大肠杆菌BL21_DE3_中表达重组蛋白的研究
- 格式：pdf
- 大小：218.59 KB
- 文档页数：4
文档推荐
-
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化页数:3
-
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略页数:11
-
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化页数:3
-
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略页数:14
-
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略页数:7
下载文档原格式
合集下载
基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建
基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建张飞飞;石牡丹;尚广东【摘要】[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率.[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能.[结果]敲除了编码降解外源DNA的Ⅰ型限制性内切酶的ksdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BI21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株.[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)020【总页数】4页(P29-31,72)【关键词】重组工程;基因敲除;双链断裂修复;大肠杆菌BL21(DE3)【作者】张飞飞;石牡丹;尚广东【作者单位】徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S188酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。
野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。
高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一。
突变体库也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。
常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法(如 DNA shuffling［1］和易错 PCR［2］)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源蛋白表达宿主菌。
制药工程生物实验报告
实验名称：重组人干扰素α2b的表达与纯化实验日期：2023年4月10日实验目的：1. 掌握重组蛋白的表达方法。
2. 学习重组蛋白的纯化技术。
3. 了解生物工程在制药领域的应用。
实验原理：重组人干扰素α2b（rhIFNα2b）是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的生物活性蛋白。
本实验采用原核表达系统，将rhIFNα2b基因构建到表达载体中，转化大肠杆菌，通过诱导表达、离心分离、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法，实现对rhIFNα2b的纯化。
实验材料：1. 基因组DNA2. 质粒载体3. 大肠杆菌DH5α4. 重组表达载体5. IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）6. 诱导剂（如甘油、葡萄糖等）7. 离心机8. 层析柱9. 超纯水10. 透析袋11. 紫外分光光度计12. 纯化试剂盒实验步骤：1. 基因克隆：将rhIFNα2b基因从基因组DNA中扩增，连接到质粒载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。
2. 表达载体构建：将阳性克隆的质粒提取，进行PCR鉴定，确认目的基因的正确插入。
3. 重组表达菌株的诱导表达：将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），挑选阳性克隆，在含有IPTG的培养基中诱导表达。
4. 离心分离：收集诱导表达后的菌体，离心分离菌体和上清液。
5. 粗蛋白提取：将上清液用硫酸铵进行盐析，收集沉淀，复溶于超纯水中。
6. 离子交换层析：将粗蛋白溶液上样至离子交换层析柱，用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
7. 凝胶过滤层析：将离子交换层析后的蛋白溶液上样至凝胶过滤层析柱，收集目标蛋白峰。
8. 蛋白纯度鉴定：利用SDS-PAGE电泳、紫外分光光度计等方法鉴定蛋白纯度。
实验结果：1. 成功构建了rhIFNα2b基因的原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，诱导表达得到目标蛋白。
2. 通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了rhIFNα2b蛋白，纯度达到95%以上。
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化
重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化作者：吴铭，郭立泉，陈光来源：《湖北农业科学》 2014年第10期吴铭１，２，郭立泉１，陈光３（１．吉林工商学院粮油食品深加工吉林省重点实验室，长春１３００６２；２．东北师范大学生命科学学院，长春１３００２４；３．吉林农业大学生命科学学院，长春１３００００）摘要：以Ⅵ型人胶原蛋白Ａ２链基因为模板，ＰＣＲ扩增得到目的基因ＣＰ６，构建了重组胶原蛋白表达载体，然后筛选高效表达的宿主菌，检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。
结果表明，重组胶原蛋白在Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达量相对最高，重组质粒稳定性也较高。
较佳的表达条件为接种量４％或５％，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００ｎｍ为０．７时，加入０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，培养５ｈ，并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体有特异性反应。
关键词：胶原蛋白多肽；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；表达；优化中图分类号：Ｑ８１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）10－2443-05胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取，将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。
胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同，并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质［１］。
目前，研究者已经发现了很多生物体的多肽，而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节，如神经传导、细胞增殖和生长等。
因此，在胶原蛋白的研究中，胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。
在胶原蛋白的众多类型中，Ⅵ型胶原蛋白（ＣⅥ）几乎分布在所有结缔组织中，而且它还具有维持组织完整性，能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激ＤＮＡ合成，具有生长因子的特性［２，３］。
目前，研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Ｂｅｔｈｌｅｍ肌病的主要原因，而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能导致肝纤维化，Ⅵ型胶原蛋白还在细胞增殖和肿瘤转化方面具有一定作用。
本研究构建了含有人的Ⅵ型人胶原蛋白多肽基因的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中进行表达研究，为后续研究奠定了基础。
重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究
论文分类号 Q816单 位 代 码 10183密 级 公开研究生学号**********吉林大学硕士学位论文重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究The conditions on purification and lyophylization ofrecombinant proteins作者姓名：王俪波专业：生物化学与分子生物学导师姓名王丽颖及职称：教授学位类别：理学硕士论文起止年月：2006年9月至2008年6月重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究吉林大学王俪波吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI 系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。
□博士学科专业：生物化学与分子生物学论文题目：重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林省长春市吉林大学白求恩医学院分子生物学教研室 130021作者联系电话：135****4493作者姓名 王俪波 论文分类号 Q816保密级别 公开研究生学号 2006712039学位类别 理学硕士授予学位单位 吉 林 大 学专业名称生物化学与分子生物学培养单位（院、所、中心）白求恩医学院研究方向基因工程及疾病的分子免疫学研究学习时间2006年9月至2008年6月论文中文题目 重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究论文英文题目 The conditions on purification and lyophylization ofrecombinant proteins关键词(3-8个)重组蛋白、纯化、活性、冷冻干燥姓 名 王丽颖职称 教授导师情况学历学位 博士工作单位吉林大学论文提交日期 20 年 月 日 答辩日期20 年 月 日 是否基金资助项目 否 基金类别及编号如已经出版，请填写以下内容出版地（城市名、省名）出版者（机构）名称出版日期 出版者地址（包括邮编）提要纯化和冷冻干燥是重组蛋白质生产中的两种关键工艺。
重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达
重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达陈光;吴铭;王刚;孙旸【摘要】目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发酵条件,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化分析.结果:菌株在37℃、接种量为2%、摇瓶培养约2.5h后,加入终浓度为0.5mmol· L-1的IPTG,37℃诱导5h,收获的蛋白产量最高为31.52 mg· L-1,Western blotting分析该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力.结论:优化工程菌高效表达重组人胶原蛋白,纯化重组蛋白.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P656-660)【关键词】重组胶原蛋白肽;重组蛋白纯化;大肠杆菌【作者】陈光;吴铭;王刚;孙旸【作者单位】吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q78胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分[1]。
由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。
目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的开发[2]。
BL21(DE3)pLysS感受态细胞使用说明
BL21(DE3)pLysS感受态细胞使用说明BL21(DE3)pLysS感受态细胞使用说明感受态细胞在生物技术领域中扮演着重要的角色，能够有效地表达外源蛋白，并被广泛应用于蛋白质表达、抗体产生、酶工程等方面。
BL21(DE3)pLysS是一种常用的感受态细胞系，本文将对其使用说明进行详细介绍。
一、BL21(DE3)pLysS细胞的特点BL21(DE3)pLysS细胞是一种缺失棘突病毒抗性基因（lysozyme）的感受态大肠杆菌细胞系。
该细胞系具有以下特点：1. 能够高效表达外源蛋白，产量较高，适用于大规模蛋白质表达。
2. 具备感受态特性，能有效产生T7 RNA聚合酶，并且对T7启动子响应较高。
3. 细胞表面表达了T7 RNA聚合酶抑制蛋白（LysS），能够抑制内源性T7 RNA聚合酶的活性，避免了胞内T7 RNA聚合酶的自主大量表达。
二、感受态细胞的培养条件BL21(DE3)pLysS感受态细胞的培养条件与常规大肠杆菌细胞类似，但需要特别留意以下几点：1. 培养基的选择：常用的培养基有LB、TB等。
推荐使用TB培养基，因其含有较高浓度的氨基酸和糖源，可促进蛋白表达。
2. 抗生素选择：推荐添加适量的抗生素（如氨苄青霉素、克林霉素等）以维持感受态细胞的稳定性。
3. 培养温度和转入T7 RNA聚合酶的方式：通常将感受态细胞在37℃下培养至对数期后，加入适量IPTG等诱导剂，激活细胞中的T7 RNA聚合酶基因表达。
也可以在低温（如18℃）下诱导，有助于获得可溶性的重组蛋白。
4. 培养时程：培养时程根据不同的蛋白表达情况而定，通常是在对数期至滚筒培养的4-6小时内进行表达。
三、蛋白表达与纯化BL21(DE3)pLysS细胞的主要应用之一是进行外源蛋白的表达和纯化。
下面是一般的表达和纯化步骤：1. 定义目标蛋白：确定所需表达的外源蛋白序列，并构建相应的重组质粒。
2. 转化重组质粒：将构建好的重组质粒转化到感受态细胞中，通过进行抗生素筛选，获得含重组质粒的菌落。
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。
本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。
提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。
关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。
大肠杆菌BL21_DE3_中表达重组蛋白的研究
(1 北京林业大学生物科学与技术学院 2 吉林大学生命科学学院 3 美国康涅狄克大学)
摘要 为了研究在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中重组蛋白的表达特点 ,探讨重组蛋白在大肠杆菌中表达时可溶性蛋白与包 涵体出现的特点 ,从表达载体中表达了植物 ACC 合成酶. 经 SDS2PAGE 电泳与双波长扫描分析 ,确定目的蛋白随表达 时间 、菌液密度的增加而增加. 但是其最佳表达时间为 215 h ,菌液密度 OD600 为 016 ,IPTG的最佳浓度为 016 mmolΠL ,此 时目的蛋白含量占全菌蛋白含量之比最高. 植物 ACC 合成酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 ,未能检测到 可溶性蛋白的表达. 关键词 ACC 合成酶 , SDS2PAGE , 包涵体 中图分类号 Q559 + . 1
责任作者 :蒋湘宁 ,男 ,1958 年生 ,教授. 主要研究方向 :植物分子生物学. Email :jiangxn @bjfu. edu. cn 工作单位 :100083 北京林业大学生 物学院森林生物学实验中心
© 1994-2010 China ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱcademic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
因此可以认为016mmollacc合成酶表达量与iptg浓度的sds2page分析泳道上方的数据为相应iptg浓度诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与细菌密度的sds2page分析011110是菌体密度为011110时诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与iptg浓度关系曲线分别为0100002010020102012014016018110acc合成酶表达量与iptg浓度的关系figuresds2pageod600acc合成酶表达量与细菌密度关系曲线acc合成酶表达量与细菌密度的关系figurebacteriadenisity215包涵体与可溶性蛋白的分析根据图沉淀与上清中都未出现明显的55kd蛋白带5a说明此时sds2page电泳未能检测到目的蛋白的表达012013诱导015od600214诱导表达量与iptg浓度的关系当菌液长到od600016时分别加入iptg37诱导培养收获细菌然后用sds2page分析011012013诱导因此可以认为对于acc合成酶用et载体在大肠杆菌中进行大量表达不会出现明显的可溶性蛋白表达
摘要 为了研究在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中重组蛋白的表达特点 ,探讨重组蛋白在大肠杆菌中表达时可溶性蛋白与包 涵体出现的特点 ,从表达载体中表达了植物 ACC 合成酶. 经 SDS2PAGE 电泳与双波长扫描分析 ,确定目的蛋白随表达 时间 、菌液密度的增加而增加. 但是其最佳表达时间为 215 h ,菌液密度 OD600 为 016 ,IPTG的最佳浓度为 016 mmolΠL ,此 时目的蛋白含量占全菌蛋白含量之比最高. 植物 ACC 合成酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 ,未能检测到 可溶性蛋白的表达. 关键词 ACC 合成酶 , SDS2PAGE , 包涵体 中图分类号 Q559 + . 1
责任作者 :蒋湘宁 ,男 ,1958 年生 ,教授. 主要研究方向 :植物分子生物学. Email :jiangxn @bjfu. edu. cn 工作单位 :100083 北京林业大学生 物学院森林生物学实验中心
© 1994-2010 China ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱcademic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
因此可以认为016mmollacc合成酶表达量与iptg浓度的sds2page分析泳道上方的数据为相应iptg浓度诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与细菌密度的sds2page分析011110是菌体密度为011110时诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与iptg浓度关系曲线分别为0100002010020102012014016018110acc合成酶表达量与iptg浓度的关系figuresds2pageod600acc合成酶表达量与细菌密度关系曲线acc合成酶表达量与细菌密度的关系figurebacteriadenisity215包涵体与可溶性蛋白的分析根据图沉淀与上清中都未出现明显的55kd蛋白带5a说明此时sds2page电泳未能检测到目的蛋白的表达012013诱导015od600214诱导表达量与iptg浓度的关系当菌液长到od600016时分别加入iptg37诱导培养收获细菌然后用sds2page分析011012013诱导因此可以认为对于acc合成酶用et载体在大肠杆菌中进行大量表达不会出现明显的可溶性蛋白表达
bl21de3基因型 -回复
bl21de3基因型-回复BL21DE3基因型是一种常见的细菌基因型，它在生物学和基因工程领域具有广泛的应用。
本文将一步一步解释BL21DE3基因型的含义、特点以及其在科研和工业应用中的作用。
首先，我们来了解BL21DE3基因型的含义和起源。
BL21DE3是大肠杆菌（Escherichia coli）的一种特殊基因型，它是由原始BL21菌株经过基因重组而得到的。
BL21DE3基因型是通过插入DE3（由pET 系列质粒携带的T7 RNA聚合酶基因）来构建的。
这样一来，BL21DE3基因型就具备了T7 RNA聚合酶的表达能力，可以高效地产生大量的目标蛋白。
BL21DE3基因型的特点主要体现在两个方面：高效的蛋白表达和容易操作。
首先，由于BL21DE3基因型携带T7 RNA聚合酶基因，它可以利用T7促进子启动子驱动的高效表达系统来表达目标蛋白。
这个系统可以在感染T7 RNA聚合酶的大肠杆菌中产生大量的目标蛋白，其产量通常远远高于其他常见的表达系统。
因此，BL21DE3基因型在大规模蛋白表达和纯化方面具有巨大的优势。
其次，BL21DE3基因型的操作相对简单。
在基因工程实验中，只需将目标基因序列克隆到适当的pET质粒中，然后将质粒转化到BL21DE3细胞中。
这个过程通常可以通过化学法或电穿孔法实现。
由于BL21DE3基因型的广泛应用，研究人员已经开发了各种工具和试剂盒，使得BL21DE3基因型的操作更加简便和高效。
BL21DE3基因型在科研和工业中都发挥着重要的作用。
首先，它被广泛应用于蛋白表达和纯化领域。
由于BL21DE3基因型的高效表达能力，它成为了研究人员首选的蛋白表达系统。
不仅如此，BL21DE3基因型还被广泛用于表达溶酶酶原，用于蛋白酶活性研究和酶工程领域。
此外，BL21DE3基因型还被用作包括降解有害物质、产生重要药物和生化品等在内的工业生产菌株。
例如，一些重要药物如胰岛素、生长激素等就是通过BL21DE3基因型进行大规模工业生产的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
IPTG的浓度在 016 mmolΠL 时 ,诱导表达的蛋白量占 全菌蛋白量的比例最大 ,约为 917 %. 而当 IPTG 浓 度超过 018 mmolΠL 时其诱导表达量不受 IPTG 的变 化影响. 根据文献报道 , IPTG 对细菌生长有一定的 抑制作用. 因此 ,可以认为 016 mmolΠL 的 IPTG 的浓 度是最佳诱导表达条件.
如何使得外源重组蛋白在大肠杆菌中获得最佳
表达 ,目前在国内还未见相关具体报道. 为了研究外 源基因在大肠杆菌中表达特点 ,以及能否在大肠杆 菌中直接形成具有生物活性的可溶性表达 ,我们利 用大肠杆菌表达系统表达了植物 ACC 合成酶[7 ,8] , 通过改变不同的表达条件 ,探讨了目的蛋白的表达 量 ,目的蛋白与全菌蛋白的比例关系和目的蛋白与 包涵体表达的特点. 为以后利用大肠杆菌获得外源 重组蛋白提供了一个有效的可供选择的条件与方 法.
Lu Hai ; Wu Wei ; Zeng Qingyin ; Li Yi ; Jiang Xiangning ; Wang Shasheng. The expression analysis of recom2 binant protein in Escherichia coli BL21 ( DE3) . Journal of Beijing Forestry University (2001) 23 (6) 1～4 [ Ch , 8 ref . ] College of Biology , Beijing For. Univ. , 100083 , P. R. China.
2 结果与讨论
211 融合蛋白的表达 IPTG诱导后收获的细菌 , SDS2PAGE 分析可看
出经 IPTG诱导的细菌可大量表达一个 55 kD 的新
蛋白 ,而未经 IPTG诱导的细菌不表达 55 kD 的蛋白 (图 1 ) . 新 蛋 白 的 分 子 量 为 55 kD , 与 文 献 值 一 致[10 ,11] ,说明诱导表达成功. 同时取培养基浓缩后电 泳 ,发现未有 55 kD 蛋白出现 ,说明植物 ACC 合成酶 不以胞外分泌蛋白的形成存在.
In order to research the expression of recombinant protein in Escherichia coli plant ,ACC synthase was ex2 pressed with expression vector in E. coli (BL21) . Using SDS2PAGE and wave length2scan system ,the expressed protein was found increasing with the increase of time ,bacteria density and IPTG density. The best expressed time was two and half hours ,and the protein was expressed highly at bacteria density of OD600 = 016 with 016mmolΠL IPTG. The expression of solubility protein with SDS2PAGE electrophoresis was not found. Key words ACC synthase , SDS2PAGE , inclusion body
责任作者 :蒋湘宁 ,男 ,1958 年生 ,教授. 主要研究方向 :植物分子生物学. Email :jiangxn @bjfu. edu. cn 工作单位 :100083 北京林业大学生 物学院森林生物学实验中心
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
达 3 h 收获细菌 ,用 SDS2PAGE 分析结果见图 3. 从图 中可以看出 , OD600 越大 ,其诱导表达的蛋白总量越 多 ,但 OD600 为 016 ,诱导表达的蛋白量占全菌蛋白量 的比 例 最 大. 此 时 目 的 蛋 白 量 占 全 菌 蛋 白 量 的 2018 % ,当 OD600 为 016 时进行诱导表达是最佳条件.
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
第6期
陆 海等 :大肠杆菌 BL21 (DE3) 中表达重组蛋白的研究
3
213 诱导表达量与细菌密度的关系 当菌液长到 OD600 为 011 至 110 时加 IPTG诱导表
1 材料与方法
111 材 料 11111 菌株和质粒 大肠杆菌 BL21 (DE3) 、表达载 体 p ET214 b 为本实验室保藏. 11112 试 剂 异丙基硫代半乳糖苷 ( IPTG) 购于
2001202220 收稿 http :ΠΠwww. chinainfo. gov. cnΠperiodicalΠbjlydxxbΠ 3 国家自然科学基金重点项目 (39730350) 资助 3 3 第一作者 :陆海 ,男 ,1974 年生 ,博士. 主要研究方向 :植物分子生物学. 电话 :010262338063 , Email : hai2lu @263. net 地址 :100083 北京林 业大学生物学院森林生物学实验中心
图 1 融合蛋白的表达 1 为未诱导 2 IPTG诱导表达 M 标准蛋白分子量
FIGURE 1 Expression of recombinant protein
212 表达量与诱导时间的关系 将 37 ℃诱导培养 015 ,1 ,2 ,215 ,3 ,315 ,4 h 收获
的细菌 ,经 SDS2PAGE 分析的结果见图 2. 从图中可 以看出随着诱导时间的延长 ,其表达的总蛋白量逐 渐增加. 但在 215 h ,目的蛋白含量占全菌蛋白含量 之比为最大 ,约为 1617 %. 因此诱导表达 215 h 是最 佳诱导时间.
2
北 京 林 业 大 学 学 报
第 23ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ卷
Promega 公司 ,蛋白质分子量标准购自 Pharmacia 公 司 ,其他试剂均为国产或进口分析纯. 11113 培养基 LB 培养基 :胰蛋白胨 10 g ,酵母提 取物 5 g ,NaCl 10 g 溶于 1 L 蒸馏水中 ,高压灭菌 ,在 40 ℃加入卡拉霉素. 112 方 法 11211 SDS2PAGE 配 5 %的浓缩胶 ,1215 %的分离 胶. 取 1 mL 培养物 ,10 000 g离心 10 min ,沉淀重悬 于 100μL 还原型上样缓冲液中 ,沸水加热 20 min ,上 样 10μL[9] . 11212 ACC 合成酶的诱导表达 将重组质粒转化 大肠杆菌 BL21 (DE3) ,挑选阳性克隆培养 ,37 ℃震 荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基中培 养 ,当菌液长到 OD600 为 016 时 ,加入 IPTG 至终浓度 2 mmolΠL ,37 ℃诱导 3 h 后收获细菌. 同时收获培养 基并进行浓缩. 11213 表达量与时间的关系测定 将菌液于 37 ℃ 震荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基中培 养 ,当菌液长到 OD600 为 016 时加入 IPTG 至终浓度 1 mmolΠL ,37 ℃诱导培养 015 ,1 ,2 ,215 ,3 ,315 ,4 h 收获 细菌 ,然后用 SDS2PAGE 分析. 数据每组重复 3 次作 为平行 ,取其平均值. 以下所有数据均如此获得. 11214 表达量与细菌密度关系的测定 将菌液于 37 ℃震荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基 中培养 ,当菌液长到 OD600 为 011 ,012 ,013 ,014 ,015 , 016 , 017 , 018 , 019 , 110 时 加 入 IPTG 至 终 浓 度 1 mmolΠL ,分别于 37 ℃诱导培养 3 h 收获细菌 ,然后 用 SDS2PAGE 分析. 11215 表达量与 IPTG浓度关系的测定 将菌液于 37 ℃震荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基 中培养 ,当菌液长到 OD600 为 016 时分别加入 IPTG 至终浓度 012 ×10 - 4 ,012 ×10 - 3 , 012 ×10 - 2 , 0102 , 012 , 014 , 016 , 018 , 110 , 112 , 114 , 116 , 118 , 210 mmolΠL ,于 37 ℃诱导培养 3 h 收获细菌 ,然后用 SDS2 PAGE 分析. 11216 可溶性蛋白与包涵体分析 将细菌培养到 OD600 为 011 , 012 , 013 加 入 IPTG 至 终 浓 度 016 mmolΠL ,分别诱导表达 015 ,210 h ,取 5 mL 细菌离心 收集菌体 ,加入 50 μL TE 缓冲液 ,在冰浴中超声破 碎 ,离心 ,收集沉淀与上清 ,分别进行 SDS2PAGE 分 析.
第 23 卷 第 6 期 2001 年 11 月
北 京 林 业 大 学 学 报 JOURNAL OF BEIJ ING FORESTRY UNIVERSITY
Vol. 23 , No. 6 Nov. , 2001
大肠杆菌 BL21( D E3) 中表达重组蛋白的研究 3
陆 海 3 3 1) 吴 薇1) 曾庆银2) 李 义3) 蒋湘宁 1) 王沙生1)
a ACC 合成酶表达量与诱导时间的 SDS2PAGE 分析 (015 ,1 ,2 ,215 ,3 ,315 ,4 为分别诱导表达 015 ,1 ,2 , 215 ,3 ,315 ,4 h 全菌电泳图 , M 标准蛋白分子量)
时间Πh b ACC 合成酶表达量与诱导时间的关系曲线 图 2 ACC 合成酶表达量与诱导时间的关系 FIGURE 2 The relation of expression and induced time