聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA

核酸提取的常见方法及原理核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。

今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。

1、什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。

核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。

不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。

DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。

2、核酸提取类型1、总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。

2、miRNA提取MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。

他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。

3、基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

4、质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。

以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。

可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。

2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。

3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。

4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。

通过离心将沉淀收集。

5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。

6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。

然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。

7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。

可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。

8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。

9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。

需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。

在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。

聚⼄⼆醇沉淀法纯化质粒DNA实验关键词：聚⼄⼆醇沉淀纯化质粒DNA 科进 Kirgen 爱思进 Axygen 康宁 corning 耐思 NEST ⽩鲨易 biosharp实验⽅法原理这种⽅法最早由 Richaed Treisman ( 英国，伦敦，ICRF) 参照 Lis 的⼯作⽽设计。

Lis 是最早⽤聚⼄⼆醇（PEG ) 分离不同⼤⼩ DNA 的⼈。

Treisman 法被⼴泛⽤于碱裂解法制备的质粒 DNA 的纯化。

实验材料粗制质粒试剂、试剂盒氯仿⼄醇异丙醇 LiCl PEG-MgCI2 酚氯仿⼄酸钠 TE仪器、耗材Sorvall SS-34 或与其相当的转头冰⽔浴实验步骤⼀、材料1. 缓冲液和溶液(1) 氯仿(2) ⼄醇(3) 异丙醇(4) LiCl ( 5 mol/L)(5) PEG-MgCI2 溶液(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）(7) ⼄酸钠（3 mol/L, pH 5.2 )(8) TE ( pH 8.0 )(9) TE ( pH 8.0）含 20 µg/ml RNase A2. 核酸和寡核苷酸粗制质粒3. 离⼼机和转头Sorvall SS-34 或与其相当的转头4. 专⽤设备冰⽔浴⼆、⽅法1. 将 3 ml 粗制质粒转移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷却⾄ 0。

2. 加⼊ 3 ml 冰预冷的 5 mol/L LiCl，混匀，于 4 离⼼ 12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。

3. 转移上清⾄ 30 ml Corex 管中，加等体积异丙醇，混匀，室温离⼼回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min )10 min。

4. ⼩⼼倒去上清，倒置管⼝，使液体流⼲。

室温下⽤ 70% ⼄醇洗沉淀和管壁。

⼩⼼将⼄醇倒去，⽤真空抽吸器将管壁上残留的⼄醇抽⼲。

在纸⼱上倒置数分钟，使⽆可见⼄醇残留。

质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA ，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA 的纯化。

（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA 。

然而，较长一代的载体(如pB R322 由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA 的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1 大质粒(大于15kb 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

一细菌的收获和裂解1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。

3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。

当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。

应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。

不要振荡，将离心管放置于冰上。

3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L.盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。

4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。

有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA.6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合，于室温放置2分钟。

实验七质粒DNA的制备【实验目的】1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；2.掌握质粒DNA分离和纯化的原理；3.学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法。

【实验原理】质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单个酶切位点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。

经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途，而质粒的分离与提取则是基因工程最常用、最基本的实验技术。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。

在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途选择不同的方法。

本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。

1. 碱变性法碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载质粒DNA的提取和纯化实验报告地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

2、初步了解DNA纯化的原理。

二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。