藻胆蛋白生物合成与光谱分析

藻胆体与藻胆蛋白研究进展摘要：蓝藻和红藻中的藻胆蛋白通过连接多肤将不同类型的藻胆蛋白按照一定的次序组合在一起,形成高度有序的超分子复合体-藻胆体,存在于光合膜的表面,作为光合作用能量吸收与传递的功能单位。

藻胆体分子量的范围介于7x106至15×106道尔顿之间, 形状及大小与藻的种类密切相关。

【1】外藻胆蛋白的分离纯化主要包括提取原料、细胞破碎法和分离纯化3个方面。

藻胆蛋白其生物活性主要表现在: 抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化和消炎活性, 提高免疫活性。

关键词：藻胆体，藻胆蛋白，分离纯化，超分子结构，能量传递，藻胆体-类囊体膜的天然架构，能量耗散机制1简介：1.1藻胆体藻胆体是由多种藻胆蛋白和连接蛋白组成的超分子蛋白复合物，含有数百个开链四吡咯发色团，分子量高达几百万道尔顿。

【2】藻胆体是红藻及蓝藻中的主要捕光天线，蓝藻和红藻通过附着在类囊体膜表面的藻胆体作为捕光复合物捕获光能并将其传递到光反应中心。

藻胆体主要有半球形和半椭圆形两种。

捕获光能并高效的传递给光反应中心PS2，种种传递给中心PS1。

PS1,PS2,PBS都在类囊体膜上，其形式与高等植物不同，光合作用过程，特别是光反应过程，是由类囊体膜上的超分子复合物实现的。

【3】藻胆体可以分为两部分：核心部分－主要由别藻蓝蛋白(APC)构成；杆状复合物－主要由藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)或藻红蓝蛋白构成。

【8】1.2藻胆蛋白藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中,其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体。

细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多"天线分子"，这些"天线分子"吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的"反应中心"，在红藻、蓝绿藻和隐藻中，藻胆蛋白就充当这种"天线分子"的角色。

因此，最初的藻胆蛋白研究主要集中在探讨其光合作用意义。

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。

二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。

如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。

2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。

盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。

3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。

原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。

1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。

装柱的方法分干装和湿装两种。

干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。

湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。

2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。

加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。

3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。

同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。

4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。

藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。

每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。

冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。

可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。

我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。

2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。

从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。

实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。

由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。

藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究Isolation, purification of phycobiliprotein from Porphyra and itsspectroscopic properties一、实验目的和要求1. 了解藻蛋白的生理意义和功能，藻蛋白一般的纯化方法；2. 掌握盐析和凝胶层析的实验技术；3. 掌握紫外可见光谱仪检测蛋白的方法；4. 了解藻蛋白的荧光发射特性。

二、实验原理藻蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，参与光合作用的能量吸收和传递，主要存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体中。

藻蛋白主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三类。

藻蛋白在藻类中的含量可达细胞干重的25%～28%, 除了作为荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究之外，藻胆蛋白具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要药理功能，在功能食品、化妆品和药品中有广泛的应用前景。

我国藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，是获取藻蛋白的理想资源。

选用紫菜提取藻红蛋白，具有成本低、得率高的优点，具有较好的利用价值。

1．蛋白质的盐析沉淀盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。

2．葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。

是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。

单个凝胶珠本身象“筛子”。

不同类型凝胶的筛孔的大小不同。

相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。

相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。

藻胆蛋白生物合成与光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis ofPhycobiliprotein藻胆蛋白生物合成与光谱分析摘要：藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。

重组有藻胆蛋白（本实验只做藻蓝蛋白）基因的E. coli BL21，在含有kana（24 µg/ml）和氯霉素（40.8µg/ml）的LB培养基中培养。

当OD600达到0.5-0.6时，用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养2.5小时。

加超声缓冲液后用超声破壁离心取上清，得到藻蓝蛋白粗提液。

通过镍-亲和层析对起进行纯化。

关键词：藻胆蛋白生物合成光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis of Phycobiliprotein Abstract：Phycobiliprotein is a kind of light-harvesting chromoprotein existing in blue-green gae, red alga and cryptophyta, which includes phycoarythrin(short form PE), phycocyanin(short form PC), allphycocyanin(short formAPC), phycoerythrocyanin(short form PEC). E. coli BL21 which containsrecombinant phycobiliprotein（only phycocyanin was required in thisexperiment）gene was grown in LB medium containing kanamycin (Finalconcentration: 24μg/mL) and `chloromycetin(Final concentration:40.8μg/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.5 with 0.6,isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 1mM（Finalconcentration）and the incubation was continued an addition 2.5 h. Thecell was broken and centrifugated, then the crude cell extract( supernatant)was harvested. Furthermore it was purified by Ni-affinity chromatography. Key words：phycobiliprotein biosynthesis spectral analysis主要符号对照表PE 藻红蛋白PEC 藻红蓝蛋白APC 别藻蓝蛋白PC 藻蓝蛋白PCB 藻蓝胆素PEB 藻红胆素PUB 藻尿胆素PVB 藻紫胆素E.coli 大肠杆菌OD 光吸收值IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KPP 磷酸钾缓冲液min 分钟h 小时藻胆蛋白生物合成与光谱分析1引言1.1藻胆蛋白藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。

华中科技大学硕士学位论文链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用姓名：蔡芬芬申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：赵开弘2010-12摘要荧光免疫检测技术在现实生活中应用日益广泛，遍及环境污染物监测、医学检验、食品检验等诸多领域，发展迅速。

本研究所涉及的生物素-链霉亲和素系统（BSA）是具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的信号多级放大系统；同时藻胆蛋白的光学和物理性质非常符合新一代荧光免疫标记物的要求。

本研究以pUC57-sa质粒为模板，通过PCR反应扩增出目的基因片段sa，构建表达载体pETDuet-sa。

通过大肠杆菌异源表达，成功制备核心链霉亲和素，对其表达、活性和保存条件等方面进行研究，其分子量为59.2KD，理论活性为16.5u，实测活性16.3u，冻干后可以稳定保存。

将SA-CpcB、藻红胆素合成酶及藻胆蛋白裂合酶进行大肠杆菌体内共表达，得到融合色素蛋白SA-CpcB-PEB。

检测SA-CpcB-PEB的荧光活性，同时将其用于BSA 系统中进行荧光免疫检测，表明SA-CpcB-PEB同时具有藻胆蛋白的荧光特性和SA 与生物素结合的能力。

将SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于BSA荧光免疫检测体系检测微量物质，证实SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于荧光免疫检测体系具有实用意义。

通过研究温度、pH、抑制剂对SA-CpcB-PEB活性以及稳定性的影响，得到其适宜保存条件是4℃、终浓度为1mM EDTA、0.05﹪NaN3、pH为中性、20mM KPB、150mM NaCl的环境，有利于其具体应用。

关键词：荧光免疫荧光探针融合蛋白链霉亲和素藻胆蛋白AbstractFluorescence immunoassay is widely used by environmental pollutants monitoring, medicinal testing, food inspecting and other fields. In this research, Biotin-Streptavidin system(BSA) is a high sensitivity, good specificity and stability of multi-level signal amplification system. Phycobiliprotein could be applied to fluorescence immunoassay, as a new fluorescence probe.The Streptavidin gene was amplified by PCR from the plasmid of pUC57-sa and cloned by the transform of enzyme sites. Core Streptavidin was successfully constructed, and molecular weight is 59.2KD, theoretical activity is 16.5u, measured activity is 16.3u, can be preserved by lyophilized powder for long time.The fusion protein SA-CpcB-PEB was prepared by reconstitution SA-CpcB with PEB in vivo in E.coli. Tested the fluorescence and the property of binding with biotin of SA-CpcB-PEB, the results show that the fusion protein retained the two proteins’s bifunctional effects. By using SA-CpcB-PEB as a fluorescence probe to detect trace substances in BSA fluorescence immunoassay, we believed it can be used for fluorescence immunoassay.By studying the temperature, pH, different inhibitors on the activity and stability of℃the fusion protein SA-CpcB-PEB, got the better storage conditions is 4, 1mM EDTA, 0.05% NaN3, neutral pH, 20mM KPB, 150mM NaCl ,which is beneficial to the specific application.Key words：Fluorescence immunoassay Fluorescence probe Fusion protein Streptavidin Phycobiliprotein缩略词（Abbreviation）pair 碱基对bp baseDTT dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸coli 大肠杆菌E.coli EscherichiaIPTG isoprophyl thio-β-D-galactoside 异丙基硫代半乳糖苷Kan kanamycin 卡那霉素Amp ampicillin 氨苄青霉素Str streptomycin 链霉素Chl Chloramphenicol(chloromycetin) 氯霉素kD kilodalton 千道尔顿KPB potassium phosphate buffer 磷酸钾缓冲液ME β-mercaptoethanol β-巯基乙醇BSA Biotin Streptavidin System 生物素-链霉亲和素系统PEB phycoerythrobilin 藻红胆素PE Phycoerythrin 藻红蛋白SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三（羟甲基）氨基甲烷Tris tris(hydroxymethyl)aminomethanerpm revolution per minute 每分钟转数独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

human and rat CN TF.J Neurochem,1991,57(3):1003～10125　咸海青,范　明,甘思德,等(Xian H Q,Fan M,G an S D, et al).人睫状神经营养因子的原核表达纯化及其生物效应.中国应用生理学杂志(Chinese J Appli Phsiol),1996,12(1): 21～246　Daniel M B,Stuart J E.Protein Methods.New Y ork:Wiley2Liss Press,1991.50～1607　Marston F A O,Freedman F B.Recovery and reaction of recombi2 nant proteins.Biochem Soc Trans,1988,16(1):101～1038　Marston F A O,Angal S,Lowe P A,et al.Scale2up of the recovery and reaction of recombinant proteins.Biochem Soc Trans, 1988,16(1):112～1159　Doonan S,Walter J M.Downstream processing of protein products.Biochem Soc Trans,1990,18(1):231～234Study of R enaturation of R ecombinant H uman Ciliary N eurotrophic F actor Expressed in E.coli. XIAN Hai2Qing,FAN Ming,WU Yan(Instit ute of B asic Medical Science,A cademy of M ilitary Medical Sciences,Beiji ng100850,China);Q IU Z ong2Y in(Medical U niversity of Chongqi ng, Chongqi ng400046,China).Abstract　Renaturation of human cilinary neurotrophic factor expressed in recombinant bacteria,by gel filitration chromatograph,was studied.It was showed that the renaturation rate by this way was higher than that by dilution and dialy2 sis,and the protein was purified at the same time.It was a simple,rapid,good reproducibility and efficient procedure which can be used to produce ciliary neurotrophic factor in large scale.K ey w ords　recombinant ciliary neurotrophic factor, renaturation,inclusion body高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究3王　勇　钱凯先董　强1)(浙江大学生物科学与技术系,杭州310027)(山东省医学科学院,济南250062)摘要　藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.为了获取高纯度PC,经过反复探索研究建立了Sephadex G2200、DEAE2SephadexA225、HA、Sephadex G2200的分离纯化程序。