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。

2 结果与分析
2.1 实验结果见下图
图1 苏云金芽孢杆菌镜检图（10×100）
2.2 结果分析镜检观察，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

苏云金芽孢杆菌菌体形态为短杆状，末端钝圆，单生或形成短链。

鞭毛分布于菌体细胞表面，为周生鞭毛（见图1）。

铜绿假单胞菌菌体形态为直或稍弯、两端钝圆的杆菌，单生。

菌体的一端只有1根鞭毛，为单端鞭毛（见图2）。

用压滴法分别观察苏云金芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的运动性。

盖玻片下液体流动较明显，菌体随水流运动，运动方向较统一且呈直线状。

待液体稍蒸发，盖玻片下液体充分但不流动时观察，细菌的运动也有一定的方向，运动过程中可转弯，有些细菌在原处左右摆动，为布朗运动。

随着盖玻片下水分丧失的增多，细菌运动性减弱，直至固定不动。

有些细菌至始至终都不运动，可能鞭毛已脱落或损坏。

压滴法检查细菌的运动性来判断鞭毛的有无，快速、简洁，但受操作和滴
加美蓝染液的量影响较大。

3思考题
一.、细菌鞭毛染色的注意事项有以下几点：
1.要选好菌种。

细菌的鞭毛应多而长易于观察。

2.要注意培养时间：培养时间要严格掌握，一般培养9～12h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。

3.染色液一定要新鲜A染液和B染液最好都现用现配，A液一般不能放置。

4.染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。

②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。

③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。

④A染液染3～5min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加B染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。

⑤B染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。

二、鞭毛与菌体脱离的原因：
①选用的菌种可能培养时间过长，为老龄菌种，鞭毛易脱落。

②在制备菌种菌液时振荡幅度太大，使鞭毛脱落。

③鞭毛染色及冲洗染液时，操作不够规范，液体流动性大使鞭毛受损脱落。

4 小结
本次实验主要学习鞭毛染色法和压滴法。

鞭毛的染色实验未能成功观察到
染色后的鞭毛，实验失败。

分析失败的主要原因，在于实验操作不规范，缺乏耐
心和经验。

通过对老师成功染色后鞭毛的观察，观察到鞭毛的着生位置、数量和
形态特征，对鞭毛是菌体的运动器官有了更好的理解。

细菌运动性观察实验中，
成功的观察到美蓝染液后运动的细菌，实验较成功。

5 参考文献
1.沈萍陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.76-81页
2沈萍陈向东主编的《微生物学》第2版.高等教育出版社，。

3.网络百度图库（注：图片一为老师染色成果，图片二来自百度图库）。