大肠杆菌BL21_DE3_中表达重组蛋白的研究

基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建张飞飞;石牡丹;尚广东【摘要】[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率.[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能.[结果]敲除了编码降解外源DNA的Ⅰ型限制性内切酶的ksdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BI21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株.[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)020【总页数】4页(P29-31,72)【关键词】重组工程;基因敲除;双链断裂修复;大肠杆菌BL21(DE3)【作者】张飞飞;石牡丹;尚广东【作者单位】徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S188酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。

野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。

高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一。

突变体库也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。

常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法(如 DNA shuffling［1］和易错 PCR［2］)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源蛋白表达宿主菌。

实验名称：重组人干扰素α2b的表达与纯化实验日期：2023年4月10日实验目的：1. 掌握重组蛋白的表达方法。

2. 学习重组蛋白的纯化技术。

3. 了解生物工程在制药领域的应用。

实验原理：重组人干扰素α2b（rhIFNα2b）是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的生物活性蛋白。

本实验采用原核表达系统，将rhIFNα2b基因构建到表达载体中，转化大肠杆菌，通过诱导表达、离心分离、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法，实现对rhIFNα2b的纯化。

实验材料：1. 基因组DNA2. 质粒载体3. 大肠杆菌DH5α4. 重组表达载体5. IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）6. 诱导剂（如甘油、葡萄糖等）7. 离心机8. 层析柱9. 超纯水10. 透析袋11. 紫外分光光度计12. 纯化试剂盒实验步骤：1. 基因克隆：将rhIFNα2b基因从基因组DNA中扩增，连接到质粒载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

2. 表达载体构建：将阳性克隆的质粒提取，进行PCR鉴定，确认目的基因的正确插入。

3. 重组表达菌株的诱导表达：将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），挑选阳性克隆，在含有IPTG的培养基中诱导表达。

4. 离心分离：收集诱导表达后的菌体，离心分离菌体和上清液。

5. 粗蛋白提取：将上清液用硫酸铵进行盐析，收集沉淀，复溶于超纯水中。

6. 离子交换层析：将粗蛋白溶液上样至离子交换层析柱，用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。

7. 凝胶过滤层析：将离子交换层析后的蛋白溶液上样至凝胶过滤层析柱，收集目标蛋白峰。

8. 蛋白纯度鉴定：利用SDS-PAGE电泳、紫外分光光度计等方法鉴定蛋白纯度。

实验结果：1. 成功构建了rhIFNα2b基因的原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，诱导表达得到目标蛋白。

2. 通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了rhIFNα2b蛋白，纯度达到95%以上。

重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化作者：吴铭，郭立泉，陈光来源：《湖北农业科学》 2014年第10期吴铭１，２，郭立泉１，陈光３（１．吉林工商学院粮油食品深加工吉林省重点实验室，长春１３００６２；２．东北师范大学生命科学学院，长春１３００２４；３．吉林农业大学生命科学学院，长春１３００００）摘要：以Ⅵ型人胶原蛋白Ａ２链基因为模板，ＰＣＲ扩增得到目的基因ＣＰ６，构建了重组胶原蛋白表达载体，然后筛选高效表达的宿主菌，检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。

结果表明，重组胶原蛋白在Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达量相对最高，重组质粒稳定性也较高。

较佳的表达条件为接种量４％或５％，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００ｎｍ为０．７时，加入０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，培养５ｈ，并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体有特异性反应。

关键词：胶原蛋白多肽；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；表达；优化中图分类号：Ｑ８１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）10－2443-05胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取，将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。

胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同，并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质［１］。

目前，研究者已经发现了很多生物体的多肽，而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节，如神经传导、细胞增殖和生长等。

因此，在胶原蛋白的研究中，胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。

在胶原蛋白的众多类型中，Ⅵ型胶原蛋白（ＣⅥ）几乎分布在所有结缔组织中，而且它还具有维持组织完整性，能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激ＤＮＡ合成，具有生长因子的特性［２，３］。

目前，研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Ｂｅｔｈｌｅｍ肌病的主要原因，而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能导致肝纤维化，Ⅵ型胶原蛋白还在细胞增殖和肿瘤转化方面具有一定作用。

本研究构建了含有人的Ⅵ型人胶原蛋白多肽基因的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中进行表达研究，为后续研究奠定了基础。

论文分类号 Q816单 位 代 码 10183密 级 公开研究生学号**********吉林大学硕士学位论文重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究The conditions on purification and lyophylization ofrecombinant proteins作者姓名：王俪波专业：生物化学与分子生物学导师姓名王丽颖及职称：教授学位类别：理学硕士论文起止年月：2006年9月至2008年6月重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究吉林大学王俪波吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI 系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。

□博士学科专业：生物化学与分子生物学论文题目：重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林省长春市吉林大学白求恩医学院分子生物学教研室 130021作者联系电话：135****4493作者姓名 王俪波 论文分类号 Q816保密级别 公开研究生学号 2006712039学位类别 理学硕士授予学位单位 吉 林 大 学专业名称生物化学与分子生物学培养单位（院、所、中心）白求恩医学院研究方向基因工程及疾病的分子免疫学研究学习时间2006年9月至2008年6月论文中文题目 重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究论文英文题目 The conditions on purification and lyophylization ofrecombinant proteins关键词(3-8个)重组蛋白、纯化、活性、冷冻干燥姓 名 王丽颖职称 教授导师情况学历学位 博士工作单位吉林大学论文提交日期 20 年 月 日 答辩日期20 年 月 日 是否基金资助项目 否 基金类别及编号如已经出版，请填写以下内容出版地（城市名、省名）出版者（机构）名称出版日期 出版者地址（包括邮编）提要纯化和冷冻干燥是重组蛋白质生产中的两种关键工艺。

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达陈光;吴铭;王刚;孙旸【摘要】目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发酵条件,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化分析.结果:菌株在37℃、接种量为2%、摇瓶培养约2.5h后,加入终浓度为0.5mmol· L-1的IPTG,37℃诱导5h,收获的蛋白产量最高为31.52 mg· L-1,Western blotting分析该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力.结论:优化工程菌高效表达重组人胶原蛋白,纯化重组蛋白.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P656-660)【关键词】重组胶原蛋白肽;重组蛋白纯化;大肠杆菌【作者】陈光;吴铭;王刚;孙旸【作者单位】吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q78胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分[1]。

由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。

目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的开发[2]。

BL21(DE3)pLysS感受态细胞使用说明BL21(DE3)pLysS感受态细胞使用说明感受态细胞在生物技术领域中扮演着重要的角色，能够有效地表达外源蛋白，并被广泛应用于蛋白质表达、抗体产生、酶工程等方面。

BL21(DE3)pLysS是一种常用的感受态细胞系，本文将对其使用说明进行详细介绍。

一、BL21(DE3)pLysS细胞的特点BL21(DE3)pLysS细胞是一种缺失棘突病毒抗性基因（lysozyme）的感受态大肠杆菌细胞系。

该细胞系具有以下特点：1. 能够高效表达外源蛋白，产量较高，适用于大规模蛋白质表达。

2. 具备感受态特性，能有效产生T7 RNA聚合酶，并且对T7启动子响应较高。

3. 细胞表面表达了T7 RNA聚合酶抑制蛋白（LysS），能够抑制内源性T7 RNA聚合酶的活性，避免了胞内T7 RNA聚合酶的自主大量表达。

二、感受态细胞的培养条件BL21(DE3)pLysS感受态细胞的培养条件与常规大肠杆菌细胞类似，但需要特别留意以下几点：1. 培养基的选择：常用的培养基有LB、TB等。

推荐使用TB培养基，因其含有较高浓度的氨基酸和糖源，可促进蛋白表达。

2. 抗生素选择：推荐添加适量的抗生素（如氨苄青霉素、克林霉素等）以维持感受态细胞的稳定性。

3. 培养温度和转入T7 RNA聚合酶的方式：通常将感受态细胞在37℃下培养至对数期后，加入适量IPTG等诱导剂，激活细胞中的T7 RNA聚合酶基因表达。

也可以在低温（如18℃）下诱导，有助于获得可溶性的重组蛋白。

4. 培养时程：培养时程根据不同的蛋白表达情况而定，通常是在对数期至滚筒培养的4-6小时内进行表达。

三、蛋白表达与纯化BL21(DE3)pLysS细胞的主要应用之一是进行外源蛋白的表达和纯化。

下面是一般的表达和纯化步骤：1. 定义目标蛋白：确定所需表达的外源蛋白序列，并构建相应的重组质粒。

2. 转化重组质粒：将构建好的重组质粒转化到感受态细胞中，通过进行抗生素筛选，获得含重组质粒的菌落。

重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。

本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。

提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。

关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。

bl21de3基因型-回复BL21DE3基因型是一种常见的细菌基因型，它在生物学和基因工程领域具有广泛的应用。

本文将一步一步解释BL21DE3基因型的含义、特点以及其在科研和工业应用中的作用。

首先，我们来了解BL21DE3基因型的含义和起源。

BL21DE3是大肠杆菌（Escherichia coli）的一种特殊基因型，它是由原始BL21菌株经过基因重组而得到的。

BL21DE3基因型是通过插入DE3（由pET 系列质粒携带的T7 RNA聚合酶基因）来构建的。

这样一来，BL21DE3基因型就具备了T7 RNA聚合酶的表达能力，可以高效地产生大量的目标蛋白。

BL21DE3基因型的特点主要体现在两个方面：高效的蛋白表达和容易操作。

首先，由于BL21DE3基因型携带T7 RNA聚合酶基因，它可以利用T7促进子启动子驱动的高效表达系统来表达目标蛋白。

这个系统可以在感染T7 RNA聚合酶的大肠杆菌中产生大量的目标蛋白，其产量通常远远高于其他常见的表达系统。

因此，BL21DE3基因型在大规模蛋白表达和纯化方面具有巨大的优势。

其次，BL21DE3基因型的操作相对简单。

在基因工程实验中，只需将目标基因序列克隆到适当的pET质粒中，然后将质粒转化到BL21DE3细胞中。

这个过程通常可以通过化学法或电穿孔法实现。

由于BL21DE3基因型的广泛应用，研究人员已经开发了各种工具和试剂盒，使得BL21DE3基因型的操作更加简便和高效。

BL21DE3基因型在科研和工业中都发挥着重要的作用。

首先，它被广泛应用于蛋白表达和纯化领域。

由于BL21DE3基因型的高效表达能力，它成为了研究人员首选的蛋白表达系统。

不仅如此，BL21DE3基因型还被广泛用于表达溶酶酶原，用于蛋白酶活性研究和酶工程领域。

此外，BL21DE3基因型还被用作包括降解有害物质、产生重要药物和生化品等在内的工业生产菌株。

例如，一些重要药物如胰岛素、生长激素等就是通过BL21DE3基因型进行大规模工业生产的。

猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及活性检测张二芹;滕蔓;罗俊;赵孟孟;许倩茹;赵东;邓瑞广;张改平【摘要】在大肠杆菌BL21(DE3)中表达乙脑病毒(JEV) EDⅢ蛋白、镍柱纯化并检测表达蛋白.采用RT-PCR方法扩增EDⅢ基因片段,构建重组表达载体pET-28a-EDⅢ并转化到BL21(DE3)菌,经IPTG诱导蛋白表达,表达可溶性产物经Ni-NTA亲和层析纯化,最后通过SDS-PAGE和Western-Blot检测表达蛋白.结果成功构建原核表达载体pET-28a-EDⅢ;EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表达,经Ni-NTA获得纯化蛋白,并经Western-Blot检测具有反应活性.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2017(053)009【总页数】3页(P28-30)【关键词】乙脑病毒;EDⅢ蛋白;表达蛋白【作者】张二芹;滕蔓;罗俊;赵孟孟;许倩茹;赵东;邓瑞广;张改平【作者单位】河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1乙脑是由日本乙型脑炎病毒引起的一种急性人兽共患传染病。

经三带喙库蚊等蚊虫叮咬传播感染中枢神经系统。

JEV属于黄病毒科黄病毒成员,乙脑病毒为球形，直径40 nm，单股正链RNA病毒。

肠毒素P基因SEP在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化与鸡抗体制备肠毒素P基因SEP在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化与鸡抗体制备摘要：本研究旨在探究肠毒素P基因SEP在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化与鸡抗体制备的方法。

通过PCR扩增得到SEP基因的DNA片段，并构建pET-30a(+)-SEP表达载体，通过转化大肠杆菌BL21 (DE3)获得了重组菌株。

随后，利用IPTG诱导表达，获得了重组蛋白SEP在大肠杆菌中的表达产物。

通过尿素裂解与尼泊金柱层析等步骤，获得了高纯度的重组蛋白，并进一步制备了鸡抗体。

实验结果表明，本研究方法简单有效，可为进一步研究SEP的生物学功能及其应用奠定基础。

关键词：肠毒素P基因SEP；大肠杆菌；表达；蛋白纯化；鸡抗体1. 引言肠毒素P (toxin P) 是一种重要的细菌外源毒素，广泛存在于细菌、真菌和病毒中。

其研究对于深入了解肠道疾病的发生机制以及发展新型治疗手段具有重要意义。

本研究旨在探究SEP基因在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化及鸡抗体制备的方法，为进一步研究SEP的生物学功能以及相关应用提供基础。

2. 材料与方法2.1 购买SEP基因片段，并进行PCR扩增；2.2 构建pET-30a(+)-SEP表达载体；2.3 转化大肠杆菌BL21 (DE3)获得重组菌株；2.4 IPTG诱导表达SEP；2.5 细胞收获并尿素裂解；2.6 亲和纯化重组SEP；2.7 SDS-PAGE分析蛋白纯化效果；2.8 制备鸡抗体。

3. 结果3.1 PCR扩增获得SEP基因片段；3.2 成功构建pET-30a(+)-SEP表达载体；3.3 成功转化大肠杆菌BL21 (DE3)获得重组菌株；3.4 成功诱导表达SEP；3.5 获得高纯度的重组SEP蛋白；3.6 成功制备鸡抗体。

4. 讨论本研究采用了PCR扩增、重组表达、蛋白纯化等方法，成功获得了肠毒素P基因SEP在大肠杆菌中的表达产物，并进一步制备了鸡抗体。

重组人白细胞介素-2的原核可溶表达李冠英;李海红;徐士勋;潘晓雨【摘要】为探索白细胞介素-2在大肠杆菌中的可溶表达及其生物学活性,利用载体pMAL-c5x将 rhIL-2与MBP融合,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导MBP-rhIL2的表达.接着用Amylose树脂将MBP-rhIL2纯化,最后利用Factor Xa蛋白酶将rhIL-2从融合蛋白中释放.结果显示:MBP-rhIL2以可溶形式表达;Factor Xa成功将rhIL-2从融合蛋白中释放出来;经生物学活性测定,其比活性为4.4×106IU/mg.%This work aims to explore the soluble expression and biological activity of interleukin-2; recombinant fusion protein MBP-rhIL2 was successfully expressed into soluble form in E.coli BL21(DE3). The purification of MBP-rhIL2 was conducted through amy-lose resin. The rhIL-2 was efficiently released by the cleavage of protease Factor Xa from the fusion protein. Bioactivity analysis showed the biological activity of purified rhIL-2 is 4.4 ×106IU/mg.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)001【总页数】4页(P107-110)【关键词】白细胞介素-2;可溶表达;蛋白纯化【作者】李冠英;李海红;徐士勋;潘晓雨【作者单位】上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q591.2;R392.1白细胞介素-2(Interleukine-2，IL-2)，是由白细胞分泌的一种糖蛋白，可介导细胞间的相互作用，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用[1]。

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略前言重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。

药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。

重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。

已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。

通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。

但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。

蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。

在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。

但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。

在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。

一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。

还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。

另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。

本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。

1.大肠杆菌表达系统的构建1.1选择表达宿主菌对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。

与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。

在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。

在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。

美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。

食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期85重组大肠杆菌发酵表达及代谢调控研究进展张言慧「，高先岭「，黄魁2,郭青青「，袁建国2*(1.山东国力生物科技有限公司，山东济南250014；2.山东国力生物技术研究院，山东济南250101)摘要：作为应用最为普遍的蛋白质表达系统，重组大肠杆菌表达系统具有其他表达系统无法比拟的优越性。

本文综述了大肠杆菌作为表达系统的特征，釆用重组大肠杆菌表达的重组蛋白及生物化学产品概况，概述了表达载体中营养源诱导启动子、温敏型启动子及乳糖启动子3种不同类型启动子特点。

另外分析了不同大肠杆菌宿主对碳源的代谢特征，乙酸代谢对大肠杆菌生长及重组蛋白表达的影响，丙酮酸代谢及乙醛酸循环的特征，最后介绍了发酵过程调控对重组大肠杆菌表达系统的影响。

关键词：大肠杆菌；发酵；代谢；启动子；重组蛋白中图分类号：Q939.97文献标识码：A文章编号：1672-979X(2021)01-0085-07DOI：10.3969/j.issn.l672-979X.2021.01.018Research Progress on Fermentation Expression and Metabolism Regulation of RecombinantEscherichia ColiZHANG Yan-hui1,GAO Xian-ling1,HUANG Kui2,GUO Qing-qing1,YUAN Jian-guo2收稿日期：2020-10-29基金项目：山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY010520)作者简介：张言慧，硕士，工程师，研究方向为微生物发酵过程优化"通讯作者：袁建国，研究员，研究方向为食品与药品生物技术E-mail:******************collagen-induced arthritis[J].Arthritis Rheum,2000,43(8):1698­1709.[36]Sadallah S,Lach E,Lutz H U,et al.CD35IN synovial fluid frompatients with inflammatory joint diseases[J].Arthritis Rheum, 1997,40(3):520-526.[37]Nilsson S C,Sim R B,Lea S M,et plement factor I inhealth and disease[J].Mol Immunol,2011,48(14):1611-1620. [38]Mastellos D C,Ricklin D,Yancopoulou D,et plementin paroxysmal nocturnal hemoglobinuria:exploiting our current knowledge to improve the treatment landscape[J].Expert Rev Hematol,2014,7(5):583-598.[39]SjOberg A P,Manderson G A,Morgelin M,et al.Short leucine-richglycoproteins of the extracellular matrix display diverse patterns of complement interaction and activation[J].Mol Immunol,2008, 46(5):830-839.[40]Banda N K,Levitt B,Glogowska M J,et al.Targeted inhibitionof the complement alternative pathway with complement receptor 2and factor H attenuates collagen antibody-induced arthritis in mice[J].J Immunol,2009,183(9):5928-5937.[41]Song H,He C,Knaak C,et plement receptor2-mediatedtargeting of complement inhibitors to sites of complement activation[J].J Clin Investig,2003,111(12):1875-1885.[42]Molina H.Distinct receptor and regulatory properties ofrecombinant mouse complement receptor1(CR1)and Crry,the two genetic homologues of human CR1[J].J Exp Med,1992, 175(1):121-129.[43]Michelfelder S,Fischer F,Waldin A,et al.The MFHR1FusionProtein Is a Novel Synthetic Multitarget Complement Inhibitor with Therapeutic Potential[J].J Am Soc Nephrol,2018,29(4): 1141-1153.[44]Noris M,Remuzzi G.Glomerular diseases dependent oncomplement activation,incl-uding atypical hemolytic uremic syndrome,membranoproliferative glomerulonephritis,and C3 glomerulopathy:core curriculum2015[J].Am J Kidney Dis,2015, 66(2):359-375.[45]Melis J PM,Strumane K,Ruuls S R,et plement in therapyand disease:Regul-ating the complement system with antibody­based therapeutics[J].Mol Immunol,2015,67(2):117-130.86食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期(1.Shandong Guoli Biotechnology Limited Company,Jinan250014,China；2.Shandong Guoli BiotechnologyResearch Institute,Jinan250101,China)Abstract:As the most widely used protein expression system,the recombinant Escherichia coli expression system has more advantages than other expression systems.In this paper,the characteristics of Escherichia coli as an expression system were reviewed,and recombinant proteins and biochemical products expressed in recombinant Escherichia coli were introduced.The characteristics of three different types of promoters including nutrition-induced promoters, temperature-sensitive promoters and lactose promoters in expression vectors were summarized.In addition,the metabolic characteristics of carbon sources in different Escherichia coli hosts,the eflect of acetic acid metabolism on the growth of Escherichia coli and expression of recombinant protein,the characteristics of pyruvate metabolism and glyoxylic acid cycle were analyzed.Finally,the effect of fermentation regulation on the expression system of recombinant Escherichia coli was introduced.Key Words:Escherichia coli;fermentation;metabolism;promoter;recombinant protein由于大肠杆菌遗传学背景较清楚，生长速度快，培养基条件要求较低，容易实现高密度培养等特点，长期以来是商业生产重要目的基因的表达系统为了获得高水平的基因表达产物，综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等多方面因素，设计了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的蛋白需要冈。

重组人胰岛素原料药生产实验报告一、引言胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。

重组人胰岛素是指通过基因工程技术生产的胰岛素，与传统的动物源性胰岛素相比，具有更高的纯度和更好的效果。

本报告旨在介绍重组人胰岛素原料药生产实验的过程和结果。

二、实验设计1. 实验目的本实验旨在通过大肠杆菌表达系统生产重组人胰岛素原料药，并对其进行纯化和鉴定。

2. 实验步骤（1）构建表达载体：将人胰岛素基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中。

（2）转化大肠杆菌：将表达载体导入大肠杆菌中，使其能够表达人胰岛素基因。

（3）培养大肠杆菌：在LB培养基中进行培养，使其能够表达出人胰岛素。

（4）收集细菌：将细菌离心收集，并用冷冻离心法裂解细胞获得包含目标蛋白的上清液。

（5）纯化目标蛋白：通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。

（6）鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。

三、实验结果1. 表达载体构建将人胰岛素基因插入pET-28a(+)表达载体中，经PCR扩增和酶切，得到正确的表达载体。

2. 转化大肠杆菌将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，利用热激法转化。

经PCR检测和测序验证，转化效率较高。

3. 大肠杆菌培养在LB培养基中进行培养，经过16小时的培养后，细菌进入对数生长期。

经过4小时的诱导，大肠杆菌开始表达人胰岛素基因。

4. 目标蛋白纯化通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。

最终得到了高纯度的重组人胰岛素原料药。

5. 目标蛋白鉴定通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。

结果表明，纯化后的目标蛋白具有正确的分子量和免疫反应性。

四、实验讨论本实验通过大肠杆菌表达系统成功生产了重组人胰岛素原料药，并对其进行了纯化和鉴定。

其中，表达载体构建和大肠杆菌转化是实验的关键步骤，需要严格控制条件以确保表达效率和转化效率。