固定化酶和固定化细胞

2022年高考生物总复习：固定化酶和固定化细胞
(1)固定化酶
①形成：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

②特性：与游离酶相比较，稳定性好，与底物和产物容易分离，易于控制，能反复多次使用；便于运输和贮存，有利于自动化生产。

(2)固定化细胞：是指固定在一定空间范围内的、能够进行生命活动并且可以反复使用的活细胞，又叫做固定化活细胞或固定化增殖细胞。

(3)固定技术
①概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

②方法(连线)
提示A—b—ⅠB—a—ⅡC—c—Ⅲ
③适用对象
一般来讲，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化，这是因为个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶则易从包埋材料中漏出。

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酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。

（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。

（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。

（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。

b.提高了果糖的产量和品质。

2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。

（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。

二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。

葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。

〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。

活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。

2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。

注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。

张 海 龙山东教育学院 生物系Shan Dong Institute of Education第九章　第九章　固固定化酶与固定化细胞技术第一节固定化酶•固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。

•酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比）•（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；•（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化；•（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性；•（4）酶的反应过程能够严格控制；•（5）酶的利用率提高，生产成本降低；•（6）能够进行多酶反应；•（7）可以增加产物收率，提高产物的质量；•（8）增加了生产的成本；•（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法•根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则：–（1）必须维持酶的催化活性以及专一性；–（2）有利于实现连续化和自动化；–（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量；–（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用；–（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应；–（6）成本要低，以便于工业使用；实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。

•（一）包埋法：–1、网格型–2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法•（二）吸附法：–1、物理吸附法–2、离子吸附法•（三）、共价偶联法•（四）、交联法•（五）、共价结合法–1、结晶法–2、分散法酶固定化方法示意图二、固定化酶的性质1、稳定性2、最适温度最适pH pH3、最适4、底物特异性go稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度2040608010030405060708090Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A BA 固定化酶B 游离酶稳定性(续)（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂）对变性剂((如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等))的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pH pH pH稳定性提高稳定性提高稳定性提高..(back back))最适温度与游离酶差不多050100150200250300350304050607080Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A B最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，5-10℃;比游离酶高比游离酶高5-105-15 ℃以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为30 ℃同一种酶;80 ℃，比固定化前提高了，比固定化前提高了30用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 <60烷基化法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 67离子键结合法DEAE-DEAE-纤维素纤维素 72离子键结合法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60游离最适温度最适温度((℃ ） 方法载体载体最适pH 值酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pH pH pH和酶和酶—pH pH曲线常发生偏曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响带负电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH 的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的低H +H +H +H +H +H +H +偏酸微环境OH -OH -OH -OH -OH -OH -H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH 值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH 值的影响酸性酸性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值一般不变值一般不变原因原因::载体障碍产物的扩散底物的特异性与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关;;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等;;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。

固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。

只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。

是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。

常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。

离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。

最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。

离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。

影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。

2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。

3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。

4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。

5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。

6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。

多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。

吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。

吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。

（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。

(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。

固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。

作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。

由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。

但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。

由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。

酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。

由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。

如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。

从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。

随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。

对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。

一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。

第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。

目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。

⏹第三章固定化酶与固定化细胞⏹第一节概述⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素⏹第三节固定化酶的制备⏹第四节固定化细胞⏹第五节固定化辅酶和原生质体⏹第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用⏹第一节概述⏹什么是固定化酶？⏹第一节概述二．固定化酶的优缺点⏹多次使用⏹可以装塔连续反应⏹优点：纯化简单⏹提高产物质量⏹应用范围广⏹缺点：首次投入成本高⏹大分子底物较困难⏹第一节结束⏹点击返回⏹第二节固定化酶的性质及其影响因素⏹一．影响固定化酶性质的因素⏹二．固定化后酶性质的变化⏹三．评价固定化酶的指标⏹一．影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。

⏹二．固定化后酶性质的变化⏹1．固定化对酶活性的影响：⏹酶活性下降，反应速度下降2．固定化对酶稳定性的影响⏹稳定性提高（原因）⏹3．pH的变化（原因）⏹载体带负电荷，pH向碱性方向移动。

⏹载体带正电荷，pH向酸性方向移动。

⏹催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离⏹酶的pH值高；反之则低⏹固定化后酶稳定性提高的原因：⏹ a. 固定化后酶分子与载体多点连接。

⏹ b. 酶活力的释放是缓慢的。

⏹ c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。

⏹PH 对酶活性的影响：⏹（1）改变酶的空间构象⏹（2）影响酶的催化基团的解离⏹（3）影响酶的结合基团的解离⏹（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。

⏹4．最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。

5．底物特异性变化⏹作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化⏹既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶⏹特异性往往会变化。

6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（链接）⏹米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境Km'=Km/ρ(表观米氏常数)⏹（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。