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第4章四 固定化酶的性质

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[生物学]第4章四 固定化酶的性质

[生物学]第4章四 固定化酶的性质


可能是偶联过 程中酶得到化 学修饰．或固 定化过程提高 了酶的稳定性。
(二)固定化对酶稳定性的影响
稳定性实际
30 25 20 15 10 5 0 提高 不变 降低 12 8 固定化酶数 30
应用

大多数情况下酶经过 固定化后其稳定性都 有所增加。
Merlose选择50种固定化 酶测试稳定性

稳定性提高方面:



热稳定性提高 保存稳定性好 对蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解 对变性剂的耐受性提高,可耐受尿素、有机 溶剂和盐酸胍等蛋白质性剂的作用。 对不同pH稳定性提高
A 热稳定性
B有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高

提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性， 使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成 为可能。固定化酶在有机合成中应用会进 一步发展。
1、固定化后最 适pH升高了 2、pH稳定性增强
最适pH偏移的原因

载体带电荷影响酶所在微环境
结果
•带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化 酶，其最适pH较游离酶偏高。 •使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。

产物对最适pH的影响 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍， 使反应产物向外扩散受到一定限制。
催化反应产物为酸性（H+）， 则最适pH比游离酶高（需 OH-中和）反之则偏低，中性 则不变。
+ + +
+
（五）底物特异性

由于存在空间位阻，可能不再作用于分子 量较大的底物，只对小分子量底物有效。 例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质， 又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在 羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保 持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的 3%左右。
酶的固定化

酶的固定化


固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
固定化酶

固定化酶



⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)

第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂

绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。

解决办法??
第一节


酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点


固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应


固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
固定化酶

固定化酶


微型胶囊法制备固定化酶有两种方法
① 界面沉淀法
这是一种简单的物理法，它是利用某些高 聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低 而形成的皮膜将酶包埋。
②界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界 面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起 来。
2、吸附法
I 物理吸附法
• 静止法 • 电沉积法 • 反应器上直接吸附法 • 混合浴或振荡浴吸附法
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
3.
4.
或称偶联效率，活力保留百分数。
5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
（四）固定化酶的活力测定方法
1. 振荡测定法： 2. 酶柱测定法： 3. 连续测定法
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
4.11第四章酶与细胞的固定化

4.11第四章酶与细胞的固定化

载体上的功能基团与酶分子上的侧链基团间 往往不具有直接反应的能力 在偶联反应前，需先进行载体活化，在载体 上引进某种活泼基团，然后再与酶分子上某 一基团反应形成共价结合。
3. 交联法
借助双功能或多功能试
酶
剂在酶分子间、酶分子与
载体间进行交联反应，形成网状结构的固化酶常用试剂：戊二醛、己
二胺等
合成胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂
1. 凝胶包埋法 (gel entrapment)
② 制备方法 以合成胶为载体（易失活，强度高）： 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： ➢ 丙烯酰胺单体和N,N’-甲叉双丙烯酰胺溶于水 中，加入酶液混合均匀聚合 ➢ 加入TEMED和AP，静置至聚合完全 ➢ 将凝胶切成小块，生理盐水清洗残余游离酶。
不能 低 不变
较难 强 中等
不能 中等 可变
二、固定化酶的性质
影响酶的性质的因素： 构象改变和立体屏蔽 微扰效应、分配效应和扩散限制效应
1. 固定化酶的活力
不变/下降 解决办法：避免损害或屏蔽酶的活性中心，加入
抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心；引入 连接臂。 例：乳糖酶的固定化就采用在其抑制剂葡萄糖-内酯存在下进行聚丙烯酰胺凝胶的包埋，如此可 获得高活力的固定化乳糖酶。 固定化后活力会否提高？？
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强生稳豪倍易血糖仪
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß-D-葡萄糖＋O2
D-葡萄糖酸-1, 5-内酯＋H2O2
第四章 酶与细胞的固定化
（1）物理吸附法 ➢ 常用载体
固定化酶的性质与评价

固定化酶的性质与评价


四、固定化酶的形状与性质
2. 固定化酶的性质
（2）酶稳定性的变化：固定化后，稳定性提高，有效寿命延长
对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。
固定化限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型 的牢固程度。
四、固定化酶的形状与性质
2. 固定化酶的性质
（2）酶稳定性的变化：
操作稳定性
四、固定化酶的形状与性质
2. 固定化酶的性质
（3）酶学特性的变化：
底物专一性
对底物的专一性下降
最适pH
最适pH可能变大，也可能变小； pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关
四、固定化酶的形状与性质
2. 固定化酶的性质
（3）酶学特性的变化：
最适温度
一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定
四、固定化酶的形状与性质
2. 固定化酶的性质
（2）酶稳定性的变化：
热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率
四、固定化酶的形状与性质
2. 固定化酶的性质
（2）酶稳定性的变化：
对蛋白酶的稳定性
大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受里力有所提高。 可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部
生物技术制药
四、固定化酶的形状与性质
四、固定化酶的形状与性质
1. 固定化酶的形状
颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。 每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化 效率高，适用各种反应器。
纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就 可制成酶纤维。 比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器
食品酶学 第四章固定化酶和固定化细胞

食品酶学 第四章固定化酶和固定化细胞


3
固定化酶的优点：
(1) 固定化酶在较长时间内可反复使用，使酶的使用效率 提高，使用成本降低。 (2) 固定化酶极易与反应体系分离，产物溶液中没有酶的 残留，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好。
(3)酶经固定化后，稳定性得到提高。
(4) 固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的 方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化 操作。 (5)固定化酶的催化反应过程更易控制。 (6)固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用。
最大反应速度等均与游离酶有所不同。
认真学习课本相关内容，回答问题。
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（1）底物特异性
固定化酶的底物特异性与底物分子
量的大小有一定关系。一般来说，当酶的底物为小分
子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不 发生变化。
21
（2）反应的最适pH
酶被固定后，其最适pH和pH曲线
常会发生偏移，原因可能有以下三个方面：一是酶本身
8
酶的固定化方法有几类？
四类：吸附法、包埋法、
共价键结合法和交联法。 对于特定的目标酶，要 根据酶自身的性质、应 用目的、应用环境来选 择固定化载体和方法。
9
4.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶分子表面间的
次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简
4.4.4固定化酶的稳定性
游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而固定化酶的稳定
性一般都比游离酶提高得多，主要表现在如下几个方面： （1）操作稳定性 （2）贮藏稳定性 （3）热稳定性 （4）对蛋白酶的稳定性 （5）酸碱稳定性
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4.4.5 固定化酶的反应特性
最新：第4章 固定化酶和固定化细胞-文档资料

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有些情形下，由于产物分子在靠近膜面的位置逐渐积 聚而形成凝胶层，造成酶膜反应器中严重的产物抑制 降低了生产效率。 浓差极化和膜污染使酶膜反应器的传质速率和生产能 力急剧下降，膜孔堵塞、膜厚增加使膜的结构形态发 生不利变化，膜需要频繁地清洗或更换。
4.5.3.3 膜式反应器的应用
酶膜反应器把酶促反应与膜的选择性物质传递 有效地结合在一起，从而创造出有利的过程热 力学和动力学，在生物、医药、化工、环境等 领域得到了越来越广泛的应用。目前膜反应器 的应用主要有：辅酶或辅助因子的再生、有机 相酶催化、手性拆分与手性合成、反胶团中的 酶催化、生物大分子的水解等。
与酶的固定化相比，固定化细胞保持了胞内酶系 的原始状态与天然环境，有效地利用游离细胞完 整的酶系统和细胞膜的选择通透性，既具有固定 化酶的优点，又具有其自身的优越性：
固定化细胞的优越性
①无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损 失，同时大大降低了成本； ②可进行多酶反应，且不需添加辅助因子，固 定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而 且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列 的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再 生容易；
固定化细胞的优越性
③对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶 的稳定性更高，对污染的抵抗力更强； ④细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。 正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势， 尽管其出现远远晚于固定化酶，但其应用范围 比固定化酶更为广泛。
当然，固定化细胞也有其自身的缺点，如：必须 保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响 产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的 分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、 细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。
（2）酶膜反应器可将目的产物分离出去，而 酶可以重复利用，可实现连续操作，并有可 能提高复杂反应的选择性。 （3）膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似 生物膜的环境中高效发挥作用。
四 固定化酶的性质

四 固定化酶的性质


固定化后酶稳定性提高的可能原因


固定化后酶分子与载体多点连接．可防止 酶分子伸展变形。 酶活力的缓慢释放。 抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合， 由于酶失去了分子间相互作用的机会，从 而抑制了降解。
(三)固定化酶的最适温度变化



酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综 合结果。 由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温 度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤 亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度 为80℃，比固定化前提高了30℃。 也有的固定化后会降低 固定化的最适温度受固定化方法和固定化载体的 影响。
二、固定化细胞的制备



固定化酶的方法大部分适合于微生物细胞 的固定化。 可采用微生物自身的絮凝能力来制备无载 体固定化细胞。 要求保持高的活力保留和具有操作稳定性。
几种方法的特点




化学法(共价交联)涉及菌或细胞的化学修饰。由于所用化学 药品的毒性，可引起细胞破坏。因此，反应耍在尽可能温和 的条件下进行。在使用中细胞间、细胞和载体间的键不易被 底物或盐所破坏，操作稳定性高。 吸附螯合法条件温和、方法简便，但载体和细胞间吸附力弱， 操作时细胞易从载体脱落，特别是底物分子量高，介质的离 子强度和pH变化情况下更是如此，所以操作稳定性差，但优 点是可再生。 包埋法从理论上来说细胞和载体间没有束缚，固定化后应保 持高活力，然而实际上限制酶活力的因素较多，且这类方法 只适于小分子底物。要固定活细胞、增殖细胞，显然包埋法 占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。 交联法没有良好机械强度．所以不适于实际应用。但可得到 高细胞浓度，大多数情况难于再生。
(四)固定化酶的最适pH变化
食品酶学课件本第四章固定化酶

食品酶学课件本第四章固定化酶


第四章 固定化酶
一、固定化酶的概念 二、固定化技术的兴起与发展 三、酶和菌体的固定化方法 四、固定化酶的特性 复习题
距您钩匪这狈唆玲斗删换禹攒家霸釉勿佰疡穴溃处汞眩咋边架些镶壁愚疗食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。示意图 酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合，使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。固定化酶具有稳定性增加、可反复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。 固定化所用的酶可以是经提取分离后得到的一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。相应地，前者称为固定化酶，后者称为固定化菌体或固定化死细胞。可见，固定化菌体是固定化酶的一种形式，它不像固定化活细胞（或称固定化增殖细胞）那样，固定化菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。
碉标磋冗效螺蔡鸣草菏污胳犹躁拎帽脊面奠验惟掣祸七咯颤殊谎榷愚杨弓食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
三、酶和菌体的固定化方法
（一）吸附法 （二）包埋法 （三）结合法 （四）交联法 （五）热处理法 各固定方法的特点与比较 酶固定化方法示意图
苹届租懈邢蔬披凝愿懒纫馁蛀歹圆狰寅恕畦塑弘侗败综迢唾栗磨湘眩撒桔食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
（一）固定化酶的形状
固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数。 颗粒和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应； 薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学； 酶管机械强度怯株躺昌休工授格蹈弄君嗓洲赠滤拘齐粥哩琅骚婴葵烯羹业食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
第四章 固定化酶

第四章 固定化酶

第四章固定化酶固定化酶的是指是具有催化活性蛋白质的固定化，因此固定化酶一般为具有各种性状的颗粒，其反应过程必须在颗粒水平上进行描述和表达。

它的显著特征是：在描述其反应过程动力学时，必须包含有反应物系从液相主体扩散到颗粒内、外表面的传递速率的影响。

第一节固定化酶概论酶的催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点，但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。

为了克服这些问题，20世纪60年代酶固定化技术应运而生。

它是模拟体内酶的作用方式（体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应），通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。

固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971年酶工程会议上被推荐使用的。

Trevan在1980年给出了固定化酶的定义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后使其不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。

其实，固定化酶并不是新的物质，例如，胞内酶是在细胞内起作用的，类似于用包埋方法制成的固定化酶。

因此，固定化酶研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近其原始状态下进行的反应。

对各种酶的固定化技术进行积极的研究与开发始于20世纪50年代，通过重氮化共价结合法将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等固定在聚氨基苯乙烯树脂上；1963年，利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶；1969年，日本的一家制药公司首次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。

通常的生物催化剂，如酶或细胞同其它溶质一样，分散在溶剂或溶液中，可以自由移动，称为游离酶或游离细胞。

若通过固定化技术将酶固定于载体表面或其内部，则与液相主体相分离，形成了固定化生物催化剂，即固定化酶。

固定化酶


究，并第一次实现了酶的固定化。

1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化 研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这 是世界上固定化酶用于工业的开端。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆
操作简单 处理条件温和 酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏
酶活回收率较高
离子结合法缺点：
载体和酶的结合力比较弱 容易受缓冲液种类或pH的影响
在离子强度高的条件进行反应时，酶易从载体上脱落
3．共价结合（偶联）法：
酶以共价键结合于载体的固定化方法，即将酶分 子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进 行共价结合的方法。
二、固定化酶的性质
酶的稳定性高，易从反应系统中分离，且易
于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存， 有利于自动化生产。
固定化酶的应用
在工农业生产、医药治疗、分析化学中都有
应用。
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
表 酶的各种固定固定化方法比较
载体结合法 固定化方 物理吸附法 离子结合 法 法 制备难易 结合程度 易 弱 易 中等
菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。
固定化酶的优点：
①酶的稳定性得到改进； ②酶可以反复利用； ③可以管道化，连续化及自动化； ④酶与产物易于分开，产物容易提纯； ⑤反应所需的空间小；
固定化酶的缺点：
①固定化时，酶活力有损失； ②增加了生产的成本，工厂初始投资大； ③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子 底物，对大分子底物不适宜； ④与完整菌体相比不适于多酶反应，特别是需 要辅助因子的反应； ⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。

酶的固定化


(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的 水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附 较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离 子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺 类（ECTEDLA）—纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)—纤维 素、DEAE—葡聚糖凝胶、Amberlite IRA—93、410、 900等。阳离子交换剂基，如羧甲基(CM)—纤维素、纤 维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、 Dowex—50等。
载体的选择
载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般 要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③载体必须含有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 ④载休没有或很少有非专一性吸附。 ⑤载体来源容易、便易、并能反复使用。
E.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y—氨基丙基三氧 乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:
烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍 生物:
此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合．产生固定化酶。
取代反应 具有卤素取代的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，在 碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应，如： 将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴 乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：
His
Lys
A. 多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-β-硫酸脂 乙砜基胺(ABSE—)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼 脂及淀粉) 载体。在碱性条件下用对-β-硫酸脂乙砜基胺活化多 糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：
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固定化细胞的缺点ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ



利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存 在，会形成不需要的副产物； 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用; 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通 透性
一、固定化细胞分类
分类方式 细胞类型 固定化细胞 微生物细胞 植物细胞 动物细胞 生理状态 死细胞 活细胞 完整细胞、细胞碎片、 细胞器 增殖细胞、静止细胞、 饥饿细胞
1、固定化后最 适pH升高了 2、pH稳定性增强
最适pH偏移的原因

载体带电荷影响酶所在微环境
结果
•带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化 酶，其最适pH较游离酶偏高。 •使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。

产物对最适pH的影响 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍， 使反应产物向外扩散受到一定限制。
合成方法

合成方法是利用天然高分子材料包埋 磁性微粒,或在磁流体存在下进行聚合 反应, 均可得到纳米级的磁性微球
2 其它新型载体



导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶 电极类生物传感器的制备。 光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定化酶时, 条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。 N - 异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得 到温敏性水凝胶载体, 用于固定嗜热菌蛋 白酶时可实现均相催化和异相分离的统一
催化反应产物为酸性（H+）， 则最适pH比游离酶高（需 OH-中和）反之则偏低，中性 则不变。
+ + +
+
（五）底物特异性

由于存在空间位阻，可能不再作用于分子 量较大的底物，只对小分子量底物有效。 例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质， 又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在 羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保 持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的 3%左右。
活力回收



活力回收也可称为有效系数、活力保留百 分数、偶联效率，它表示影响酶固有性质 诸因素的综合效应。 静态有效系数(η)是在起始速度条什下测 得的活力回收。 操作有效系数(η’)是在生产设备所要求的 条件下测量的，是固定化酶制剂实用性的 最有效数据之一。



η(或η’)＝1表示反应控制良好，固定化或 扩散引起的酶活力损失不明显(这种可能 性不大)。 η(或η’)＜1表示固定时有损失，扩散限制 有影响。 η(或η’)＞1可能发生在个别情况。原因可 能是固定化活细胞的增殖或抑制因素的排 除。
2 偶联率及相对活力的测定


用于表征影响酶固有性质诸因素的综合效 应及固定化期间引起的酶失活. 固定化酶的活力回收是指固定化后固定化 酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当 量游离酶(细胞)总活力的百分数。



活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总 活力x100％ 偶联率＝(加入蛋白活力-上清液蛋白活力) ／加入蛋白活力x100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的 总活力-上清液中未偶联酶活力)x 100％
测定方法
活力可在两种基本系统——填充床或均匀 悬浮在保温介质中进行测定。 ①间歇测定 在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样 测定条件下(如均匀悬浮于保温的介质中) 进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按 常规进行测定。 如搅拌速度过快．会由于固定化酶破碎而造 成活力上升。

②连续测定 固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以 不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根 据流速和反应速度之间关系，算出酶活力 (酶的形状可能影响反应速度)。在实际应 用中，固定化菌不一定在底物饱和条件下 反应，故测定条件要尽可能与实际工艺相 同，这样才能利于比较和评价整个工艺。
4.5固定化酶和固定化细胞的表征
一、评价固定化酶(细胞)的指标 1. 固定化酶(细胞)的活力 2. 偶联率及相对活力的测定 3. 固定化酶(细胞)的半衰期
1固定化酶(细胞)的活力

固定化酶(细胞)的活力即是固定化酶(细胞)催化 某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条 件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。 固定化酶(细胞)的单位可定义为每毫克干重固定 化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μmol· -1mg-1。如是酶膜、酶管、酶 min 板．则以单位面积的反应初速度来表示．即 μmol· -1cm2。表示固定化酶的活力一般要注 min 明下列测定条件：温度、搅拌速度、固定化酶的 于燥条件、固定化的原酶含量或蛋白质含量及用 于固定化酶的原酶的比活力。
4.3 固定化细胞

固定化细胞就是被限制自由移动的细胞， 即细胞受到物理化学等因素约束或限制在 一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活 性并具有能被反复或连续使用的活力。这 是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。
固定化细胞比固定化酶优越点



固定化细胞保持胞内酶系的原始状态与天 然环境，因而更稳定。 固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统， 这对于多步催化转换，如合成干扰素等， 其优势更加明显，而且无需辅酶再生。 还可固定化增殖细胞.
四 固定化酶的性质


固定化常常是一种化学修饰，酶本身的结 构受影响。 酶固定化后．其催化作用由均相移到异相， 由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载 体性质造成的分配效应等因素必然对酶的 性质产生影响。
空间障碍
扩散限制

浓度梯度
分配效应
分配定律 描述溶质在两个互不相溶的液相中的分配的 定律。在一定温度和压力下，如果一种物 质溶解在两个同时存在的互不混溶的液体 中，达到平衡后，该物质在两相中的浓度 比等于常数：
固定化增殖细胞优点
①
②
③
固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高 度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微 生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵 生产周期，可提高生产能力； 发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续 使用，有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续 生产； 发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化， 提高产品质量等。
可能是偶联过 程中酶得到化 学修饰．或固 定化过程提高 了酶的稳定性。
(二)固定化对酶稳定性的影响
稳定性实际
30 25 20 15 10 5 0 提高 不变 降低 12 8 固定化酶数 30
应用

大多数情况下酶经过 固定化后其稳定性都 有所增加。
Merlose选择50种固定化 酶测试稳定性


五 影响固定化酶性能的因素

固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及 载体材料的性质。

酶本身的变化，主要由于活性中心的氨基酸残 基、高级结构和电荷状态等发生变化; 载体的影响.由于在固定化酶的周围，形成了能对底物
产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。

酶固定化后发生的性质变化.上述几种影响因素
(三)固定化酶的最适温度变化



酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综 合结果。 固定化后，酶热稳定性提高，最适温度随之提高。 例如，汤亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶 最适温度为80℃，比固定化前提高了30℃。 固定化后也可能降低 固定化的最适温度受固定化方法和固定化载体的 影响。
(四)固定化酶的最适pH变化
稳定性提高方面:



热稳定性提高 保存稳定性好 对蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解 对变性剂的耐受性提高,可耐受尿素、有机 溶剂和盐酸胍等蛋白质性剂的作用。 对不同pH稳定性提高
A 热稳定性
B有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高

提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性， 使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成 为可能。固定化酶在有机合成中应用会进 一步发展。
3固定化酶(细胞)的半衰期



固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下， 固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经 历的连续工作时间，以t1/2表示。固定化酶(细胞) 的操作稳定性是影响实用的关键因素，半衰朗是 衡量稳定性的指标。 在没有扩散限制时，固定化酶(细胞)活力随时间 成指数关系，半衰期t1/2 ＝0.693／KD 式中KD ＝-2.303／t X lg (E／E0)称为衰减 常数，其中E／E0是时间t后酶活力残留的百分数。
三、固定化细胞的重要发展方向-基因工 程菌的固定


将基因工程和酶工程相结合，有可能使大 规模培养过程中重组菌的稳定性问题得到 较好解决。 固定化工程菌和游离工程菌相比较，固定 化细胞具有高细胞浓度、克隆产物高效表 达、稳定性好等特性。
4.4 固定化原生质体
固定化细胞缺点: 只能用于生产胞外产物 由于载体的影响产物和底物的扩散受到影响. 溶解氧的传递和输送受到影响. 去除细胞壁障碍就可得到许多胞内产物,减少障 碍. 原生质体:去除细胞壁后的植物或其它生物细胞. 原生质体缺点就是更脆弱,但用载体固定化后就 具有高的稳定性,又比正常细胞少了胞壁障碍.
综合作用的结果。载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、 破坏酶结构、封闭酶活性部位等。
六酶固定化载体材料研究新进展

1磁性高分子微球 磁性高分子微球是指内部含有磁性金 属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧 化物) 的超细粉末, 而具有磁响应性的 高分子微球.
作为载体的优点
(1) 固定化酶从反应体系中分离和回收简便。对于 双酶体系, 当一种酶失活时, 可以用磁性材料再 固载另一种酶, 回收后反复使用。 (2) 磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应 器中, 可以减少反应体系中的操作,适合大规模连 续化生产。 (3) 利用外部磁场可以控制磁性材料固定酶的运动 方式和方向, 替代传统的机械搅拌, 提高固定化 酶的催化效率。
二、固定化细胞的制备



固定化酶的方法大部分适合于微生物细胞 的固定化。 可采用微生物自身的絮凝能力来制备无载 体固定化细胞。 要求保持高的活力保留和具有操作稳定性。