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第53卷 第12期 2023年12月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A53(12):061~070D e c .,2023钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究❋毕 莹,郭雅琳,尚孟慧,徐晓婷,臧晓南❋❋(中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003)摘 要: 为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(A r t h r o -s p i r a p l a t e n s i s F A C H B 314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因a p c A B 及其亚基基因a p c A 和a p c B ㊂节旋藻基因组中a pc A B 全长共1056b p ,由a p c A 和a p c B 串联组成,中间间隔84b p ㊂其中,a p c A 和a pc B 基因的全长均为486b p ,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33k D a ,它们分别编码的α和β亚基均属于G l o b i n _l i k e 超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守㊂将克隆出的亚基基因a p c A ㊁a p c B 分别同前期A .p l a t e n s i s F A C H B 314中获得的藻蓝胆素合成相关基因h o 和p c y A 以及色基裂合酶基因(c p c E ㊁c p c F ㊁c p c U ㊁c p c S ㊁c pc T )共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E .c o l i H P E F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B ㊂S D S -P A G E 和W e s t e r n B l o t 均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基㊂荧光检测结果显示,在600n m 波长激发下,两株重组菌株在640n m 处均出现了别藻蓝蛋白特征荧光发射峰㊂这些结果表明在重组大肠杆菌中表达的脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基可以和藻蓝胆素结合,形成有光学活性的别藻蓝蛋白,这为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药㊁荧光检测方面的应用奠定了基础㊂关键词: 节旋藻;别藻蓝蛋白基因;重组表达;荧光活性中图法分类号: Q 946 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2023)12-061-10D O I : 10.16441/j.c n k i .h d x b .20220103引用格式: 毕莹,郭雅琳,尚孟慧,等.钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2023,53(12):61-70.B i Y i n g ,G u o Y a l i n ,S h a n g M e n g h u i ,e t a l .C l o n i n g ,a n a l y z i n g a n d h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f a l l o p h y c o c ya n i n g e n e f r o m A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s F A C H B 314[J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a ,2023,53(12):61-70. ❋ 基金项目:国家自然科学基金项目(31872555)资助S u p p o r t e d b yt h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a (31872555)收稿日期:2022-02-22;修订日期:2022-03-23作者简介:毕 莹(1998 ),女,硕士生㊂E -m a i l :b i y i n g h a p pi e s t @163.c o m ❋❋ 通信作者:E -m a i l :x n z a n g@o u c .e d u .c n 钝顶节旋藻(A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s )是一种多细胞丝状的蓝绿色微藻,属于蓝藻门(C y a n o p h y t a )㊁蓝藻纲(C y-a n o p h yc e a e )㊁颤藻目(O s c i l l a t o r i a l e s )㊁颤藻科(O s c i l l a o r i a -l e s )㊁节旋藻属(A r t h r o s pi r a ),生长在水中,易被获得与加工,并且具有很高的常量与微量营养成分㊂它在作为补充膳食成分㊁蛋白质维生素补充剂和健康食品方面具有很大的发展潜力㊂其富含的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白具有很高的生物学研究价值与应用开发价值[1-2]㊂别藻蓝蛋白(A l l o p h y c o c ya n i n )作为藻胆体核心复合物中重要的藻胆蛋白,能直接吸收光能,进而作为捕光色素参与藻类的光合作用,而且在抗氧化㊁抗癌㊁免疫印迹和食品工业方面都有应用[3-5]㊂另外,别藻蓝蛋白还因具有光学活性,可作为光敏材料和生物医学中的荧光标签[6-7]㊂分离纯化出来的天然别藻蓝蛋白含有α㊁β两种亚基,通常是以三聚体(αβ)3的形式存在[8]㊂天然别藻蓝蛋白的荧光发射特征峰约在660n m左右[9],吸收峰在650n m ㊂别藻蓝蛋白之所以具有明亮的颜色和光吸收特性,是由于藻胆素(P C B s,线性四吡咯胆素)的存在,P C B s 通过硫醚键连接到藻胆蛋白高度保守的半胱氨酸残基上[10]㊂藻蓝胆素的合成需要铁氧还蛋白还原酶(P c yA )还原胆绿素,胆绿素则是由血红素氧化酶(H O 1)氧化血红素而得㊂血红素不仅存在于蓝藻中,也存在于大肠杆菌中[11]㊂因此,H O 1和P c yA 在大肠杆菌中的转化表达使带有光学活性藻胆蛋白的异源表达成为可能㊂色基裂合酶可以进一步催化藻胆素结合到脱辅基藻胆蛋白不同位点的半胱氨酸,为藻胆素的附着提供了正确的区域和异构性[12-13]㊂因此,异源表达有光学活性的别藻蓝蛋白,除了要表达脱辅基别藻蓝蛋白,还要表达藻蓝胆素合成相关酶(H O 1㊁P c yA )以及催化别藻蓝蛋白同色基结合的色基裂合酶(C p c E ㊁C p c F ㊁C p c U ㊁C p c S ㊁C pc T )㊂关于利用基因工程技术合成具有光学活性别藻蓝中国海洋大学学报2023年蛋白的研究有很多报道,主要集中在聚球藻(S y n e c h o-c o c c u s s p.7002)和集胞藻(S y n e c h o c y s t i s s p. P C C6803)模式蓝藻上[14-17]㊂节旋藻作为一种可食用的经济蓝藻,其别藻蓝蛋白被证明有显著的医药价值,对其别藻蓝蛋白进行重组表达的研究有重要的应用价值[18]㊂文献[19]的研究中,对螺旋藻(S p i r u l i n a s p.)的别藻蓝蛋白α亚基基因(A p c A)进行克隆并自催化在大肠杆菌中进行异源表达㊂G e等利用来自S y n e-c h o c y s t i s s p.P C C6803的h o1和p c y A㊁来自鱼腥藻(A n a b a e n a s p.P C C7120)的c p e S以及来自螺旋藻S p i r u l i n a s p.的a p c B基因构建表达载体,成功表达重组别藻蓝蛋白β亚基[20]㊂本研究利用分子生物学技术克隆了A.p l a t e n s i s F A C H B314中的脱辅基别藻蓝蛋白基因a p c A B并分析预测了其单亚基基因a p c A和a p c B,结合本实验室前期在同物种中得到的藻蓝胆素合成相关基因(h o1和p c y A)以及色基裂合酶基因(c p c E㊁c p c F㊁c p c U㊁c p c S和c p c T),分别构建了2个分别表达a p c A和a p c B单亚基的重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A和E.c o l i H P E-F U S T B,分析重组菌株的蛋白表达和荧光活性,为研究蓝藻中藻胆体的组装和光学活性提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药㊁荧光检测方面应用奠定基础㊂1材料和方法1.1藻种和质粒钝顶节旋藻(A.p l a t e n s i s F A C H B314)由中国海洋大学藻类遗传育种和生物技术实验室保存,培养温度为25ħ,光照周期为12Lʒ12D㊂E.c o l i B L21 (D E3)C h e m i c a l l y C o m p e t e n t C e l l购自T S I N G K E,表达载体p A C Y C D u e t-1和p E T-24a(+)购自N o v a g e n (G e r m a n y)㊂本实验室构建并保存含有A.p l a t e n s i s F A C H B314中克隆的亚铁血红素氧化酶基因(h o)㊁铁氧还蛋白还原酶基因(p c y A)以及色基裂合酶基因(c p c U㊁c p c S㊁c p c T㊁c p c E和c p c F)的p E T-24a(+)-h o-p c y A-c p c U S T㊁p A C Y C D u e t-c p c E F质粒㊂1.2节旋藻基因组D N A的提取使用T A K A R A植物基因组D N A提取试剂盒(T a K a R a M i n i B E S T P l a n t G e n o m i c D N A E x t r a c t i o n K i t)提取节旋藻基因组D N A,获得的D N A置于-20ħ环境中保存㊂1.3脱辅基别藻蓝蛋白基因簇a p c A B以及a p c A、a p c B的克隆及序列分析参照在G e n B a n k数据库(h t t p://w w w.n c b i.n l m. n i h.g o v/g e n b a n k)中已报道的A.p l a t e n s i s Y Z g e-n o m e(G e n B a n k:C P013008.1)的脱辅基别藻蓝蛋白基因序列设计引物,如表1(酶切位点处以下划线表示)所示,以提取出的A.p l a t e n s i s F A C H B314基因组D N A 为模板,扩增得到脱辅基别藻蓝蛋白a p c A B基因簇序列,连接T载体p E A S Y T1-a p c A B,对获得的序列进行测序验证㊂经分析预测设计引物(见表1),克隆脱辅基别藻蓝蛋白α亚基和β亚基分别对应的基因a p c A 和a p c B,并均连接T载体,以获得p E A S Y T1-a p c A 和p E A S Y T1-a p c B㊂表1引物设计列表T a b l e1P r i m e r s l i s t s引物名称P r i m e r n a m e引物序列P r i m e r s e q u e n c e内切酶E n d o n u c l e a s ea p c A B314-F5 -G G A T C C G A T G A G T A T C G T T A C C A A A T C C A T C G-3 B a m HⅠa p c A B314-R5 -G A G C T C T T A G C T C A A G C C A G A G C A G A T G T A A-3 S a cⅠa p c A314-F5 -G G A T C C G A T G A G T A T C G T T A C C A A A T C C A T C G-3 B a m HⅠa p c A314-R5 -G A G C T C T T A T G A C A T T G C A C C A A T T A G G T A G-3 S a cⅠa p c B314-F5 -G G A T C C G A T G C A A G A C G C A A T C A C T T C C G T A-3 B a m HⅠa p c B314-R5 -G A G C T C T T A G C T C A A G C C A G A G C A G A T G T A A-3 S a cⅠ注:下划线处为酶切位点㊂T h e s i t e s o f e n z y m e d i g e s t i o n a r e u n d e r l i n e d.对获得的单亚基基因序列进行测序验证和分析㊂通过D N A m a n软件(开发商:L y n n o n C o r p o r a t i o n, Q u e b e c,C a n a d a)确定基因的氨基酸序列,通过B L A S T程序(h t t p://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/B L A S T/)对基因的保守结构域进行分析,确定其编码框[21]㊂利用E x p e r t蛋白分析系统(h t t p://w w w.e x p a s y.o r g)对氨基酸序列进行理论等电点和分子量预测[22]㊂通过G e-n o m e(h t t p://w w w.g e n o m e.j p/t o o l-b i n/c l u s t a l w)进行多序列比对,利用M E G A7.0程序构建系统进化树[23]㊂多序列比对及构建进化对所用序列来源于N C-B I数据库(h t t p://w w w.n c b i.n l m n i h.g o v l)㊂1.4表达载体p A C Y C D u e t-a p c A-c p c E F和p A C Y C-D u e t-a p c B-c p cE F的构建使用快速内切酶B a m HⅠ和S a cⅠ对得到的克隆质粒p E A S Y T1-a p c A和p E A S Y T1-a p c B分别进行双酶切,分别得到a p c A和a p c B两个片段;同时对2612期毕莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究实验室前期构建的载体p A C Y C D u e t-c p c E F同样用B a m HⅠ和S a cⅠ两个快速内切酶双酶切,然后将两个片段分别连入载体中,从而获得表达质粒p A C Y C D u-e t-a p c A-c p c E F和p A C Y C D u e t-a p c B-c p c E F㊂将重组表达载体p A C Y C D u e t-a p c A-c p c E F和p A C Y C D u e t-a p c B-c p c E F分别同实验室前期构建的含有合成藻蓝胆素相关基因的表达载体p E T-24a(+)-h o-p c y A-c p c U S T共同转化至表达菌株E.c o l i B L21 (D E3)中,分别得到重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A 和E.c o l i H P E F U S T B㊂1.5重组菌株的诱导表达将表达菌株E.c o l i H P E F U S T A㊁E.c o l i H P E-F U S T B和空白对照E.c o l i B L21菌种分别接种到200m L溶菌肉汤(L B)液体培养基中于37ħ200r/m i n 条件下进行扩大培养㊂其中,表达菌株E.c o l i H P E-F U S T A㊁E.c o l i H P E F U S T B的培养基中加入抗生素硫酸卡那霉素和氯霉素(1ʒ1000),空白对照E.c o l i B L21的培养基不加抗生素㊂当吸光度(O D)达到0.6时,向重组菌液中分别加入浓度为1m o l/L的I P T G至终浓度为0.1m m o l/L㊂在30ħ200r/m i n条件下诱导重组蛋白表达4h㊂然后再次测定表达后的O D600以保证得到菌量相同㊂将相同菌量的菌液离心后,先用5m L0.9%N a C l进行溶液洗涤,再在4ħ10000r/m i n 下离心20m i n后,用4m L P B S母液重悬后,然后使用超声将其破碎6m i n,最后在4ħ10000r/m i n下离心20m i n后取上清㊂同时收集菌液进行S D S-P A G E 和W e s t e r n B l o t检测,收集上清进行荧光发射光检测㊂1.6重组菌株的S D S-P A G E和W e s t e r n B l o t检测重组蛋白通过15%分离胶(供应商:M D B i o,T a i w a n, C h i n a)的S D S-P A G E检测,用C o o m a s s i e B l u e R-250(供应商:S a n g o n B i o t e c h,Q i n g d a o,C h i n a)染色观察㊂W e s t e r n B l o t使用别藻蓝蛋白特异性抗体(供应商:B o s t e r B i o l o g i c a l T e c h n o l o g y C o.L t d.)为一抗(比例为1ʒ1000),H R P标记山羊抗兔I g G(S a n g o n B i o-t e c h,C h i n a)为二抗(比例为1ʒ2000)㊂1.7重组菌株的荧光发射光谱检测利用荧光分光光度计H I T A C H I F-4600进行荧光发射光谱分析㊂狭缝宽度为10.0n m,扫描速度为1200n m/m i n[24]㊂根据最高荧光发射峰反向扫描得到的最高荧光激发峰检查菌株的荧光发射光谱㊂在600n m激发光下检测别藻蓝蛋白A P C的荧光发射光谱,计算单位质量A P C的荧光强度:单位质量A P C的荧光强度=荧光发射峰值/A P C浓度㊂2结果分析2.1基因簇a p c A B同a p c A和a p c B的克隆及序列比对分析2.1.1脱辅基别藻蓝蛋白a p c A B基因簇的克隆脱辅基别藻蓝蛋白a p c A B基因全长共1056b p,经B l a s t 程序序列比对及D N A M A N软件氨基酸预测可以发现,a p c A B基因由a p c A和a p c B两个基因串联组成,中间间隔了84b p,故又称为a p c A B基因簇,其基因序列及氨基酸序列如图1所示,图1中下划线处为间隔序列㊂为了便于基因表达和功能分析,本研究进一步克隆了脱辅基别藻蓝蛋白单亚基基因a p c A和a p c B㊂图1a p c A B基因簇的核苷酸及氨基酸序列F i g.1 N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d a m i n o a c i d o f a p c A B g e n e c l u s t e r36中国海洋大学学报2023年2.1.2脱辅基别藻蓝蛋白a p c A基因的克隆及序列分析以A.p l a t e n s i s F A C H B314基因组D N A为模板,以a p c A314-F和a p c A314-R为引物扩增得到a p c A 基因,经克隆得到的a p c A基因序列及氨基酸序列如图2所示㊂经本文1.3节所提及的软件分析通知:a p c A 基因全长486b p,G C含量为50.2%;a p c A基因无内含子,共编码161个氨基酸;预测编码蛋白A p c A等电点为4.89,预测分子量约为17.39k D a;A p c A正电荷残基(A s p+G l u)23个,负电荷残基(A r g+L y s)18个,不稳定系数经计算为32.24(<40),表明蛋白是稳定的㊂同保守结构域数据库比对结果如图3所示,A p c A 属于G l o b i n_l i k e超级家族,这种珠蛋白结构域超级家族包含各种各样的全螺旋蛋白,它们结合卟啉㊁藻胆素和其他非血红素辅因子㊂57~126位氨基酸是可能的色基结合区域㊂如图4所示,它的氨基酸序列在蓝藻中较为保守,相似度为91.84%,同红藻之间的序列相似度为90.68%,包含的保守结构域有T K S I V N A D A E A R Y L S P G E L-D R I K㊁L F Q K R P D㊁G N A Y G㊁E M T A T C L R D㊁D Y Y L-R L㊁T P I E E I G和S L G T P㊂第81位氨基酸在一个保守的半胱氨酸,推测可能是色基结合位点㊂图2a p c A基因的核苷酸及推测的氨基酸序列F i g.2 N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d o f a p c A g e ne图3A.p l a t e n s i s F A C H B314A p c A保守结构域数据库比结果F i g.3 R e s u l t s o f A p c A c o n s e r v e d d o m a i n d a t a b a s e c o m p a r i s o n(图中黑色方框代表保守结构域,所选取的物种为A r t h r o s p i r a e r d o s e n s i s e b(A E V40861.1)㊁L y n g b y a s p.P C C8106(W P_009787434.1)㊁P l a n k t o t h r i x s p.U B A8402(H A N74958.1)㊁S y n e c h o c o c c u s s p.P C C73109(W P_062434871.1)㊁O s c i l l a t o r i a l e s M T P1(W P_058881332.1)㊁C a l o t h r i x d e s e r t i c a(W P_ 127083433.1)㊁P y r o p i a y e z o e n s i s(p d b|1K N1|A)㊁G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s(M N105086)㊂T h e b l a c k b o x i n t h e f i g u r e r e p r e s e n t s t h e c o n s e r v a t i v e d o m a i n,a n d t h e s e l e c t e d s p e c i e s a r e A r t h r o s p i r a e r d o s e n s i s e b(A E V40861.1),L y n g b y a s p.P C C8106(W P_009787434.1),P l a n k t o t h r i x s p.U B A8402 (H A N74958.1),S y n e c h o c o c c u s s p.P C C73109(W P_062434871.1),O s c i l l a t o r i a l e s M T P1(W P_058881332.1),C a l o t h r i x d e s e r t i c a(W P_ 127083433.1),P y r o p i a y e z o e n s i s(p d b|1K N1|A),G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s(M N105086).)图4 A p c A同源序列比对结果F i g.4 T h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e a n a l y s i s r e s u l t s o f A p c A4612期毕 莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究图5为钝顶节旋藻(A .pl a t e n s i s F A C H B 314)A pc A 氨基酸序列同其他物种最相近氨基酸序列所作的进化树(自展1000次)㊂结果显示,其A pc A 序列与A .e rd o se n s i s e b (A E V 40861.1)以99%的置信度聚为一支,表明其在钝顶节旋藻中较为保守㊂同大型红藻条斑紫菜(P y r o pi a y e z o e n s i s )(p d b |1K N 1|A )和龙须菜(G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s )(M N 105086)的亲缘关系较远且位于不同分支,表明其序列的相似性同物种的亲缘关系一致㊂(节点处的数字代表可信度㊂组之间的进化距离为0.02㊂所选取的物种为A r t h r o s p i r a e r d o s e n s i s e b (A E V 40861.1)㊁L y n g b y a s p .P C C 8106(W P _009787434.1)㊁P l a n k t o t h r i x s p .U B A 8402(H A N 74958.1)㊁S yn e -c h o c o c c u s s p.P C C 73109(W P _062434871.1)㊁O s c i l l a t o r i a l e s M T P 1(W P _058881332.1)㊁C a l o t h r i x d e s e r t i c a (W P _127083433.1)㊁P y r o pi a y e z o e n -s i s (p d b |1K N 1|A )㊁G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s (M N 105086)㊂N u m -b e r s r e p r e s e n t e d t h e c r e d i b i l i t y .T h e e v o l u t i o n a r y di s t a n c e b e t w e e n g r o u p s w a s 0.02.T h e t h e s e l e c t e d s p e c i e s a r e A r t h r o s pi r a e r d o s e n s i s (E B :A E V 40861.1),L y n g b ya s p .P C C 8106(W P _009787434.1),P l a n k t o t h r i x s p .U B A 8402(H A N 74958.1),S yn e c h o c o c c u s s p .P C C 73109(W P _062434871.1),O s c i l l a t o r i a l e s M T P 1(W P _058881332.1),C a l o t h r i x d e s e r t i c a (W P _127083433.1),P y r o pi a y e z o e n s i s (p d b |1K N 1|A ),G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105086).)图5 A pc A 系统进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f A pc A 2.1.3脱辅基别藻蓝蛋白a pc B 基因的克隆及序列结构分析 以A .p l a t e n s i s F A C H B 314基因组D N A 为模板,以a p c B 314-F 和a pc B 314-R 为引物扩增得到a p c B 基因㊂经克隆得到的a pc B 基因序列及A p c B 氨基酸序列如图6所示㊂a pc B 基因全长486b p ,G C 含量为48.1%,理论等电点为6.25,预测分子量约为17.33k D a ,无内含子,共编码161个氨基酸,正电荷残基(A s p +G l u )16个,负电荷残基(A r g +L ys )16个,不稳定系数经计算为25.81(<40),表明蛋白是稳定的㊂图6 a pc B 基因的核苷酸及推测的氨基酸序列F i g .6 N u c l e o t ide s e q u e n c e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d of a pc B g e n e 同保守结构域数据库比对结果如图7所示,A pc B 也属于G l o b i n _l i k e 超级家族㊂如图8所示,A p c B 氨基酸序列较为保守,同蓝藻A pc B 氨基酸序列相似度为94.75%,同红藻A p c B 氨基酸序列相似度为84.47%,第60~126位氨基酸是可能的色基结合区域㊂包含的保守结构域:Q D A I T ㊁D V Q G K Y L D ㊁T G E L R V R A ㊁A N A A ㊁L L Y S D ㊁T R P G G N M Y T T R -R Y A A C I R D L D Y Y L R Y ㊁M L A G D ㊁S I L D E R V -L N G L K E T Y N S L G V P ㊁Q A I Q A ㊁K E V T ㊁D A G K E M G和S G L S ㊂第81位是一个保守的半胱氨酸,推测可能是色基结合位点㊂图9为钝顶节旋藻(A .pl a t e n s i s F A C H B 314)A pc B 氨基酸序列同其他物种最相近的氨基酸序列所作的进化树(自展1000次)㊂其中所选取的物种及其序列号为A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1),L i m n o r a ph i s r o b u s t a (W P _046276870.1),P l a n k t o -t h r i x t e p i d a (W P _072720267.1),M i c r o c y s t i s a e r u gi -n o s a (W P _149106796.1),N o s t o c (W P _094349822.1),T r i c h o r m u s a z o l l a e (W P _013191378.1),O s c i l l a t o r i a s p .P C C 10802(W P _017720775.1),G r a c i l a r i o ps i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105087).结果显示,其A p c B 序列同A r t h r o s pi r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1)以97%的置信度聚为一支,表明A p c B 序列在钝顶节旋藻中较为保守;其A p c B 序列同G .l e m a n e i fo r m i s (M N 105086)A pc B 序列位于不同分支,表明其同蓝藻亲缘关系较远㊂2.2 别藻蓝蛋白的重组表达为研究从A .pl a t e n s i s F A C H B 314中获得的脱辅56中 国 海 洋 大 学 学 报2023年基别藻蓝蛋白的单亚基是否能在体外同藻蓝胆素结合并组装成具有荧光活性的别藻蓝蛋白,在I P T G 浓度为0.1m m o l /L 下对转化菌株E .c o l i H P E F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B 以及空白对照E .c o l i B L 21进行4h的诱导表达(30ħ,200r /m i n)㊂将诱导表达好的菌株制成蛋白样品进行S D S -P A G E 和W e s t e r n B l o t 检测㊂图7 A .pl a t e n s i s F A C H B 314A p c B 保守结构域数据库比对的结果F i g .7 A l i g n m e n t r e s u l t s o f A .pl a t e n s i s A p c B F A C H B 314c o n s e r v a t i v e d o m a i n d a t a b a se (图中黑色方框代表保守结构域,所选取的物种为A r t h r o s p i r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1)㊁L i m n o r a ph i s r o b u s t a (W P _046276870.1)㊁P l a n k t o t h r i x t e p i d a (W P _072720267.1)㊁M i c r o c y s t i s a e r u gi n o s a (W P _149106796.1)㊁N o s t o c (W P _094349822.1)㊁T r i c h o r m u s a z o l l a e (W P _013191378.1)㊁O s c i l l a t o -r i a s p .P C C 10802(W P _017720775.1)㊁G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105087)㊂T h e b l a c k b o x i n t h e f i g u r e r e p r e s e n t s t h e c o n s e r v a t i v e d o m a i n ,a n d t h e s e l e c t e d s p e c i e s a r e A r t h r o s p i r a p l a t e n s i s q y 3(A G U 69492.1),L i m n o r a p h i s r o b u s t a (W P _046276870.1),P l a n k t o t h r i x t e pi d a (W P _072720267.1),M i c r o c y s t i s a e r u gi n o s a (W P _149106796.1),N o s t o c (W P _094349822.1),T r i c h o r m u s a z o l l a e (W P _013191378.1),O s c i l l a t o r i a s p .P C C 10802(W P _017720775.1),G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i fo r m i s (M N 105087).)图8 A pc B 同源序列比对结果F i g .8 T h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e a n a l y s i s r e s u l t s o f A pcB (节点处的数字代表置信度㊂组之间的进化距离为0.02㊂N u m b e r s r e -p r e s e n t e d t h e c r e d i b i l i t y .T h e e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e b e t w e e n g r o u ps w a s 0.01.)图9 A pc B 系统进化树F i g .9 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f A pc B S D S -P A G E 结果如图10所示,除空白对照外,重组菌株E .c o l i H P E F U S T A 和E .c o l i H P E F U S T B在大于14k D a 的位置均出现了条带,这同天然脱辅基别藻蓝蛋白单亚基约17k D a 大小相近㊂W e s t e r n B l o t 结果如图11所示,使用别藻蓝蛋白特异性抗体杂交时,除空白对照外,重组表达菌株E .c o l i H P E F U S T A和E .c o l i H P E F U S T B 也均在约17k D a 大小出现了特异性的杂交带㊂S D S -P A G E 和W e s t e r n B l o t 结果均证明重组菌株E .c o l i H P E F U S T A 和E .c o l i H P E -F U S T B 中有别藻蓝蛋白单亚基的表达㊂6612期毕 莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究(M :标记;B :空白对照E .c o l i B L 21;泳道1㊁2分别为E .c o l i H P E -F U S T A 和E .c o l i H P E F U S T B ㊂箭头所指为重组菌株E .c o l i H P E -F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B 出现的条带㊂M :M a r k e r ;B :B l a n k c o n -t r o l E .c o l i B L 21;L a n e 1,2w e r e E .c o l i H P E F U S T A a n d E .c o l iH P E F U S T B ,r e s p e c t i v e l y.T h e a r r o w s i n d i c a t e t h e b a n d s o f E .c o l i H P E F U S T A a n d E .c o l i H P E F U S T B .)图10 重组菌株的S D S -P A G EF i g.10 S D S -P A G E o f r e c o m b i n a n t s t r a i n s 2.3重组表达菌株的荧光发射光谱分析在600n m 波长光激发下,重组表达菌株的荧光发射光谱如图12所示㊂结果显示,除了空白对照外,重组表达菌株E .c o l i H P E F U S T A 和E .c o l i H P E -F U S T B 均在约640n m 处有荧光峰,表明重组菌株均合成了具有荧光活性的别藻蓝蛋白㊂其中E .c o l iH P E F U S T B 的单位质量荧光强度为538.27ʃ1.26,E .c o l i H P E F U S T A 的荧光强度(514.01ʃ2.88)相比于E .c o l i H P E F U S T B 的单位质量荧光强度略低(见表2)㊂(M :标记;B :空白对照E .c o l i B L 21;泳道1㊁2分别为E .c o l i H P E -F U S T A 和E .c o l i H P E F U S T B ㊂箭头所指为重组菌株E .c o l i H P E -F U S T A ㊁E .c o l i H P E F U S T B 出现的杂交带㊂M :M a r k e r ;B :B l a n kc o n t r o l E .c o l i B L 21;L a n e 1,2w e r e E .c o l i H P E F U S T A a nd E .c o l iH P E F U S T B ,r e s p e c t i v e l y .T h e a r r o w s i n d i c a t e h yb r i d i z a t i o n b a n d s o f E .c o l i H P E F U S T A a nd E .c o l i H P E F U S T B .)图11 重组菌株的W e s t e r n B l o tF i g.11 W e s t e r n B l o t o f r e c o m b i n a n t s t r a i ns 图12 重组菌株的荧光发射光谱图F i g .12 F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s pe c t r u m of r e c o m b i n a n t s t r a i n s 表2 重组菌株荧光强度和蛋白质含量的定量分析T a b l e 2 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y an d p r o t e i n c o n t e n t i n t h e r e c o m b i n a n t s t r a i n s 重组菌株R e c o m b i n a n t s t r a m总蛋白浓度T o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n /(m g/m L )A p c 占比P e r c e n t a ge of A p c /%A pc 浓度C o n c e n t r a t i o n o f A p c /(m g /m L )荧光强度F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y单位质量荧光强度F l u r e s c e n c e i n t e n s i t y pe r u n i t m a s s 荧光峰F l u o r e s c e n c epe a k /n m E .c o l i H P E F U S T A39.756.42.541362.15ʃ7.32514.01ʃ2.88640.2E .c o l i H P E F U S T B43.036.62.831523.32ʃ3.57538.27ʃ1.26640.4注:结果表示为三次重复标准偏差的平均值㊂T h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d a s t h e m e a n s o f m e a s u r e m e n t s f r o m t h r e e r e pe a t e d s t a n d a r d d e v i a t i o n s .3 讨论自从B r ya n t 等[14]于1985年在大肠杆菌中成功表达出别藻蓝蛋白基因以来,基因工程技术已被用于别藻蓝蛋白的异源表达㊂随后,具有光学活性的重组别藻蓝蛋白在大肠杆菌中成功表达,藻胆素的合成途径76中国海洋大学学报2023年也逐渐被解析出来[25]㊂脱辅基别藻蓝蛋白是生物合成具有光学活性别藻蓝蛋白的基本元件,本实验从A.p l a t e n s i s F A C H B314中克隆得到了编码脱辅基别藻蓝蛋白a p-c A B,经序列比对和D N A M A N软件的预测发现,a p-c A B包含a p c A和a p c B两段编码框,分别编码别藻蓝蛋白α亚基和β亚基㊂天然别藻蓝蛋白由α和β两个亚基组成,两个亚基组合在一起形成单体,再进一步组合,最终以三聚体(αβ)3的形式存在[8]㊂a p c A与a p c B 在基因结构上串联在一起的,这可能更有利于两个基因协同表达,这同钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基和β亚基基因也是串联在一起的情况是一致的㊂a p c A与a p c B 之间存在84b p的基因间隔区,在A.p l a t e n s i s F A C H B314藻蓝蛋白α亚基和β亚基基因之间也存在一段112b p的间隔区[26],基因间隔区可能具有启动子或增强子功能,在调节两个基因表达中发挥作用㊂a p c A和a p c B基因全长均为486b p,共编码161个氨基酸,无内含子,G C含量分别为50.2%和48.1%,预测分子量分别约为17.39和17.33k D a;保守结构域分析显示A pc A和A p c B都属于G l o b i n_l i k e超级家族,系统进化树分析表明它们的氨基酸序列在蓝藻和钝顶节旋藻中较为保守,序列相似度高于其二者在红藻中的相似度㊂有荧光活性的别藻蓝蛋白的产生需要别藻蓝蛋白的α亚基和β亚基半胱氨酸残基分别结合藻蓝胆素[6-7]㊂根据保守结构域分析显示A p c A的57~126位氨基酸,A p c B的60-126位氨基酸是可能的色基结合区域㊂其中α亚基和β亚基第81位各有一个半胱氨酸,藻蓝胆素是通过半胱氨酸结合到藻胆蛋白亚基上的,因此α亚基和β亚基第81位的半胱氨酸可能为藻蓝胆素的结合位点㊂为了研究脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基是否能在体外同藻蓝胆素结合并组装成具有荧光活性的别藻蓝蛋白,本研究进一步构建了含有脱辅基别藻蓝蛋白单亚基基因的质粒p A C Y C D u e t-a p c A-c p c E F 和p A C Y C D u e t-a p c B-c p c E F,同实验室前期构建的含有合成藻蓝胆素相关基因的表达载体p E T-24a(+)-h o-p c y A-c p c U S T共同转化至表达菌株E.c o l i B L21 (D E3)中,构建出能够合成荧光活性别藻蓝蛋白单独亚基的重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A㊁E.c o l i H P E F U S T B㊂经诱导表达后,S D S-P A G E结果显示重组菌株在17k D a左右均有明显的条带,W e s t e r n B l o t 结果显示特异性抗体杂交下重组菌株在特定位置也有明显的杂交条带,说明重组菌株中都有别藻蓝蛋白亚基的合成㊂荧光发射光谱显示,重组表达菌株E.c o l i H P E F U S T A和E.c o l i H P E F U S T B均在约640n m 处有荧光峰,其中E.c o l i H P E F U S T A的单位质量荧光强度为514.01ʃ2.88,E.c o l i H P E F U S T B的单位质量荧光强度为538.27ʃ1.26,这表明重组菌株均合成了具有荧光活性的别藻蓝蛋白㊂但相比于天然别藻蓝蛋白特征荧光峰660n m,出现了20n m的蓝移㊂这一结果同文献[15,27]中的结果类似,重组别藻蓝蛋白h o l o-A p c A S㊁h o l o-A p c A T和h o l o-A p c B T的荧光发射峰分别出现于639㊁638和642n m㊂这可能与本研究中表达的是单一亚基有关,而且可能同体外重组表达造成重组蛋白的构象不同于天然组装蛋白的构象相关㊂此外,有研究表明藻蓝胆素与脱辅基别藻蓝蛋白结合的稳定性也会影响光学性质[28]㊂本研究重组表达了有光学活性的A.p l a t e n s i s F A C H B314别藻蓝蛋白单亚基,为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件㊁别藻蓝蛋白在医药及荧光检测方面的应用奠定了基础㊂参考文献:[1]姜晓杰,高金亮,祁美荣,等.钝顶螺旋藻别藻蓝蛋白α㊁β亚基基因的克隆及其原核表达[J].中国生物制品学杂志,2015,28:356-359.J i a n g X J,G a o J L,Q i M R,e t a l.C l o n i n g a n d p r o k a r y o t i c e x-p r e s s i o n o fαa n dβs u b u n i t s o f a l l o p h y c o c y a n i n f r o m S p i r u l i n a p l a t e n s i s[J].C h i n e s e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l s,2015,28:356-359.[2]张学成,信式祥,李清华,等.节旋藻 最完美的功能食品[M].青岛:青岛海洋大学出版社,1999:55-89.Z h a n g X C,X i n X X,L i Q H,e t a l.A r t h r o s p i r a t h e M o s t P e r-f e c t F u n c t i o n a l F o o d[M].Q i ng d a o:Q i n g d a o O c e a n U n i v e r s i t yP r e s s,1999:55-89.[3]林凡,邹立红,秦松,等.抗肿瘤海洋药物-基因重组藻胆蛋白的研制[C]//中国科学院海洋科学青年学术研讨会暨2001年海洋湖沼科学青年学者论坛论文摘要集.青岛:中国科学院海洋研究所,2001:65.L i n F,Z o u L H,Q i n S e t a l.D e v e l o p m e n t o f a n t i t u m o r m a r i n ed r u g-ge n e r e c o m b i n a n t p h y c o b i l i p r o t e i n[C]//A b s t r a c t E s s e n t i a lS e t o f S y m p o s i u m f o r Y o u n g S c h o l a r s i n M a r i n e S c i e n c e s a n d F o-r u m f o r Y o u n g S c h o l a r s i n M a r i n e L i m n o l o g y,C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s.Q i n g d a o:C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s,2001:65.[4]林莉萍,袁胜涛,陆丽娟,等.雷普克的制备和抗肿瘤活性研究[C]//第一届海洋生物高技术论坛论文集.舟山:国家 863 计划资源环境技术领域办公室,2003.L i n L L,Y u a n S T,L u L J,e t a l.P r e p a r a t i o n a n d a n t i t u m o r a c-t i v i t y o f R e p k e[C]//T h e F i r s t M a r i n e B i o l o g y H i g h T e c h n o l o g yF o r u m P r o c e e d i n g s.Z h o u s h a n:N a t i o n a l"863"P r o g r a m R e s o u r c ea n d E n v i r o n m e n t a l T e c h n o l o g y F i e l d O f f i c e,2003.[5]王庭健.天然藻胆蛋白的提取与纯化及其与基因重组藻胆蛋白抗氧化活性的比较研究[D].长春:吉林大学,2005.W a n g T J.E x t r a c t i o n a n d P u r i f i c a t i o n o f N a t u r a l P h y c o b i l i p r o t e i na n d C o m p a r i s o n o f I t s A n t i o x i d a n t A c t i v i t y w i t h R e c o mb i n a n t P h y-c o b i l i p r o t e i n[D].C h a n g c h u n:J i l i n U n i v e r s i t y,2005.[6]蒲洋,葛保胜,秦松,等.一种定向重组别藻蓝蛋白三聚体作为光学敏化材料的应用:中国,C N103680971B[P].2016-12-21.P u Y,G e B S,Q i n S,e t a l.A p p l i c a t i o n o f a D i r e c t e d R e c o m b i n a n t8612期毕莹,等:钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆㊁分析及重组表达蛋白荧光活性的研究A l l o p h y c o c y a n i n T r i m e r a s a n O p t i c a l S e n s i t i z a t i o n M a t e r i a l:C h i-n a,C N103680971B[P].2016-12-21.[7]C h e n H,J i a n g P.C o m b i n a t i o n a l b i o s y n t h e s i s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f u s i o n p r o t e i n s w i t h t a n d e m r e p e a t s o f a l l o p h y c o c y a n i n h o l o-αs u b u n i t s,a n d t h e i r a p p l i c a t i o n a s b r i g h t f l u o r e s c e n t l a b e l s f o r i m-m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y[J].J o u r n a l o f B i o s c i e n c e&B i o e n g i n e e r-i n g,2018,126(6):778-782.[8]M a c c o l l R,E i s e l e L E,M e n i k h A.A l l o p h y c o c y a n i n:T r i m e r s,m o n o m e r s,s u b u n i t s,a n d h o m o d i m e r s[J].B i o p o l y m e r s,2003,72(5):352-365.[9] M a c c o l l R.A l l o p h y c o c y a n i n a n d e n e r g y t r a n s f e r[J].B B A-B i o e n e r-g e t i c s,2004,1657(2):73-81.[10]B i s w a s A,V a s q u e z Y M,D r a g o m a n i T M,e t a l.B i o s y n t h e s i s o fc y a n o b a c t e r i a l p h y c o b i l i p r o t e i n s i n E s c h e r i c h i a c o l i:C h r o m o p h o-r y l a t i o n e f f i c i e n c y a n d s p e c i f i c i t y o f a l l b i l i n l y a s e s f r o m S y n e c h o-c o c c u s s p.s t r a i n P C C7002[J].A p p l i ed a n d E n v i r o n me n t a l M i-c r o b i o l o g y,2010,76(9):2729-2739.[11] T o o l e y A J,C a i Y A,G l a z e r A N.B i o s y n t h e s i s o f a f l u o r e s c e n tc y a n o b a c t e r i a l C-p h y c o c y a n i n h o l o-a l p h a s u b u n i t i n a h e t e r o l o g o u sh o s t[J].P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h eU n i t e d S t a t e s o f A m e r i c a,2001,98(19):10560-10565 [12] K a h n K,M a z e l D,H o u m a r d J,e t a l.A r o l e f o r c p e Y Z i n c y a-n o b a c t e r i a l p h y c o e r y t h r i n b i o s y n t h e s i s[J].J o u r n a l o f B a c t e r i o l o-g y,1997,179:998-1006.[13]S a m s o n o f f W A,M a c c o l l R.B i l i p r o t e i n s a n d p h y c o b i l i s o m e s f r o mc y a n o b a c t e r i a a nd re d a l g a e a t t h e e x t r e m e s of h a b i t a t[J].A r-c h i v e s o f M i c r o b i o l o g y,2001,176:400-405.[14]B r y a n t D A,D u b b s J M,F i e l d s P I,e t a l.E x p r e s s i o n o f p h y c o-b i l i p r o t e i n g e n e s i n E sc h e r i c h i a c o l i[J].F e m s M i c r o b i o l o g y L e t-t e r s,1985,29:343-349.[15]C h e n H X,L i n H Z,L i F C,e t a l.B i o s y n t h e s i s o f a s t a b l e a l l o-p h y c o c y a n i n b e t a s u b u n i t i n m e t a b o l i c a l l y e n g i n e e r e d E s c h e r i c h i ac o l i[J].J o u r n a l o f B i o s c i e n c e a nd B i oe n g i n e e r i n g,2013,115:485-489.[16] L i u S,C h e n Y,L u Y,e t a l.B i o s y n t h e s i s o f f l u o r e s c e n t c y a-n o b a c t e r i a l a l l o p h y c o c y a n i n t r i m e r i n E s c h e r i c h i a c o i l[J].P h o t o-s y n t h e s i s R e s e a r c h,2010,105:135-142.[17]马建飞,林瀚智,秦松,等.蓝藻藻胆体的体外组装研究进展[J].中国科学:生命科学,2016,46:1054-1061.M a J F,L i n H Z,Q i n S,e t a l.A d v a n c e s i n i n v i t r o a s s e m b l y o fc y a n o b a c t e r i a p h y c o b i l i s o m e[J].C h i n e s e S c i e n c e:B i o s c i e n c e,2016,46:1054-1061.[18]唐志红,秦松,吴少杰,等.镭普克的制备及对小鼠H22肝癌的抑制作用[J].高技术通讯,2004,14(3):83-86.T a n g Z H,Q i n S,W u S J,e t a l.P r e p a r a t i o n o f r a d i u m P u k e a n di t s i n h i b i t o r y e f f e c t o n H22h e p a t o m a i n m i c e[J].H i g h T e c h n o l o-g y N e w s l e t t e r,2004,14(3):83-86.[19] H u I C,L e e T R,L i n H F,e t a l.B i o s y n t h e s i s o f f l u o r e s c e n t a l-l o p h y c o c y a n i nα-s u b u n i t s b y a u t o c a t a l y t i c b i l i n a t t a c h m e n t[J].B i o c h e m i s t r y,2006,45:7092-7099.[20] G e B S,S u n H X,F e n g Y,e t a l.F u n c t i o n a l b i o s y n t h e s i s o f a na l l o p h y c o c y a nb e t a s u b u n i t i n E sc h e r i c h i a c o l i[J].J o u r n a l o f B i o-s c i e n c e a n d B i o e n g i n e e r i n g,2009,107:246-249. [21]W h e e l e r D,B h a g w a t M.B L A S T Q u i c k S t a r t:E x a m p l e-d r i v e nw e b-b a s e d B L A S T t u t o r i a l[J].M e t h o d s i n M o l e c u l a r B i o l o g y, 2007,395:149-176.[22]L a i X J,G u Y H,T a o X,e t a l.C l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o fu r i d i n e d i p h o s p h a t e g l u c o s e d e h y d r o g e n a s e g e n e f r o m I p o m o e ab a t a t a s[J].R u s s i a n J o u r n a l o f P l a n t P h y s i o l o g y,2014,61:298-308.[23] K u m a r S,S t e c h e r G,T a m u r a K.M E G A7:M o l e c u l a r E v o l u t i o n-a r y G e n e t i c s A n a l y s i s V e r s i o n7.0f o rb i g g e r d a t a s e t s[J].M o l e c-u l a r B i o l o g y a n d E v o l u t i o n,33(7):1870-1874.[24] S u n D,Z a n g X,G u o Y,e t a l.C l o n i n g o f p c B a n d p c A G e n ef r o m G r a c i l a r i o p s i s l e m a n e i f o r m i s a n d e x p r e s s i o n o f a f l u o r e s-c e n t p h y c o c y a n i n i n h e t e r o l o g o u s h o s t[J].G e n e s(B a s e l),2019,10(5):322.[25] Y a n g Y,G e B,G u a n X,e t a l.C o m b i n a t i o n a l b i o s y n t h e s i s o f af l u o r e s c e n t c y a n o b a c t e r i a l h o l o-a l p h a-a l l o p h y c o c y a n i n i n E s c h e-r i c h i a c o l i[J].B i o t e c h n o l o g y L e t t e r s,2008,30:1001-1004.[26]衣俊杰.节旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究[M].青岛:中国海洋大学,2010.Y i J J.A u t o c a t a l y t i c R e c o m b i n a t i o n o f P h y c o c y a n i n f r o m A r t h r o-s p i r a a n d C o m p a r a t i v e S t u d y o n t h e F u n c t i o n s o f P h y c o c y a n b i l i n L i g a s e[M].Q i n g d a o:O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a,2010. [27]C h e n H X,L i u Q Z,Z h a o J,e t a l.B i o s y n t h e s i s,s p e c t r a l p r o p e r-t i e s a n d t h e r m o s t a b i l i t y o f c y a n o b a c t e r i a l a l l o p h y c o c y a n i n h o l o-αs u b u n i t s[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f B i o l o g i c a l M a c r o m o l e c u l e s, 2016,88:88-92.[28]周孙林.别藻蓝蛋白的生物合成及其稳定性研究[M].衡阳:南华大学,2014.Z h o u S L.B i o s y n t h e s i s a n d S t a b i l i t y o f A l l o p h y c o c y a n i n[M].H e n g y a n g:U n i v e r s i t y o f S o u t h C h i n a,2014.96。
藻胆蛋白的生物合成及光谱分析作者：邱容朱焱谢雪林作者单位：湖北师范学院生命科学学院0803班（邱容、朱焱）湖北师范学院生命科学学院0801班（谢雪林）摘要: 藻胆蛋白是红藻、蓝绿藻、隐藻中的捕光色素蛋白，主要成分为藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC),藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(Allophyxoxyanin,APC)。
本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入E.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。
提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。
关键词：藻蓝蛋白生物合成光谱分析Abstract: Phycobilin , a kind of protein which can catch light ,exist in Red algae, blue-green algae, cryptomonad.It consists of Phycoerythrin(PE),Phycoerythrocyanin(PEC),Phycocyanin (PC) and Allophyxoxyanin (APC). This report presents the biosynthesis and spectral analysis of the PC, by sending the plasmids carrying the gene which can produce PC into E.coli, thus creating the engineering bacterium which can procuce PC.Through the expanding culture ,induction and the affinity chromatography，we can extract PC from the engeneering bacterium to obtain PC . Extraction of PCcan be spectral analysed by UV-visible spectrometer.Key words：Phycobilin biosynthesis spectral analysis 藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，存在于红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻体内，是这些藻类特有的光合系统捕光色素，在光合作用中起捕集光能和传递能量的作用，根据结构和光谱特性可将藻胆蛋白分为藻红蛋白、藻蓝蛋白和别构藻蓝蛋白。
藻胆蛋白与单克隆抗体交联试剂的探索D物—藻红蛋白，同时用正辛酸沉淀法纯化TMV 抗血清；经纯度、浓度和抗体效价的测定，获得符合荧光标记的主要材料。
测定了不同pH值、离子强度、添加剂对RPE荧光强度的影响，结果表明：在pH5-9范围内，藻红蛋白的荧光强度能保持较好的稳定性，pH3和pH12时其荧光强度影响很大；0.15-0.2M离子强度的PB(或加0.1-0.2MNaCl溶液)缓冲溶液能保持藻红蛋白的荧光强度的稳定性；添加Tween-20和EDTA时，Tween-20浓度以0.1％为宜，EDTA则以1mmol/L浓度最合适。
筛选了异功能试剂活化组合，建立标记流程，优化交联反应条件。
用异功能试剂SPDP活化藻红蛋白，2-IT巯基化抗体，通过两步交联法制备荧光探针。
同时根据交联反应对藻红蛋白荧光强度和抗体的活性的影响，优化交联反应条件，结果为：试剂SPDP活化藻红蛋白，二者摩尔比100：1，反应时间在0.5-1h之间为宜；2-IT巯基化抗体，二者摩尔比200：1，反应时间2h为宜。
应用硝酸纤维素膜和SephadexG-50葡聚糖凝胶为固相载体，建立免疫检测流程，探讨其在烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)免疫检测上的应用。
以ELISA检测的结果为标准，检测了55份TMV样品。
结果为：阳性的检出率为100％、假阳性的检出率为75％、阴性检出率为83.3％、总体检出率为94.55％，结果表明用藻红蛋白标记的荧光抗体的免疫检测具有较好的特异性。
R-藻红蛋白荧光标记单克隆抗体的研制目的研究国产R-藻红蛋白标记二抗的工艺,对异双功能试剂的用量进行比较实验.方法不同稀释度的异双功能试剂SMCC处理R-PE使之衍生化,SPDP与二抗反应使之衍生化再经DTT 处理从而给二抗引入外源巯基.将二者混合反应完成交联.结果SMCC与R-PE的摩尔比为56:1时,交联物的R-PE与抗体结合比接近1:1,R-PE与抗体的利用率最高.结论以本文所述工艺进行藻红蛋白的荧光标记,交联物荧光强度较高、交联抗体活性损伤很小.。
一种新型重组别藻蓝蛋白及其活性的初步研究藻胆蛋白（phycobiliprotein）是某些藻类中一类重要的捕光色素蛋白，由脱辅基蛋白（apoprotein）和四吡咯结构的藻胆素（phycocyanobilin）共价结合组成，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等多种活性。
借助基因工程技术高效表达的脱辅基蛋白，可应用于医药、化学试剂等领域。
本研究在抗肿瘤新药镭普克（基因重组别藻蓝蛋白，rAPC）研制的基础上，将别藻蓝蛋白基因（apc）亚克隆至pET28（a），构建了与6×his亲和标签（His·tag）融合的新型重组别藻蓝蛋白（His·tag APC，HAPC）。
HAPC的空间结构与镭普克相比，更接近于天然脱辅基别藻蓝蛋白。
以重组菌JM109（DE3）／pET28a-APC作为研究对象，研究了无毒、廉价的乳糖诱导HAPC表达的规律。
进行了5L规模的发酵培养，HAPC的表达率可占菌体可溶性蛋白的30％以上，初步建立了低成本的发酵工艺。
建立了HAPC快速高效的纯化工艺，经过金属离子螯合亲和层析一步纯化后，蛋白纯度达到90％以上，可满足药理试验的需要。
以大剂量环磷酰胺（CTX）腹腔注射小鼠致白细胞（WBC）减少为模型，初步考查了HAPC对免疫系统的影响，发现HAPC（1.5、4.5mg／kg）能显著对抗CTX所致的WBC减少。
用动物移植性肿瘤试验法，发现HAPC能显著升高荷瘤动物的WBC数；配伍CTX后，能对抗CTX所致的白细胞减少。
体外抗氧化实验表明，HAPC能清除活性氧自由基(·OH和O<sub>2</sub><sup>-·</sup>)。
本论文研究结果表明，新型基因重组藻胆蛋白（HAPC）具有显著升高白细胞的作用，提示其良好的应用前景，可用于肿瘤化疗辅助用药和白细胞减少症的治疗。
专利名称：一种微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法与应用专利类型：发明专利
发明人：何苗,盛建武,施汉昌
申请号：CN200710119212.1
申请日：20070718
公开号：CN101125889A
公开日：
20080220
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法与应用。
本发明的微囊藻毒素单克隆抗体是微囊藻毒素－LR的单克隆抗体，它按照包括以下步骤的方法制备：1)在微囊藻毒素－LR的第七位氨基酸残基N－甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基，得到经氨基修饰的微囊藻毒素－LR多肽；将该经氨基修饰的微囊藻毒素－LR多肽与载体蛋白偶联得到完全抗原A；2)将步骤1)的完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；培养所述阳性杂交瘤细胞株或将所述阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水，得到微囊藻毒素－LR的单克隆抗体。
该单克隆抗体可用于微囊藻毒素－LR的检测及其免疫亲和纯化。
申请人：清华大学
地址：100084 北京市海淀区清华园
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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[23]Mayer, Richard S. High-pressure sterilization of foods[J].Food Technology, 2000, 54(11): 67-72.[24]Basak S, Ramaswamy H S, Piette J P G. High pressuredestruction kinetics of Leuconostoc mesenteroides and Sac-charomyces cerevisiae in single strength and concentrated orange juice[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2002, 3(3): 223-231.[25]Hashizume C, Kimura K, Hayashi R. Kinetic analysis ofyeast inactivation by high-pressure treatment at lowtemperatures[J]. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59(8): 1455-1458.[26]Rovere P. Modelling and calculation of the sterilizing effectin high pressure heat treatment. 1999IET Annual Meeting,USA, 1999,18[27]Furukawa, S, Hayakawa,I. Effect of temperature on the in-activation of Bacillus stearothermophilus IFO 12550 spores by low hydrostatic pressure treatment [J]. Biocontrol Science,2001, 6(1): 33-36.[28]潘见, 张文成, 陈从贵, 等. 饮料超高压杀菌实用性工艺及设备探讨[J]. 农业工程学报, 2000, 16(1): 125-128.藻胆蛋白的提取技术与生物活性研究李华佳，杨方美(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)摘 要：藻胆蛋白(Phycobiliprotein ,PBP)是藻类特有的捕光色素蛋白，具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要生理功能，在功能食品、化妆品和药品中有广泛的应用前景。
藻胆蛋白主要生物活性研究进展季宇彬;徐博慧;高世勇【期刊名称】《中国药理通讯》【年(卷),期】2009(026)002【摘要】海藻是海洋生物资源的重要组成部分，蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中存在一类色素复合蛋白一藻胆蛋白（phycobiliproteins），它易溶于水，按光谱特性可分为红色的藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、蓝紫色的藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）和孔雀蓝色的异藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC），并有报道称其中以藻红蛋白为主。
获得藻胆蛋白的主要途径是从海藻中提取分离藻胆蛋白。
目前已知的提取方法主要有：反复冻融法，化学试剂处理法，溶胀法和超声波法等。
目前研究表明，藻胆蛋白的生物活性主要表现在以下三个方面：工作为荧光探针．藻胆蛋白荧光探针可以分为单一性与非单一性两种，分别可以与一个或多个单抗共价结合用于疾病的检测诊断，重要的是，藻胆蛋白作为荧光探针具有荧光强度高、可长期保存且无明显衰减等许多传统荧光染料无法比拟的优越性。
2光敏作用．作为新型光动力药物藻胆蛋白在光动力治疗癌症方面显示出了很好的前景。
藻红蛋白介导的光动力反应能够有效的抑制肿瘤细胞DNA合成并杀伤癌细胞。
3抗肿瘤活性．藻胆蛋白抗肿瘤活性研究广泛，例如R-藻蓝蛋白还能抑制HL-60细胞的生长，且存在浓度效应和时间效应；R-藻红蛋白能将Hela细胞周期阻滞在G2／M期，抑制细胞增殖并诱导细胞调亡等。
最近研究表明藻胆蛋白还具有抗氧化，抗衰老，抗炎，抗病毒等功能，但研究有待进一步深入。
【总页数】2页(P23-24)【作者】季宇彬;徐博慧;高世勇【作者单位】哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心;哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站;教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,黑龙江哈尔滨150076【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展 [J], 张唐伟;李天才2.葛仙米主要生物活性成分和生物活性功能研究进展 [J], 魏芬芬;王文娟;贺青华;张波3.地参主要化学成分及生物活性研究进展 [J], 黄小兰;何旭峰;周祥德;阳文武;谷文超;周浓4.核桃青皮主要成分胡桃醌的生物活性研究进展 [J], 张宏露;罗兴平5.核桃青皮主要成分胡桃醌的生物活性研究进展 [J], 张宏露;罗兴平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
盐藻细胞DsRab蛋白的诱导表达及纯化盐生杜氏藻（Dunaliella salina，以下简称盐藻）的细胞结构简单，具有很强的抗盐能力，可以生长在 5.0 mol/L NaCl 培养液中，而且其培养条件也很简单。
因此，盐藻是研究植物耐盐分子机制的重要模式生物。
研究表明当盐藻在高盐环境胁迫下，体内的蛋白质合成和降解以及能量代谢等多种代谢途径会发生很大程度的改变，其中耐盐作用主要是依靠盐藻中Na+/H+泵和大量合成兼容性溶质甘油，但应答盐胁迫的调控过程还少有报道。
从信号传导方面开展对盐藻抗盐生理调节过程的研究，有助于全面了解盐藻耐盐机制。
小G 蛋白（Small GTP-binding proteins）分子量一般在20-30 kD 之间，以单体形式普遍存在于真核生物中，通过激活态（结合GTP）与非激活态（结合GDP）的转变来行使分子开关作用，参与重要的细胞生理活动，包括信号传导、细胞增殖、囊泡转运、细胞骨架重组等。
Rab 蛋白是小G 蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar 和Ran 5 个亚家族）中最大的亚家族，近年来在酵母、果蝇、拟南芥、烟草、水稻等真核生物中发现的Rab 蛋白遍布于胞内的各个膜区室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab 蛋白定位于特定的细胞器膜上，参与膜泡的形成、定向转运、锚定链接等过程。
现已发现许多与植物的抗逆性有关的Rab 蛋白，其表达量会受到盐胁迫、低温、干旱等逆境条件的影响。
因此，深入了解Rab 蛋白功能及进一步研究植物抗逆性相关蛋白的相互作用网络具有重要科学意义。
本实验室已从盐藻细胞中成功克隆出新的Rab蛋白基因DsRab（GenBank Accession No.JN989548），并用实时荧光定量PCR 方法研究了DsRab基因在盐胁迫下的表达情况，证明DsRab是一个盐诱导上调基因。
本试验构建重组表达载体pGS-21a-DsRab，通过优化诱导表达条件使DsRab 蛋白在上清中的表达量增加，利用GST-SefinoseTMKit 纯化，获得纯度较高的可溶性融合蛋白，为制备抗体以及进一步在蛋白质水平上研究该蛋白在盐藻耐盐性机制中的作用奠定基础。
