2014.4郑玉群—21世纪注射剂处方与工艺的研究与开发

ʌ实验研究ɔ电针对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠下丘脑β淀粉样蛋白㊁Tau 蛋白磷酸化水平与糖原合成酶激酶-3的影响❋王静芝1,杜艳军1ә,陈㊀丽1,黄浏娇2,瞿㊀涛1,周焕娇1,陈㊀茜1(1.湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉㊀430061;2.湖北中医药大学中医临床学院,武汉㊀430061)㊀㊀摘要:目的:观察电针对IR 大鼠下丘脑β淀粉样蛋白(Aβ42)㊁Tau 蛋白磷酸化(p-Tau )水平表达与糖原合成酶激酶-3(GSK-3)蛋白表达的影响㊂方法:70只Wistar 大鼠随机分为正常组㊁模型组㊁预防组㊁电针组㊁预防+阻滞剂组㊁电针+阻滞剂组和脑脊液组各10只,电针治疗后ELISA 法检测各组空腹血糖(FPG )㊁胰岛素(FINS )与胰岛素抵抗指数(IRI )水平变化,免疫组织化学检测下丘脑Aβ42㊁p-Tau 阳性表达,Western blot 检测GSK-3α和GSK-3β蛋白表达㊂结果:(1)较模型组大鼠,预防组和电针组大鼠FPG ㊁FIN ㊁IRI 降低(P <0.01),下丘脑Aβ42和p-Tau 阳性表达减少(P <0.05或P <0.01),下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达降低(P <0.05或P <0.01);(2)较电针组大鼠,预防组大鼠FPG ㊁FIN ㊁IRI 降低(P <0.05),下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达降低(P <0.05);(3)较电针+阻滞剂组,预防+阻滞剂组大鼠FPG ㊁FINS 与IRI 均降低(P <0.01),GSK-3β蛋白表达增加(P <0.05)㊂结论:电针改善IR 大鼠FPG ㊁FINS 及IRI 水平,其作用机制可能与电针抑制GSK-3α和GSK-3β蛋白表达㊁降低Aβ42和p-Tau 阳性表达相关㊂㊀㊀关键词:电针治疗;胰岛素抵抗;Aβ42;p-Tau ;GSK-3α;GSK-3β㊀㊀中图分类号:R245.9+7㊀㊀文献标识码:B㊀㊀文章编号:1006-3250(2021)05-0760-05❋基金项目:国家自然科学基金面上项目(81473786)-基于针灸抗炎作用防治阿尔茨海默病星形胶质细胞介导的β-淀粉样蛋白代谢机制研究;国家自然科学基金青年基金项目(81804170)-电针通过SIRT1/ATG7介导的自噬途径调节肝脏脂质代谢改善胰岛素抵抗的机制研究;国家自然科学基金青年基金项目(81904276)-电针通过mTORC1/S6K1自噬途径改善胰岛素抵抗大鼠认知功能损害的机制研究作者简介:王静芝(1983-),女,讲师,博士研究生,从事腧穴配伍及其效应机制研究㊂ә通讯作者:杜艳军(1975-),女,江苏连云港人,教授,博士研究生,博士研究生导师,从事针灸防治神经系统疾病的临床与实验研究,Tel :136****4878,E-mail :1051700031@ ㊂Effects of Electro-acupuncture on The Amyloid Protein βand Phosphorylation Levelsof Tau Protein and GSK-3in Hypothalamus of Insulin ResistanceRats Induced by High-fat DietWANG Jing-zhi 1,DU Yan-jun 1ә,CHEN li 1,HUANG Liu-jiao 2,QU Tao 1,ZHOU Huan-jiao 1,CHEN Qian 1(1.College of Acupuncture Moxibustion and Orthopaedics,Hubei University of Chinese Medicine /Hubei Provincial Collaborative Innovation Center of Preventive Treatment by Acupuncture and Moxibustion,Wuhan 430061,China,2.Clinical College of Chinese Medicine,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430061,China)㊀㊀Abstract :Objective :To observe the electro-acupuncture effect on the hypothalamic expression levels of Aβ42,phosphorylated Tau protein ,GSK-3αand GSK-3βin insulin resistance model rats.Method :70Wistar rats were divided into 7groups ,10rats in each group.Fasting plasma glucose and FINs will detect after the treatment by Elisa method ,expression levels of hypothalamic Aβ42,phosphorylated Tau protein will detected via immunohistochemistry method ;expression levels of hypothalamic GSK-3αand GSK-3βwill detected via western-blotting.Result :(1)Compared with model group ,FPG ,FINS ,ISI reduced (P <0.01),expression levels of hypothalamic Aβ42,phosphorylated Tau protein decreased (P <0.05or P <0.01),expression levels of hypothalamic GSK-3αand GSK-3βdecreased (P <0.05or P <0.01)in pre-EA group and EA group ;(2)Compared with EA group ,FPG ,FINS ,ISI reduced (P <0.05),expression levels of hypothalamic GSK-3αand GSK-3βdecreased (P <0.05)in pre-EA group ;(3)Compared with electro-acupuncture plus blocker LY294002group ,FPG ,FINS ,ISI reduced (P <0.05),expression levels of hypothalamic GSK-3βincreased (P <0.05)in pre-EA plus blocker LY294002group ;Conclusion :The mechanism of electro-acupuncture improvement on peripheral blood levels of FPG ,FINS and IRI in insulin resistance model rats ,is pertaining to the regulation of inhibiting the expression of GSK-3αand GSK-3β,and reduces the positive expression of Aβ42and p-Tau.㊀㊀Key words :Electro-Acupuncture ;Insulin Resistance ;Aβ42;p-Tau ;GSK-3α;GSK-3β㊀㊀随着人口老龄化日益严重,老年期痴呆的发病率呈上升趋势㊂轻度认知功能损害(mild cognitive impairment,MCI)是介于正常老化和痴呆之间的一种不稳定的认知损伤状态,每3~4年有20%~66%的MCI患者认知功能持续恶化,最终导致痴呆的发生,其中大部分为阿尔茨海默型痴呆(alzheimer disease,AD),MCI是AD的重要危险因素[1-2]㊂胰岛素对中枢神经系统的影响包括摄食行为㊁能量储存㊁记忆认知功能[3],中枢胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)可以引起轻度认知功能损害,轻㊁中度认知功能下降[4]㊂Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用产生,Aβ的増加与沉积可通过生成具有神经毒性的老年斑诱发神经元变性与死亡㊂神经元微管相关蛋白(Tau蛋白)过度磷酸化则是认知功能损害的又一发病机制[5-6]㊂胰岛素信号转导通路PKB/Akt的生理底物糖原合成酶激酶-3 (glucogen synthase kinase-3,GSK3),具有GSK-3α和GSK-3β2种形式的异构体,其活性与Aβ沉积㊁tau 蛋白过度磷酸化密切相关[7]㊂本研究在造模同时给予受试动物电针预防性治疗,与造模成功后的电针治疗组作为对照,旨在观察电针预防性治疗对胰岛素抵抗大鼠认知功能的保护作用㊂并通过观察各组大鼠下丘脑Aβ42㊁p-tau㊁GSK-3α与GSK-3β表达变化与差异,探讨电针治疗在防治胰岛素抵抗大鼠轻度认知功能损害的效应机制㊂1　材料与方法1.1㊀实验动物选用清洁级雄性Wistar大鼠70只,8周龄,体质量(180ʃ20)g,购自湖北省实验动物研究中心,实验动物许可证号SCXK(鄂)2015-0018㊂饲养于湖北中医药大学实验动物中心,饲养环境温度18~ 25ħ,湿度45%~55%㊂1.2㊀主要试剂与仪器高脂饲料(上海斯莱克实验动物有限责任公司),Aβ42㊁p-Tau(美国abcam,b10148㊁ab109390), Dako REAL EnVision Detection System(安捷伦(Dako),K5007)㊂小鼠单抗β-actin(42KD)(武汉博士德生物工程有限公司,BM0627),兔多抗GSK3α(51KD)㊁兔多抗GSK3β(48KD)(武汉三鹰生物技术有限公司,13419-1-AP㊁22104-1-AP), HRP标记羊抗小鼠二抗㊁HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,BA1051㊁BA1054),磷酸酶抑制剂㊁PMSF㊁RIPA裂解液㊁BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天,S1873㊁ST506㊁P0013B㊁P0010), TEMED㊁Trise-Base(Amresco,Amresc00761㊁Exp2017/12),HCl(信阳市化学试剂厂,GB622-89),Tris-base(西格玛奥的(上海)贸易有限公司,v900483)㊂RM2016轮转式病理切片机(德国Leica公司);JK-6生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司);SKG抗原修复用电陶炉;电泳仪(Bio-Rad);转膜仪(Bio-Rad);凝胶扫描成像系统(Bio-Rad); BX53型显微镜(奥林巴斯生物显微镜),LP115pH 计(德国Metter-Toledo GmbH公司);酶标仪(Thermo,mμLISKANMK3);HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);华佗牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司)㊂1.3㊀分组与造模适应性喂养3d后按随机数字表法分为正常组(normal,N)㊁模型组(model,M)㊁预防组(preventing electro-acupuncture,p-EA)㊁电针组(electro-acupuncture,EA)㊁预防+阻滞剂组(p-EA+ blocker LY294002,p-EA+b)㊁电针+阻滞剂组(EA+ blocker LY294002,EA+b)㊁脑脊液组(cerebrospinal fluid,CSF)各10只㊂正常组(N)给予标准饮食(3.8kcal/g,含70%碳水化合物,20%蛋白质,10%脂肪),其余各组采用高脂饲料(5.4kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白质,46.5%脂肪)㊂喂养8周后大鼠尾静脉采血检测FPG㊁FINS,IRI=[FPG (mmol/L)ˑFINS(mIU/L)]/22.5,模型大鼠IRI与正常大鼠比较明显升高时(P<0.001)为造模成功[8]㊂1.4㊀电针干预1.4.1㊀EA组㊀大鼠于造模成功后,使用0.30ˑ25mm不锈钢毫针,参照李忠仁主编‘实验针灸学“[9],以标本配穴电针方法选择关元㊁足三里(后三里)㊁丰隆和百会进行毫针针刺㊂足三里和丰隆穴直刺5~10mm,关元穴向剑突方向斜刺5~7mm,百会向后方平刺5mm㊂采用电针治疗仪(HANS-100 A型)连续波㊁频率(2Hz)㊁强度(1mA)㊁通电(10 min),同侧足三里穴和丰隆穴连接同一输出的2个电极,刺激强度根据局部肌肉收缩情况决定㊂每日电针10min,每周5次治疗,总疗程为8周㊂以上采取的刺激频率和电针时间㊁疗程综合文献报道决定[10]㊂1.4.2㊀p-EA组㊀从造模开始进行电针治疗,电针方法同EA组,持续16周㊂1.4.3㊀p-EA+b组㊀大鼠称重后以10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔麻醉㊂将大鼠固定于脑立体定位仪,头顶局部常规备皮㊁消毒,依照立体定位图谱进行定位,于前囟后0.8mm在中位颅盖骨处用牙科钻钻一直径2mm的孔[11-12],以不锈钢导管插入(长18.0mm,外径0.64mm,内径0.39mm)留置(如图1);用带帽的不锈钢制导丝插入导管内封闭导管㊂手术后预防感染,将大鼠置于空笼内待6~8 h可清醒㊂术后2d起取LY294002(10μm, 10μL;1μL/min)缓慢注射,留针8~10min,以防药物沿针道返流颅外㊂电针治疗同p-EA 组,共计16周㊂1.4.4㊀EA +b 组㊀造模成功后,每日电针干预前1h ,大鼠称重后进行脑室灌注LY294002㊂脑室灌注同p-EA +b 组㊂电针治疗同EA 组,持续8周㊂1.4.5㊀CSF 组㊀大鼠称重后脑室留管同EA +b 组㊂脑脊液:Na +145.5ml /L ,K +2.8mol /L ,Ca2+2.3mol /L ,Mg2+2.2mol ,Cl -128.5mol /L ,HCO3-23.1mol /L ,H2Po4-l.lmol /L ,葡萄糖0.6lg /L ,渗透压289.omosM /L ,PH 值7.3配置完成等量灌注,操作方法同EA +b 组㊂电针治疗同EA 组㊂图1㊀大鼠脑立体定位及置管示意图1.5㊀指标收集与检测1.5.1㊀ELISA 法检测㊀大鼠空腹FPG ㊁FIN 实验16th 周治疗结束后,各组大鼠禁食12h 以尾静脉采血静置,离心取上清㊂ELISA 法按试剂盒操作要求检测各组大鼠空腹FPG ㊁FIN 并计算各组大鼠IRI ㊂1.5.2㊀免疫组化㊀各组大鼠禁食12h 颈椎脱臼法处死,冰上剥取下丘脑,右侧下丘脑组织-80ħ保存备用㊂左侧下丘脑组织用多聚甲醛(4%)固定后,酒精脱水并进行浸蜡及包埋㊂切片厚度4μm ,经脱蜡㊁抗原修复,滴加一抗(Aβ421ʒ100,p-tau ㊀㊀㊀1ʒ100)㊁二抗,镜下观察并完成镜检拍照㊂使用IPP6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析,每张切片选取3张400倍照片做光密度分析,area 为面积,IOD 为积分光密度,density (mean )为平均光密度㊂1.5.3㊀Western blot 检测㊀从-80ħ冰箱中取出下丘脑组织,加入400μL 裂解液(含PMSF )碾磨㊁裂解离心取上清,使蛋白变性㊂BSA 标准品稀释为1㊁0.8㊁0.6㊁0.4㊁0.2标准蛋白,采用DG-3022A 酶标仪测定OD568并计算蛋白浓度㊂蛋白样品(40μg )和Marker 加入上样孔,电泳1.5h ㊂凝胶根据Marker 切下目的条带,PVDF 膜甲醇浸泡后同滤纸浸泡于电转缓冲液㊂PVDF 膜浸泡于含5%脱脂奶粉TBST ,室温摇床封闭2h ;浸泡一抗(β-actin 1ʒ200,GSK3-α1ʒ500,GSK3-β1ʒ1000),封闭液稀释相应的HRP 标记二抗(1ʒ50000),采用BandScan 分析胶片灰度值㊂1.6㊀统计学方法采用SPSS 统计软件Version 24.0进行统计分析,所有数据以均数ʃ标准差(x ʃs)表示,采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD 检验,P <0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结果2.1㊀各组大鼠FPG ㊁FINS 与IRI 水平变化比较表1示,治疗结束与N 组比较,其他各组大鼠FPG ㊁FINS 与IRI 明显升高(P <0.05或P <0.01);与M 组比较,p-EA 组㊁EA 组㊁p-EA +b 组与CSF 组大鼠FPG ㊁FINS 和IRI 均有不同程度降低(P <0.05或P <0.01);与EA 组比较,p-EA 组大鼠的FINS 与IRI 降低(P <0.05),EA +b 组FPG ㊁FINS 与IRI 升高(P <0.05),p-EA +b 组大鼠的FPG 与IRI 升高(P <0.05);与EA +b 组比较,p-EA 与CSF 组大鼠的FPG ㊁FINS 和IRI 降低(P <0.05),p-EA +b 组大鼠的FINS 与IRI 升高(P <0.05);与CSF 组比较,p-EA +b 组大鼠的FPG ㊁FINS 与IRI 升高(P <0.05)㊂表1㊀各组大鼠FPG ㊁FINS ㊁IRI 水平比较(x ʃs )组别鼠数FPG (mmol /L )FINS (mU /L )IRIN 组10 6.02ʃ0.5513.89ʃ0.323.71ʃ0.37M 组1012.42ʃ1.16∗∗29.73ʃ9.32∗∗16.41ʃ5.47∗∗p-EA 组107.98ʃ0.60∗##һ26.07ʃ0.48∗∗#ʏһ9.24ʃ0.68∗#ʏһEA 组108.81ʃ1.62∗#һ28.76ʃ0.92∗∗#11.26ʃ2.12∗∗#EA +b 组1011.86ʃ1.39∗ʏ33.02ʃ0.75∗∗ʏ17.41ʃ7.49∗∗ʏp-EA +b 组1011.11ʃ1.71∗#ʏӘ28.96ʃ4.79∗∗һӘ14.29ʃ3.49∗∗ʏһӘCSF 组107.48ʃ0.66∗#һ29.86ʃ0.77∗∗#һ9.93ʃ4.27∗#һ㊀㊀注:与N 组比较:∗∗P <0.01,∗P <0.05;与M 组比较:##P <0.01,#P <0.05;与EA 组比较:ʏP <0.05;与EA +b 组比较:һP <0.05;与CSF 组比较:ӘP <0.05㊀㊀2.2㊀各组大鼠下丘脑Aβ42与p-Tau 表达比较图2示,第16周电针治疗结束时,黑色箭头所示棕黄色或棕褐色细胞膜是各组大鼠下丘脑Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达㊂N 组与p-EA 组大鼠下丘脑见极少量棕黄色或棕褐色淡染的阳性细胞;EA 组㊁p-EA +b 组与CSF 组大鼠下丘脑偶见棕黄色或棕褐色淡染的阳性细胞;M 组㊁EA +b 组棕黄色或棕褐色阳性表达聚集数量多,着色深㊂图2㊀各组大鼠下丘脑Aβ42与p-Tau 免疫组织化学(ˑ400)㊀㊀表2示,M 组㊁p-EA 组㊁EA 组㊁EA +b 组㊁p-EA +b 组㊁CSF 组大鼠Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达明显高于N 组(P <0.05或P <0.01);p-EA 组㊁EA 组大鼠Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达低于M 组㊁EA +b 组㊁CSF 组(P <0.05或P <0.01);EA 组与p-EA 组大鼠之间Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达差异无统计学意义;p-EA +b 组与CSF 组大鼠Aβ42阳性表达差异无统计学意义㊂表2㊀各组大鼠下丘脑Aβ42㊁p-Tau 平均光密度比值及下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达比较(/β-actin ,x ʃs )组别鼠数density (mean )Aβ42p-TauGSK-3αGSK-3βN 组100.0047ʃ0.001㊀㊀㊀0.0007ʃ0.003㊀㊀㊀0.284ʃ0.02㊀㊀㊀0.349ʃ0.01㊀㊀㊀M 组100.0142ʃ0.002∗∗0.0117ʃ0.001∗∗0.598ʃ0.02∗∗0.770ʃ0.01∗∗p-EA 组100.0061ʃ0.008∗∗##һһӘ0.0012ʃ0.001∗##һһ0.329ʃ0.01∗##ʏһ0.404ʃ0.02∗##ʏһEA 组100.0092ʃ0.008∗#ʏӘ0.0013ʃ0.002∗##0.401ʃ0.02∗#0.436ʃ0.03∗##EA +b 组100.0136ʃ0.003∗∗ʏ0.0062ʃ0.001∗∗##ʏ0.442ʃ0.03∗∗#ʏӘ0.497ʃ0.03∗##ʏӘp-EA +b 组100.0110ʃ0.002∗∗ʏʏ0.0047ʃ0.002∗∗##ʏһӘӘ0.475ʃ0.02∗∗#ʏӘ0.587ʃ0.03∗∗#ʏʏһӘCSF 组100.0107ʃ0.008∗∗#ʏһ0.0017ʃ0.002∗##һ0.539ʃ0.01∗∗ʏ0.641ʃ0.04∗∗#ʏʏһһ㊀㊀注:与N 组比较:∗∗P <0.01,∗P <0.05;与M 组比较:##P <0.01,#P <0.05;与EA 组比较:ʏʏP <0.01,ʏP <0.05;与EA +b 组比较:һһP <0.01,һP <0.05;与CSF 组比较:ӘӘP <0.01,ӘP <0.05㊀㊀2.3㊀各组大鼠下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达比较表2图3示,与N 组比较,其他各组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达增加(P <0.05或P <0.01);与M 组比较,p-EA ㊁EA 组和p-EA +b 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05或P <0.01),CSF 组大鼠GSK-3α差异无统计学意义,GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05);与EA 组比较,p-EA 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05),EA +b 组㊁p-EA +b 组CSF 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达增加(P <0.05);与EA +b 组比较,p-EA 组大鼠下丘脑GSK-3α(P <0.05),p-EA +b 组㊁CSF 组大鼠下丘脑GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05);与CSF 组比较,EA +b 组和p-EA +b 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05)㊂图3㊀各组大鼠下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达电泳图㊀㊀3㊀讨论胰岛素与大脑的生物活性㊁神经结构和生理功能密切相关,对中枢神经系统认知功能有着重要影响,胰岛素相关信号分子传导异常是IR 发生的关键[13]㊂IR 时,由胰岛素介导的神经能量代谢出现异常引起神经元糖代谢紊乱,从而导致神经元功能障碍及中枢神经系统疾病的发生[14]㊂本研究依据中医针灸 治未病 理论,以足三里㊁关元㊁丰隆与百会四穴配伍,旨在培补先天之本㊁后天气血生化之源的同时,祛痰消脂㊁疏通脑络㊂研究中预防组受试动物在造模的同时给予电针治疗,以期通过电针干预激发受试动物机体内在的抗病能力,预防IR 与IR 相关的认知功能损害,强调电针早期干预的预防效应㊂GSK3是PI3K /Akt 信号通路的生理底物,通过负反馈调节该通路的效应蛋白对IR 的发生发展有重要影响㊂GSK-3α和GSK-3β是GSK3两种形式的异构体㊂活化的GSK-3a 可以激活APPγ分泌酶使得Aβ沉积增加[15-16],GSK-3β会造成tau 蛋白过度磷酸化并导致神经纤维缠结;此外,GSK-3β通过提高胰岛素受体底物的丝∕苏氨酸磷酸化水平来抑制胰岛素受体对胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化,通过抑制胰岛素信号传导加重IR[17-18]㊂因此,GSK-3α与GSK-3β的活化是IR与认知功能损害共同的病理改变㊂本研究中,M组㊁EA+b组和p-EA+b组大鼠下丘脑GSK-3α与GSK-3β蛋白表达增加,这与其下丘脑中Aβ42与p-Tau阳性表达聚集数量多㊁着色深的结果一致㊂同时,这3组受试动物外周血FPG㊁FINS及IRI水平升高㊂电针治疗后,p-EA组㊁EA组外周胰岛素抵抗程度显著降低,下丘脑Aβ42与p-Tau阳性表达减少,GSK-3α与GSK-3β蛋白表达降低,且p-EA组治疗效果优于EA组,p-EA组与EA 组p-Tau阳性表达结果无明显差异㊂在中枢微量注入PI3K抑制剂LY294002的条件下,电针防治效应被阻断,EA+b组㊁p-EA+b组大鼠的FPG㊁FINS与IRI升高,Aβ42与p-Tau阳性表达聚集数量多㊁着色深,且GSK-3α与GSK-3β蛋白表达增加,说明电针对IR大鼠认知功能损伤的防治效应或可通过PI3K/Akt信号通路实现㊂这与我们前期研究中发现,电针调节PI3K/Akt信号通路相关分子活性,从而促进改善IR大鼠学习记忆能力的实验结果相一致㊂然而CSF组大鼠在经过电针治疗后,下丘脑GSK-3α与GSK-3β蛋白表达增加的同时,Aβ42与p-Tau阳性表达聚集数量减少㊁着色浅,且外周血FPG㊁FINS及IRI水平降低㊂考虑PI3K/Akt信号通路不是参与针灸防治IR认知功能损害的唯一途径,因此电针防治胰岛素抵抗相关认知功能损伤的作用机制值得更进一步的研究㊂参考文献:[1]㊀BIESSELS GJ,REAGAN LP.Hippocampal insulin resistanceand cognitive dysfunction[J].Nat Rev Neurosci,2015,16:660-671.[2]㊀杨莘,乔雨晨,吴晓光,等.不同护理干预方法在轻度认知功能障碍患者中的应用效果[J].中华护理杂志,2012,47(1):77-79.[3]㊀GRAY SM,MEIJER RI,BARRETT EJ.Insulin regulates brainfunction,but how does it get there?[J].Diabetes,2014,63(12):3992–3997.[4]㊀莫巍,钱国锋.二甲双胍对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠空间认知㊁学习记忆及脑能量代谢的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(10):2813-2816.㊀㊀㊀[5]㊀李娜,康建华,杨立顺.阿尔茨海默病(AD)患者外周血Aβ42及Aβ40的变化研究[J].中国实验诊断学,2016,20(10):1664-1664.[6]㊀姜美驰,梁静,张玉杰,等.针刺 四关 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关于中药注射剂的书籍
1. 《中药注射剂临床应用指南》（李子夏、刘玉珍、邹春艳等著）：这本书详细介绍了中药注射剂的临床应用，包括剂型、适应症、给药方法和注意事项等方面。

2. 《中药注射剂药理学》（徐建新、胡斌等著）：这本书系统地介绍了中药注射剂的药理学知识和机制，对中药注射剂的临床应用提供了理论基础。

3. 《中药注射剂质量控制技术》（吴云范、孙建民等著）：这本书介绍了中药注射剂的质量控制技术，包括药材提取、制剂工艺、质量标准和检测方法等方面。

4. 《中药注射剂治疗临床实践》（张鹏著）：这本书通过许多典型病例的介绍，展示了中药注射剂在临床上的应用效果和治疗机制。

5. 《中药注射剂临床应用手册》（陈建华、史蓉等著）：这本书从临床实践出发，介绍了中药注射剂的种类、用法、不良反应和注意事项等方面。

中药注射剂临床应用存在问题及说明书的相关思考与建议＊陈诗琪1，郑蕊1，李幼平2，商洪才1＊＊（1.北京中医药大学东直门医院北京100700；2.四川大学华西医院中国Cochrane中心/中国循证医学中心成都610041）摘要：中药注射剂临床应用存在成分复杂、辅料热原不清、功能广泛、主治不清、用法用量含糊、操作过程不规范、药物相互作用不清等问题，限制了中药注射剂的应用和发展。

根据2006年以来中药注射剂药品说明书制定的相关政策，结合临床应用中的问题加以思考，为建立严格、规范、基于证据的中药注射剂药品说明书提供建议。

关键词：中药注射剂药品说明书政策建议doi：10.11842/wst.2018.10.002中图分类号：R283.6文献标识码：A中药注射剂是指中药材经提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临用前配成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂[1]，作为中药现代化产物，在抗感染、抗肿瘤、心脑血管病治疗和抢救危急重症等方面有独特作用，且起效快、疗效确切[2]，已逐渐成为临床应用广泛的中成药剂型之一。

注射剂型使用不便，需要专业技术人员操作，故都属于处方药[3]。

临床使用处方药品需要医师遵从药品说明书执行，药品说明书的严格制定不仅起到宣传、告知医师和消费者的义务作用，对于企业本身而言，也具备一定的法律效力，可作为抗辩事由中的特定事由，最大程度上免除药品生产企业的责任[4]。

因此，中药注射剂药品说明书的严格制定具有十分重要的意义。

原国家食品药品监督管理局（SFDA）在2006年印发了关于《中药、天然药物处方药说明书格式内容书写要求及撰写指导原则的通知》，其中《中药、天然药物处方药说明书撰写指导原则》中规定中药制剂说明书（包括中药注射剂）应包括药品名称、成分、功能主治、用法用量、禁忌、注意事项、警示语、药物相互作用、药理毒理、贮藏等26项基本内容[5]，通知在原有标准的基础上进行了补充和更新，并鼓励相关企业及时对药品说明书进行完善。

浅议新药质量标准中一些应注意的问题翟惠民　朱志峰　宋愿智(陕西省药品检验所　西安　710061) 药品质量标准是用药质量和安全的重要保证,新药标准的研究项目应综合考虑药品的特性、剂型、处方和工艺,所选用的分析方法应专属灵敏,准确可控,但由于近年来新药研制的迅猛发展,各研究水平的参差不齐以及我国与国际先进水平的差距使一些新药质量标准的科学性、可控性不足,造成复核检验中可操作性、重现性差,现结合我省近年在药品标准复核检验中遇到的一些问题,归纳浅析如下,供标准制定时参考。

1　应重视性状描述及鉴别试验方法的可靠性1.1　药品的性状描述不严谨　某些中药制剂仅依据较少批次样品就规定了性状,忽视因不同产地、不同季节采收药材、不同加工炮制方法、灭菌后及贮藏期间可能出现的颜色变化,造成标准与生产实样颜色不符。

如我省申报某胶囊标准规定“内容物为绿褐色”,因药材产季不同会出现棕褐色。

又如某胶囊,标准规定“内容物为浅黄色粉末”实为“浅砖红色或砖红色粉末”。

某些中药由片剂研制改为胶囊剂,因制粒工序中减少了辅料用量,使某种药材的气味更加明显,但性状药味仍按原片剂描述欠恰当。

如“参芪降糖胶囊”苦味、酸味较原参芪降糖片明显加重。

有的胶囊剂,工艺有制粒过程,标准却规定“内容物为粉末”,造成二者不符。

1.2　药品鉴别方法的操作研究不深入　某些中药制剂采用薄层色谱法鉴别,复核时斑点很弱,分离效果不好或重现性差,需多次试验改变操作及点样量才可获得较满意结果。

一些影响检出的关键操作如溶媒提取次数,样品与对照品呈色色泽及荧光的可比性,喷显色剂后的观察方式等等应在标准中注明。

2　应深入研究杂质及降解产物的检查方法2.1　重视杂质的测定　化药原料药无机杂质中的重金属及砷盐检查,大都按一般要求规定限度,未考察所定限度与实测数据的差别,有的亦未考察样品经灰化后与直接取样测定结果有何不同。

某些化学药以TLC测定杂质,无论存在单个和多个杂质,普遍采用一种对照溶液(限度),一个点与样品对照,控制单个杂质量。

《中国药典》一部的定义是“系指药材经提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临用前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。

”（药典一部专录中药，附录所载的剂型如丸剂、膏药、煎膏剂等等都不冠于“中药”字样，此处的“注射剂”显然是指中药注射剂。

）制剂若为液体，则称为中药注射液或中草药注射液；若为粉末则称为中药粉针剂或中草药粉针剂。

《中药药剂剂》的定义是“以中医药理论为指导，采用现代科学技术和方法，从中药或复方中药中提取有效物质制成的注射剂称为中药注射剂。

”《中药注射剂学》的定义是“中药注射剂是指以中医药理论为指导，采用现代科学技术和方法，从中药或天然药物的单方或复方中提取的有效物质制成的无菌溶液、混悬液或临用前配成溶体的灭菌粉末供注入体内的制剂”。

著名学者周超凡研究员提出以下定义：中药注射剂一般系指在中医药理论与经验的基础上，采用现代科学技术与方法，从中药或其他天然药中提取有效物质制成，功能主治用中医药术语或同时用中医药术语与相关的西医药术语联合表述的供注人体内的各种无菌制剂。

值得注意的是定义中最重要的部分——“功能主治用中医药术语或同时用中医药术语与相关的西医药术语联合表述”，这是“注射剂”属概念下“中药注射剂”种概念所特有，必不可少；“一般系指在中医药理论与经验的基础上”，讲明了大多数中药注射剂的渊源，尽管这样做有助于中药注射剂的研制，但并不是非如此不可；中药注射剂的原料药一般属于中药，但不排斥用其他天然药，因为中药本身也是在不断发展变化，曾有不少外来天然药早已被吸纳为中药；只有“采用现代科学技术与方法”才能保证质量，它虽不属于“中药注射剂”所特有，但应强调。

（出处：周超凡,等. 从药物组成看中药注射剂. 中国中药杂志. 2006;31(11):950）中药注射剂发展前景探究2011年02月09日13:03:32 作者:中药部文档来源:中国医药报去年六月“鱼腥草”事件的出现，在国内引起了强烈的反响。

专利名称：一种丹参类注射液及其制备方法专利类型：发明专利
发明人：张胤杰,郑斯骥,丁云晖,张英,李德祥申请号：CN201310436409.3
申请日：20130923
公开号：CN103816113A
公开日：
20140528
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种丹参类注射液及其制备方法，本发明的丹参类注射液含有丹参活性成分和缓冲对试剂组合，所述的丹参活性成分包括丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、以及丹酚酸B中的一种或多种；所述的缓冲对试剂包括药学上可接受的抗氧剂、有机弱酸和有机弱酸共轭碱的一种或多种，所述的抗氧剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠中的一种或多种。

本发明还公开了所述丹参类注射液的制备方法。

本发明的丹参类注射液具有优异的质量稳定性，制备方法操作简便、无需特殊设备，易应用于工业化生产。

申请人：上海中西制药有限公司
地址：201806 上海市嘉定区外青松公路446号
国籍：CN
代理机构：上海光华专利事务所
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运用中医理论使用中药注射剂1中药注射剂的发展历史20世纪30年代世界上第1个中药注射剂——柴胡注射液问世,新中国成立后中药注射剂开始正式研制和批量生产,1954年武汉制药厂对柴胡注射液进行了重新论证并大批量生产,20世纪50年代中期到60年代初我国研制出“抗601注射液”、“2012(板蓝根注射液”、“茵栀黄注射液”等20多个品种在临床上使用。

20世纪70年代,全国各地研制成功并用于临床的中药注射剂品种繁多, 1977年版《中国药典》一部收载的中药注射剂就有“丹参注射液”、“银黄注射液”等23个品种,各省市卫生部门制定的“中草药制剂规范”“标准”中也收载了大量的中药注射剂,据统计,有资料报道的达700多种。

进入20世纪80年代后,中药注射剂的研究再次迎来开发的热潮,其数量曾一度达到1400种左右。

1985年到1998年,有11个中药注射剂作为中药新药生产上市,如“香菇多糖注射液”、“双黄连粉针”、“康莱特注射液”、“参芪扶正注射液”等。

1993年卫生部颁布了《中药注射剂研制指导原则》。

1999年11月,国家药品监督管理局发布了《中药注射剂研究的技术要求》,要求对化学成分基本清楚,以净药材投料的注射剂要求可测性成分达到20%以上,静脉注射要求达到25%以上;以有效部位投料的注射剂要求可测性成分达到70%以上,静脉注射用可测成分要达到80%。

2000年,国家药品监督管理局又颁发了《加强中药注射剂质量管理》,明确提出中药注射剂要建立指纹图谱检测标准,并于同年8月颁发了《中药注射剂指纹图谱研究技术指导原则(试行》。

2005年版药典中收载中药注射剂品种4个,另外在部颁标准中收中药注射剂70个品种,目前具有生产批准文号的中药注射剂达100多种[1]。

1999年到2006年全国中药注射剂市场年平均增长率超过30%,每年有4亿人次使用中药注射剂,2007,2008年国家药监局分别发布了《中药、天然药物注射剂基本技术要求》和《中药注射剂临床使用基本原则》,2009年,全面启动了中药注射剂安全性再评价工作,2010年制定了中药注射剂安全性再评价生产工艺评价等7个技术原则。