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固定化酶与固定化细胞

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固定化酶和固定化细胞

固定化酶和固定化细胞

2022年高考生物总复习：固定化酶和固定化细胞
(1)固定化酶
①形成：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

②特性：与游离酶相比较，稳定性好，与底物和产物容易分离，易于控制，能反复多次使用；便于运输和贮存，有利于自动化生产。

(2)固定化细胞：是指固定在一定空间范围内的、能够进行生命活动并且可以反复使用的活细胞，又叫做固定化活细胞或固定化增殖细胞。

(3)固定技术
①概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

②方法(连线)
提示A—b—ⅠB—a—ⅡC—c—Ⅲ
③适用对象
一般来讲，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化，这是因为个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶则易从包埋材料中漏出。

第1页共1页。

酶与细胞的固定化

酶与细胞的固定化
变化少，因而酶活力损失很少。 参与交联的基团有: a-氨基, -NH2（Lys）, -SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。

酶与细胞的固定化课件.ppt

酶与细胞的固定化课件.ppt

采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。

酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿

酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿
(3) 偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
酶与蛋白质工程固定化酶与固 定化细胞演示文稿
当前第1页\共有48页\编于星期五\13点
（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
当前第2页\共有48页\编于星期五\13点
固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
当前第3页\共有48页\编于星期五\13点
固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
当前第17页\共有48页\编于星期五\13点
例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶

固定化酶与固定化细胞

固定化酶与固定化细胞

(2) 共价结合法
此法得到的固定化 酶结合牢固、稳定 性好、利于连续使 用，因此它是目前 应用最多的一类固 定化酶的方法。
借助共价键将酶的活性非 必须侧链基团或细胞表面 基团（如氨基、羧基、羟 基、巯基、咪唑基等）和 载体的功能基团进行偶联 以达到固定化目的方法。
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性 好、利于连续使用。 共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激 烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化 活性产生影响。
ro
rb
NaCS
ri
NaCS
ra
固定化酶的制法及其特性比较
特性
共价键 结合法
制备方法
离子 结合法
交联法
物理 包埋法 吸附法
制法 酶活力 底物特异性
难 高 易变
结合能力 再生
强 不可
易 高 不变
难 中 易变
中 可能
强 不可
易 低 不变
弱 可能
难 高 不变
弱
不可
固定化酶的保存方法
一．真空冷冻干燥保存（长期保存） 二．低温保存 三．多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体
含羟基的载体可用三氯 三嗪等多卤代物进行活 化，形成含有卤素基团 的活化载体。
D．硅烷化法
多孔玻璃特点： 机械强度好，表面积大。 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿
命长等。
D．硅烷化 法
一般常用的载体：多 孔玻璃，多孔陶瓷。
D
． 硅 烷 化 法
D
． 硅 烷 化 法
D．硅烷化 法
E ．溴化氰法
大小 和总吸附面积的大小。

固定化酶和固定化细胞技术

固定化酶和固定化细胞技术

张 海 龙山东教育学院 生物系Shan Dong Institute of Education第九章　第九章　固固定化酶与固定化细胞技术第一节固定化酶•固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。

•酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比）•（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；•（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化；•（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性；•（4）酶的反应过程能够严格控制；•（5）酶的利用率提高，生产成本降低；•（6）能够进行多酶反应；•（7）可以增加产物收率，提高产物的质量；•（8）增加了生产的成本；•（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法•根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则：–（1）必须维持酶的催化活性以及专一性；–（2）有利于实现连续化和自动化；–（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量；–（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用；–（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应；–（6）成本要低，以便于工业使用；实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。

•（一）包埋法：–1、网格型–2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法•（二）吸附法：–1、物理吸附法–2、离子吸附法•（三）、共价偶联法•（四）、交联法•（五）、共价结合法–1、结晶法–2、分散法酶固定化方法示意图二、固定化酶的性质1、稳定性2、最适温度最适pH pH3、最适4、底物特异性go稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度2040608010030405060708090Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A BA 固定化酶B 游离酶稳定性(续)（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂）对变性剂((如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等))的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pH pH pH稳定性提高稳定性提高稳定性提高..(back back))最适温度与游离酶差不多050100150200250300350304050607080Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A B最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，5-10℃;比游离酶高比游离酶高5-105-15 ℃以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为30 ℃同一种酶;80 ℃，比固定化前提高了，比固定化前提高了30用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 <60烷基化法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 67离子键结合法DEAE-DEAE-纤维素纤维素 72离子键结合法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60游离最适温度最适温度((℃ ） 方法载体载体最适pH 值酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pH pH pH和酶和酶—pH pH曲线常发生偏曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响带负电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH 的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的低H +H +H +H +H +H +H +偏酸微环境OH -OH -OH -OH -OH -OH -H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH 值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH 值的影响酸性酸性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值一般不变值一般不变原因原因::载体障碍产物的扩散底物的特异性与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关;;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等;;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。

固定化酶与固定化细胞 ppt课件


• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
ppt课件
4
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
ppt课件
5
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
ppt课件
17
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
ppt课件
18
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
ppt课件
23
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
ppt课件
24
交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
11
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
ppt课件
12
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。

固定化酶和固定化细胞课件

硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
11
离子吸附法 ?离子吸附法 (ion adsorptio是n)通过离子键使酶与含
有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化 方法。 ?此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、 β-淀粉 酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。
12
? 离子吸附法常用的载体： ?阴离子交换剂： DEAE纤- 维素、四乙氨基乙基
响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反 复使用。 ? （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固 定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中 不易破坏或受损。
6
? （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 ? （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，
所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反 应。 ?1）凝胶包埋法 ?将聚合物的 单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂 )的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ?凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等 天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等 合成 凝胶或树脂 。
15
? （2）微胶囊包埋法 ?微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的 半 透膜微胶囊 内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
21
?（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
? 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
?（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。

第五章-固定化酶


2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。

固定化酶与固定化细胞

固定化多酶反应
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
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9
优点：
(1)可提高稳定性。
(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。
缺点：
(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。
(2)酶活性下降。
10
2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间范围内进行
生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。
11
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
不变
强度
差
天然凝胶 琼脂、海藻酸钙、温和
聚合反应
部分失活 高
28
交联树脂
海藻酸钙凝胶包埋法：
滴至 海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中 角叉菜胶包埋法： 滴至 角叉菜胶＋E (or cell) 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： Acr+ Bis+E (or cell) AP KCl 溶液中 IE (or IC) IE(or IC)
TEMED
IE (or IC)
29
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
网格型
微囊型
14
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，
使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂
上。
15
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM纤维素
24
交联反应既能发生在分子间，也可
发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
25
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团
被交联，酶活力损失大。
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用
带来不便。
26
4. 包埋法（entrapment）
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
4
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度； ②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
5
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
四 原生质体的固定化方法
6
一、固定化酶和细胞的定义及特点
1.固定化酶(immobilized enzyme) 通过化学或物理的手段将酶定位于限 定的空间区域内，使其保持活性并可反复 利用。
7
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
8
酶固定化方法要求
①不破坏酶活性中心的构象：酶的固定化不能破坏 酶活性中心的构象，尽量防止活性部位的氨基酸 残基受到影响； ②载体要求： a.固定化的载体应与酶结合较为牢固。 B.载体不能与底物、产物等发生化学反应。 C.载体必须有一定的机械强度，防止因机械搅拌而 破碎。 ③位阻应该较小：尽可能不妨碍酶与底物的接近。 ④成本低：酶固定化的成本要尽可能的低。
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。 •酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
20
常用的偶联反应有：重氮化法、叠 氮法、溴化氰法、烷基化法等。
21
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。 •缺点：反应条件较激烈，易影响酶
12
3.固定化原生质体
意义：
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
13
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
物理 吸附法
离子交 换吸附
的空间构象而影响酶的催化活性。
22
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交
联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的 — CH2 — CH2 — C — H
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戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为：
网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
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1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
角叉菜胶、明胶
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光
包埋条件
酶活性
本章讲授
①固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包 埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基 本技术和原理； ②细胞固定化的基本技术和原理； ③简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因 子的固定化方法和辅酶的再生体系。
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游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有
机溶剂对其有影响）。
2.不能回收，使用成本高。
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优点：条件温和，操作简 便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解吸 附。
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2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling） 借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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1）载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙 19
3.酶在游离体系中更容易自水解
4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白
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• 固定化酶（定义）：用物理或化学手段定位在限 定的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利 用的酶。（1971年在美国召开的第一届国际酶工程会议） • 固定化细胞（定义）：将具有一定生理功能的生 物细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的 方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用 的一门技术。