第十章 固定化酶与固定化细胞技术

酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固 定化酶的过程。
固定化酶的形状： 颗粒---工业发酵 线条----工业发酵 薄膜---酶电极 酶管---工业生产（机械强度大）
固定化酶的特点
优点：1.可多次使用，且酶的稳定性提高。 2.反应后，酶易与底物和产物分开。 3.反应条件易于控制 。
缺点：1.费用太高。 2. 大分子的底物不易使用。
? 4．温度：通常随 温度升高而增加酶的吸附 ， 但温度升高会造成酶失活的加速。
? 5．吸附速度： 酶在固体支持物上吸附速度 比较缓慢, 是由于酶的扩散速度较低所致。
? 6．载体：影响酶活力的重要因素是载体 表 面积、多孔度及载体的预处理 。
（三）共价结合法
? 酶蛋白分子上功能团和固相支持物上的 反应基团之间形成化学共价键的方法。
一、固定化酶制备的方法
? 固定化酶的制备方法大致可分为4类： ①吸附法；
? ②共价结合法； ? ②交联法； ? ④包埋法。
（一）包埋法
? 它是一种用物理方法将酶包埋在高聚物 内，反应条件温和．并且不改变酶结构 的固定化方法。
? 包埋法又可分为 ? （1）网格型； ? （2）微囊型；
? 1．网格型：材料有聚丙烯酰胺、三醋 酸纤维、淀粉、硅胶、血纤维和胶原等。
第十章 固定化酶与固定化细胞
? 固定化酶技术从20世纪60年代发展的，被广泛应用于 酿造、食品、医药领域。
? 广义的固定化酶包括：
?
固定化辅酶
?
固定化细胞
?
固定化细胞器
? 一般来说，对于一步活两步转化过程用固定化酶较合 适；对多步转化，用整细胞。
第一节固定化酶
固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存 在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可 以回收重复使用。
胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、白土、 羧基磷灰石等； ? 有机载体：淀粉、离子交换树脂、琼脂 糖的烷基衍生物等；
（2）离子吸附法
? 酶通过离子键吸附于有离子交换基的载 体的固定化方法。
? 阴离子交换剂： DEAE-纤维素， DEAE- 葡萄糖凝胶等
? 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等
离子吸附法
? 优点： ? 1.操作简单； ? 2.条件温和； ? 3.回收率高； ? 缺点： ? 酶易脱落；
蛋白质在载体上的吸附和解吸与下列因素有关。
? 1．pH ：PH 能影响载体蛋白质的电荷，
从而影响菌在载体上的吸附。一般情况 下，在蛋白质的等电点可以达到最大吸 附。 ? 2．盐：一般认为盐阻止吸附，盐也被 用来洗脱从低盐溶液中吸附的酶。 盐可以促进蛋白质吸附在惰性支持物上， 即称“盐析”吸附。
? 3. 酶浓度：一般在一定量载体上的吸附，总 是随酶浓度的增加而增加，直到饱和。
三、影响固定化酶的因素
酶本身的变化 影响固定化酶的因素
载体的影响
第二节 辅酶和辅基的固定化
原因 ? 辅酶固定化 方法
形式
辅酶固定化原因
? 2．微囊型：悬浮液被包裹在膜内，使 酶存于类似细胞的环境中，阻止了酶的 脱落。小分子底物则能迅速通过膜与酶 作用，产物扩散出来。
（二）吸附法
含酶水溶液和吸附剂接触，经洗涤除去 不吸附的酶便能制得固定化酶。 吸附法包括： ? （1）物理吸附法； ? （2）离子吸附法；
（1）物理吸附法
常用吸附剂： ? 无机载体：高岭土、膨润土、磷酸钙凝
功能团: ? 酶分子N端:α-氨基，ε-氨基． ? 酶分子C端: 羧基、疏基、羟基、苯环
等。
? 优点：wenku.baidu.com
? 酶和载体之间的连接很牢固，不会发生酶的 脱落，稳定性较好 。
? 缺点:
? 1.载体的活化或固定化 操作比较复杂，反应条 件也比较剧烈。
? 2. 若共价结合包含酶活性中心有关的基团， 会导致酶的活力损失 。
（二）最适pH的变化
影响固定化酶最适 pH因素主要有两个： 1.载体的带电性质 ；
负电的载体固定化酶，最适pH比游离酶高； 正电的载体固定化酶，最适pH比游离酶低； 电中性的载体固定化酶，最适pH一般不改变。
2.酶催化反应的产物性质。
产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶高； 产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低； 产物为中性时，最适pH一般不改变。
固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为 细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。
特点： 1. 无需进行酶的分离和纯化。 2. 细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。 3. 酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4. 保持酶的原始状态，酶的回收率高。 5. 抗污染能力强。
(四) 交联法
? 是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的 交联形成共价键,得到交联网架结构的方 法。
? 最常用的交联试剂是戊二醛，还有双重 氮联苯胺等。
以戊二醛为例说明如下 ：
（五）非共价结合法
? 对于在水不溶的有机相中进行的反应。 ? 包括： ? 1.结晶法—使酶结晶而实现固定化的方
法。 ? 2.分散法—将酶分散于水不溶相中实现
（三）最适温度变化
1.固定化酶的最适作用温度一般与游离 酶差不多，活化能也变化不大。
2.由于固定化后，酶的热稳定性提高， 所以最适温度也随之提高。
（四）固定化酶稳定性
? 固定化酶对热、各种变性剂的耐受性增 强，稳定性提高。
固定化酶稳定性提高的原因： ? 1. 酶分子与载体多点连接，可防止酶变
形； ? 2. 酶活力的缓慢释放； ? 3. 抑制酶的自降解；
载体的性质对固定化酶有很大影响：
? 1.载体应是亲水的，疏水载体与有机溶剂相同 的变性影响。
? 2. 载体也要求有一定的机械强度和稳定性。 ? 3.载体须具备能在温和条件下与酶结合的功能
团。 ? 常用的载体包括 : ? 1)天然高分子 (纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚
糖凝胶、胶原及其衍生物等 )， ? 2)合成高聚物 (尼龙、多聚氨基酸等 ) ? 3)无机支持物 (多孔玻璃、金属氧化物 )。
固定化的方法。
二、固定化酶的性质
（一）固定化酶的活性 ? 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降。 ? 原因： ? 1.酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 ? 2.空间位阻影响底物与酶的定位作用。 ? 3.内扩散阻力影响底物与酶的接触。 注： ? 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定
性增加。